Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài lá kim: Pinus dalatensis, Pinus kesiya và Podocarpus neriifolius ở Việt Nam

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ các loài thuộc chi Pinus... Trong khi đó, tính tới thời điểm này 2017 tuy đã có nhiều công trình nghiên cứu nghiên cứu về mặ

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN HOÀNG SA

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI LÁ KIM: PINUS DALATENSIS,

PINUS KESIYA VÀ PODOCARPUS NERIIFOLIUS Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI – 2017

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

…… ….***…………

NGUYỄN HOÀNG SA

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI LÁ KIM: PINUS DALATENSIS,

PINUS KESIYA VÀ PODOCARPUS NERIIFOLIUS Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ

Mã số: 62 44 01 14

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Trịnh Thị Thủy

Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Thanh Tâm

Hà Nội – 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Trịnh Thị Thủy và TS Nguyễn Thanh Tâm Các kết quả thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Toàn bộ trích dẫn trong luận án đều chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận án

Nguyễn Hoàng Sa

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của thầy cô, các nhà khoa học cũng như đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS Trịnh Thị Thủy

và TS Nguyễn Thanh Tâm là những người đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Nghiên cứu hợp chất thiên nhiên, Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công nghệ, lãnh đạo Viện Hóa học, bộ phận đào tạo Phòng Quản lý tổng hợp đã tạo điều kiện

và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khánh Hòa, trưởng Khoa cùng cán bộ của Khoa Tự nhiên và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TSKH Trần Văn Sung đã có những định hướng xây dựng nền móng ban đầu cho tôi trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn !

Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017

Tác giả luận án

Nguyễn Hoàng Sa

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

PHỤ LỤC ix

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về các loài nghiên cứu 3

1.1.1 Thông đà lạt (Pinus dalatensis) 3

1.1.2 Thông ba lá (Pinus kesiya) 3

1.1.3 Thông tre lá dài dài (Podocarpus neriifolius) 4

1.2 Tình hình nghiên cứu về hóa học một số loài thuộc chi Pinus 5

1.2.1 Nghiên cứu về thành phần tinh dầu từ chi Pinus 5

1.2.2 Các hợp chất terpenoid từ chi Pinus 6

1.2.3 Các hợp chất flavonoid từ chi Pinus 14

1.2.4 Các hợp chất lignan từ chi Pinus 17

1.2.5 Các hợp chất khác từ chi Pinus 19

1.3 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của Thông ba lá 20

1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ các loài thuộc chi Pinus 20

1.4.1 Hoạt tính kháng viêm và giảm đau 21

1.4.2 Hoạt tính ức chế các khối u và kháng ung thư 22

1.4.3 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm 24

1.4.4 Hoạt tính chống oxi hóa 26

1.4.5 Hoạt tính kháng virus và một số hoạt tính khác 27

1.5 Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Podocarpus 28

1.6 Tình hình nghiên cứu về hóa học của loài thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius) 39

Chương 2 THỰC NGHIỆM 42

2.1 Thu hái mẫu cây và xác định tên khoa học 42

2.2 Phương pháp xử lý và chiết mẫu 42

2.3 Phương pháp khảo sát, phân tách và tinh chế các hợp chất từ mẫu thực vật 42

2.4 Phương pháp xác định cấu trúc 43

2.5 Phương pháp thử một số hoạt tính sinh học 43

2.6 Hóa chất và thiết bị 46

2.7 Quy trình chiết và thu các chiết xuất từ các loài thực vật nghiên cứu 47

2.8 Phân lập chất từ các chiết xuất 48

2.8.1 Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông đà lạt 48

2.8.2 Phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông đà lạt 49

2.8.3 Phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông đà lạt 49

2.8.4 Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông đà lạt 50

2.8.5 Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông ba lá 51

2.8.6 Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông tre lá dài 52

2.9 Dữ kiện phổ của các chất tách được 60

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 70

3.1 Các chất được phân lập từ Thông đà lạt (Pinus dalatensis) 70

3.1.1 Chất TT1: Caryolane-1β,9β-diol 70

3.1.2 Hỗn hợp TT2 71

3.1.3 Chất TT3: 15-Methoxypinusolidic acid 73

3.1.4 Chất TT4: Lambertianic acid 75

3.1.5 Chất TT5: 8(17), 13-ent-Labdadien-15→16-lactone-19-oic acid 77

3.1.6 Chất TT6: Isopimaric acid 78

3.1.7 Chất TT12: 3β-Hydroxy-14-serraten-21-one 79

3.1.8 Chất TF1: Pinocembrin 81

3.1.9 Chất TF2: Chrysin 82

3.1.10 Chất TF3: Pinostrobin 83

3.1.11 Chất TF4: (+) Catechin 84

3.1.12 Chất TF5: Kaempferol 85

3.1.13 Chất TF7: Kaempferol

3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyrano-side 86

3.1.14 Chất TP1: Dihydropinosylvin 89

3.1.15 Chất TP2: Dihydropinosylvin 5-methyl ether 89

3.1.16 Chất TP3: 3-Hydroxy-5-methoxystilbene 90

3.1.17 Hỗn hợp TP5 90

3.1.18 Chất TP6: Vanillic acid 4-(-β-D-glucopyranoside) 92

3.1.19 Chất TL1: (+) Lariciresinol 94

3.1.20 Chất TL3: Cedrusin-4-O-β-D-glucopyranoside 95

3.1.21 Chất TS1: β-Sitosterol 97

3.1.22 Chất TS2: Daucosterol 98

3.2 Các chất được phân lập từ Thông ba lá (Pinus kesiya) 99

3.2.1 Chất TT11: 7-Oxo-15-hydroxydehydroabietic acid 99

3.2.2 Chất TF6: 3′-O-Methylcatechin 7-O-β-D-glucopyranoside 101

3.2.3 Chất TP4: Resveratrol-3-O-β-D-glucoside 102

3.2.4 Chất TP7: 3,4-Dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-rhamnopyranosyl) -β-D-glucopyranoside 103

3.2.5 Chất TL2: Cedrusin 105

3.3 Các chất được phân lập từ Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius) 105

3.3.1 Chất TT7: Totarol 105

3.3.2 Chất TT8: Totarol-19-carboxylic acid 106

3.3.3 Chất TT9: Inumakiol D 107

3.3.4 Chất TT10: Macrophyllic acid 108

3.4 Hoạt tính sinh học của một số chất sạch 111

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 116

DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 119

TÀI LIỆU THAM KHẢO 120

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Các phương pháp sắc ký

GFC Gel filtration chromatography Sắc ký lọc Gel

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng

COSY

Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chiều

1

H-1H DEPT Distortionless Enhancement by Polarisa-

ESI-MS Electron Spray Ionization Mass

Spec-trometry

Phổ khối ion hóa phun mù điện tử

HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray

Ioniza-tion - Mass Spectrometry

Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân

qua nhiều liên kết

HSQC Heteronuclear Single Quantum

Coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Phổ NOESY

Các dòng tế bào

9-KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô họng ở

người 26-L5 Murine colon carcinoma Ung thư ruột kết ở chuột A-431 Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô ở người A-549 Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi ở người

Bel-7402 Human hepatoma Ung thư gan ở người

DU-145 Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở

người

Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người

HL-60 Human promyelocytic leukemia Ung thư máu cấp tính ở

người HT-1080 Human fibrosarcoma bào ung thư biểu mô liên kết

di căn ở người

KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô ở người L-929 Mouse fibroblast Ung thư biểu mô liên kết sợi

ở chuột LNCaP Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở

người

LU Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi ở người

MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thư vú ở người

NCI-H292 Human lung mucoepidermoid Ung thư biểu mô phổi ở

người OCI-AML Acute Myeloid Leukemia cells Tế bào ung thư bạch cầu

myeloid cấp tính P-388 Lymphocytic leukemia Ung thư máu lympho

(Ung thư bạch cầu) PC-3 Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở

người SK-LU-1 Human Caucasian Lung adenocarcinoma Ung thư phổi ở người

SK-N-SH Human neuroblastoma cell line U nguyên bào thần kinh ở

người SMMC-

7721 Human hepatocarcinoma

Ung thư biểu mô tế bào gan

ở người T-47D Human ductal breast epithelial tumor Ung thư vú ở người

U-397 Human leukemic monocyte lymphoma Ung thư máu ở người

Các viết tắt khác

ED50 Effective Dose Liều tác dụng tối đa trên 50%

đối tượng thử

FIV Feline immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn

dịch ở động vật họ mèo HSV Herpes simplex virus Virus Herpes simplex

HIV Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn

dịch ở người IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% đối

tượng thử

MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MMTV Mouse mammary tumour virus Chủng virus gây ung thư vú

ở chuột

ROS Reactive oxygen species Những phần tử hoạt động

chứa Oxygen

CD3OD Methanol deuteri (d 4)

Retardation factor (retention factor)

DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG

Bảng 1.1 Các khung cơ bản của các terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus 8

Bảng 1.2 Cấu trúc các chất terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus 9

Bảng 1.3 Những khung cơ bản của các flavonoid đã được phân lập từ các loài Pinus 14

Bảng 1.4 Cấu trúc các chất flavonoid đã được phân lập từ một số loài Pinus 16

Bảng 1.5 Cấu trúc các chất lignan đã được phân lập từ một số loài Pinus 18

Bảng 1.6 Cấu trúc một số chất khác đã được phân lập từ một số loài Pinus 19

Bảng 1.7 Cấu trúc các chất được phân lập từ một số loài Podocapus 33

Bảng 1.8 Cấu trúc một số chất đã được phân lập từ loài Thông tre lá dài (Podocapus neriifolius) 40

Bảng 3.1 Số liệu phổ của TT1 và caryolane-1β,9β-diol 70

Bảng 3.2 Số liệu gán phổ 1 HNMR và 13 CNMR của TT2a và TT2b 72

Bảng 3.3 Số liệu phổ của TT3 và 15-methoxypinusolidic acid 74

Bảng 3.4 Số liệu phổ của TT4 và lambertianic acid 76

Bảng 3.5 Số liệu phổ của chất TT5 và 8(17),13-ent-labdadien-15→16-lactone-19-oic acid 78

Bảng 3.6 Số liệu phổ của TT12 so với 429 và 430 81

Bảng 3.7 Số liệu phổ của TF7 và 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside 87

Bảng 3.8 So sánh số liệu phổ của TP6 với chất 431 và vanillic acid 4-(-β-D-glucopyranoside 93

Bảng 3.9 So sánh số liệu phổ của TL3 với chất 218 và 432 97

Bảng 3.10 Số liệu phổ của TT11 và abiesadine R, abiesadine O 100

Bảng 3.11 So sánh số liệu phổ của TP7 với 3,4-dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside 104

Bảng 3.12 So sánh số liệu phổ 13 C-NMR của TT7, TT8 và TT9 108

Bảng 3.13 Số liệu phổ của TT10 so với totarol-19-carboxylic acid (TT8) 111

Bảng 3.14 Kết quả thử in vitro trên các dòng tế bào SK-LU-1, MCF-7 và Hep-G2 của một số chất sạch 112

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình chụp cây Thông đà lạt (1), tiêu bản cành mang lá và quả (2), quả (3) 3

Hình 1.2 Hình chụp quần thể cây (1) rễ (2) và lá (3) của thông ba lá 4

Hình 1.3 Hình chụp mẫu gỗ (1), tiêu bản lá (2) của Thông tre lá dài 4

Hình 2.1 Sơ đồ chung mô tả quá trình chiết và thu được các chiết xuất 47

Hình 2.2 Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông đà lạt 54

Hình 2.3 Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông đà lạt 55

Hình 2.4 Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông đà lạt 56

Hình 2.5 Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông đà lạt 57

Hình 2.6 Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông ba lá 58

Hình 2.7 Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông tre lá dài 59

Hình 3.1 Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT2a và TT2b 73

Hình 3.2 Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT4 76

Hình 3.3 Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT6 79

Hình 3.4 Các tương tác chính trên phổ HMBC của TP6 94

Hình 3.5 Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TL1 95

Hình 3.6 Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT11 100

Hình 3.7 TT10 và các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT10 109

Hình 3.8 Số lượng của các tế bào OCI-AML sau 24 giờ khi thử nghiệm với TT2, TT6, TT10, TF1, TP2 và TL1 113

Hình 3.9 Số lượng của các tế bào OCI-AML chết theo chương trình (apoptosis) sau 24 giờ khi thử nghiệm với TT2, TT6, TT10, TF1, TP2 và TL1 114

Hình 3.10 Số lượng các tế bào OCI-AML trong các pha trong chu trình của tế bào khi được xử lí (A): TT2; (B): TT6 (C): TT10; (D): TF1; (E): TP2 ở các nồng độ khác nhau 115

Phụ lục 32 Các biểu đồ biểu thị kết quả thử hoạt tính chống tăng

sinh trên dòng tế bào OCI-AML của TF3 PL155 Phụ lục 33 Kết quả phân tích protein bằng Western plot của hỗn

vi toàn cầu cùng với sự ô nhiễm ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng và vấn đề thực phẩm bẩn đã và đang gây ra những ảnh hưởng vô cùng tiêu cực đến sức khỏe của con người nói riêng và sự sống của toàn thể sinh vật trên trái đất nói chung Cụ thể là, gần đây nhân loại luôn phải đối mặt với những dịch bệnh nguy hiểm và có khả năng lan rộng thành đại dịch ở quy mô toàn cầu Có thể lấy một số ví dụ điển hình như HIV/AIDS, các loại ung thư, các loại bệnh viêm nhiễm, các loại cúm virus, bệnh do virus Ebola, các biến chứng do nhiễm virus Zika, tim mạch, đái tháo đường, vv Việc tìm ra phương pháp hiệu quả để điều trị các bệnh này là vấn đề vô cùng khó khăn, nó đặt ra nhiều thách thức lớn cho các nhà khoa học Trước thực trạng đó, một trong những con đường hữu hiệu để phát hiện ra các chất có hoạt tính tiềm năng có thể phát triển thành thuốc mới chữa bệnh cho người, vật nuôi và cây trồng là đi từ các hợp chất thiên nhiên Và như thế, người ta có thể sử dụng các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên một cách trực tiếp để làm thuốc, hoặc sử dụng chúng làm chất dẫn đường để nghiên cứu tổng hợp các loại thuốc mới

Việt Nam là nước có khí hậu và địa hình rất đa dạng, gồm có bốn miền khí hậu chủ yếu: khí hậu phía Bắc, phía Nam, Trung và nam Trung bộ, khí hậu Biển Đông Việt nam với trên 3000 km bờ biển và 4/5 diện tích là đồi núi Những đặc điểm về điều kiện tự nhiên

và khí hậu như trên đã tạo ra thảm thực vật có đa dạng sinh học cao Theo những nghiên cứu mới đây ở Việt Nam có hơn 11.000 loài thực vật bậc cao có mạch, 800 loài rêu, 600 loài nấm, hơn 2000 loài tảo, 537 loài vi tảo, 667 loài rong biển và 15 loài cỏ biển, trong đó nhiều loài được dùng làm thuốc [1]

Trong thảm thực vật phong phú và đa dạng ấy, các loài cây lá kim là những cây rừng quan trọng cả về sinh thái, kinh tế, thương mại và văn hóa Ngoài nguồn cung cấp gỗ, tinh dầu thông còn là nguyên liệu chính trong nhiều ngành công nghiệp (công nghiệp sơn, công

nghiệp chất béo, vv ), một số loài Thông còn được dùng là vị thuốc dân tộc Thông còn là môi trường của nhiều loài nấm nội kí sinh, Taxol® (paclitaxel) là thuốc chống ung thư được cho là tốt nhất hiện nay được phát hiện từ loài thông đỏ ở châu Âu

Cũng như các chi khác trong bộ Thông (Pinales), nhiều loài trong chi Pinus L (Pinaceae) và chi Podocarpus L'Hér ex Pers (Podocarpaceae) từ lâu đã gắn bó với đời

sống hằng ngày của người dân và cũng được sử dụng trong y học cổ truyền để trị nhiều loại bệnh khác nhau Trong khi đó, tính tới thời điểm này (2017) tuy đã có nhiều công trình nghiên cứu nghiên cứu về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học của trên một trăm loài

Pinus và khoảng tám mươi loài Podocarpus nhưng vẫn còn có nhiều loài trong hai chi này

hầu như chưa được nghiên cứu hoặc mới chỉ có những nghiên cứu bước đầu Trong đó, loài

Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré) là một loài gần như đặc hữu của Việt Nam và chưa được nghiên cứu về mặt hóa học; Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon) và loài Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius D Don) trên thế giới mới chỉ có một vài nghiên

cứu nên việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài này là rất cần thiết, nhằm góp phần tạo cơ sở để hướng đến nghiên cứu khai thác và sử dụng sau này

Chính vì lý do trên, mục tiêu của các nghiên cứu trong luận án này là:

1 Nghiên cứu thành phần hóa học của ba loài lá kim: Thông đà lạt (P dalatensis), Thông ba lá (P kesiya) và Thông tre lá dài (P neriifolius)

2 Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các chất sạch tách ra từ các loài trên để tìm kiếm các hoạt chất tiềm năng có thể ứng dụng vào cuộc sống

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về các loài nghiên cứu

1.1.1 Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré)

Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré), tên đồng nghĩa: Pinus wallichiana A.B Jacks

[2] thuộc họ Thông (Pinaceae) Đây là một loài thông năm lá gần đặc hữu của Việt Nam, cây phân bố chủ yếu ở Đà Lạt và một số vùng lân cận, ngoài ra một số ít được tìm thấy ở Quảng Nam, Quảng Bình và biên giới Việt-Lào Cây mọc trong rừng rậm, trên núi trung

bình, ở độ cao 1500-2000 m Cây gỗ to, cao đến hơn 30 m và đường kính thân 0.6-0.8 m

[2] Gỗ không bị mối mọt, được sử dụng trong xây dựng, làm đồ gỗ gia dụng và mỹ nghệ Đến nay, chưa có công bố nào ở Việt Nam cũng như trên thế giới về thành phần hóa ho ̣c

và hoa ̣t tính sinh học của loài này

Hình 1.1 Hình chụp cây Thông đà lạt (1), tiêu bản cành mang lá và quả (2), quả (3)

(Tiêu bản số VNMN.B000005006 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST)

1.1.2 Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon)

Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon; tên đồng nghĩa: Pinus langbianensis A Chev., Pinus insularis var khasyana (Griff.) Silba, Pinus yunnanensis Franch.) là một loài

lá kim thuộc họ Thông (Pinaceae) Trên thế giới, cây phân bố ở Ấn Độ, Myanmar, Thái Lan, Lào, Việt Nam và Philippines Ở Việt Nam, thông ba lá lần đầu được phát hiện ở cao nguyên Langbiang, đó là loài có diện tích lớn nhất trong số các loài thông ở Việt Nam, phân

bố ở Hà Giang, Sơn La, Gia Lai, Kon Tum, nhưng nhiều nhất (90% diện tích) là trên cao

nguyên Langbiang Lá cây hình kim, thường đính ba lá kim trên một đầu cành ngắn, thường

có màu xanh ngọc, mỗi lá kim thường dài 20-25 cm Đầu cành ngắn đính lá thường có độ dài 1.5 cm, đính cách vòng xoắn ốc trên cành lớn [3] Cây thường được trồng để lấy gỗ phục vụ cho công nghiệp giấy, ngành xây dựng và mỹ nghệ Đến nay, chỉ mới có vài công

bố về thành phần hóa học và hoạt tính của tinh dầu từ loài này Gần đây (năm 2013 và 2014), có một vài công bố nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa ho ̣c của loài này ở Trung Quốc [4, 5]

Hình 1.2 Hình chụp quần thể cây (1) rễ (2) và lá (3) của thông ba lá

(Tiêu bản số VNMN.B000005007 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST)

1.1.3 Thông tre lá dài da ̀i (Podocarpus neriifolius D Don)

Hình 1.3 Hình chụp mẫu gỗ (1), tiêu bản lá (2) của Thông tre lá dài

(Tiêu bản số VNMN.B0000050013 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST)

Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius D Don) là một loài thực vật họ Thông tre

(Podocarpaceae) Ở Việt Nam, cây mọc rải rác trong rừng nguyên sinh các tỉnh Kon Tum, Gia Lai, ĐakLak, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Đồng Nai, Kiên Giang,

Nghệ An, Hà Tĩnh, Yên Bái, Tuyên Quang và mọc ở độ cao 2300 m ở Vườn quốc gia Bì Đúp - Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng Cây gỗ cao 20–25 m, đường kính có thể tới 50 cm,

thân thẳng, tròn Vỏ xám nâu, mỏng, nhẵn Cành lá mọc vòng, màu xanh non hoặc xanh

vàng Lá mọc cách, hình mác dài, đầu nhọn dần, dài 7–15 cm, rộng 0.9–1.9 cm, đầu và đuôi

nhọn, đầu mặt trên xanh bóng, mặt dưới xanh vàng Gân chính nổi ở giữa rõ cả 2 mặt, mép

lá cong xuống phía dưới Cuống lá dài 0.3–0.5 cm, phía dưới có rãnh Nón đực dạng bông

không cuống, thường 3 bông mọc chụm ở nách lá gần đầu cành, khi non hình trứng, khi già

hình trụ dài 2–5 cm Nón cái mọc lẻ ở nách lá, chỉ có một lá noãn phát triển mang một noãn, các lá noãn khác hợp thành đế Nón hình trứng dài 1.2–1.6 cm, đường kính 0.8–12 cm, đế mập to gần bằng nón, có cuống dài 0.5-1 cm Có 2 lá bắc sớm rụng, dài 1,5 cm, rộng 1 cm Hạt hình trứng, dài 1,2–1.6 cm, rộng 1.1 cm, dưới có đế mập, đường kính gần bằng đường

kính hạt, quả màu tím [6]

1.2 Tình hình nghiên cứu về hóa học một số loài thuộc chi Pinus

Về thành phần hóa học thì hầu hết các loài lá kim đều có chứa tinh dầu Bên cạnh

đó, theo thống kê trên thế giới đến nay đã có trên 450 hợp chất được phân lập từ trên một

trăm loài thuộc chi Pinus, bao gồm các hợp chất carbohydrate, cyclitol, acid béo, terpenoid,

phổ biến nhất là diterpene có khung carbon rất đa dạng như: cembrane pimarane, labdane

và abietane; triterpene khung seratane và lanostane, lignan, steroid, các phenol, flavonoid

và flavonoid glycoside [7]

1.2.1 Nghiên cứu về thành phần tinh dầu từ chi Pinus

Hầu hết các loài trong chi Pinus đều có tinh dầu, có rất nhiều nghiên cứu trong vòng

40 năm trở lại đây chỉ ra rằng thành phần chính của có trong dầu thông của nhiều loài thuộc

chi Pinus có chứa chủ yếu là các hợp chất terpenoid như: sesquiterpenoid và noid; trong đó thường hay gặp với hàm lượng cao là các chất α-pinene (1) và β-pinene (2) ,

monoterpe-camphene (3), α-myrcene (4), β-myrcene (5) α-terpineol (6), limonene (7) và α-terpinene

(8) [8, 9, 10, 11, 12]; các sesquiterpenoid thường thấy nhất là longifolene (9), phyllene (10) và germacrene D (11) [10, 11] Ngoài ra, theo một nghiên cứu gần đây vào

caryo-2014 về thành phần tinh dầu của loài P nigra, người ta đã nhận thấy sự có mặt lượng lớn

các nhóm chất oxygen–diterpene và sesquiterpene [13] Trong một công bố vào năm 2015

của Zhouqi Li và các cộng sự, ngoài α-pinene (1) còn tìm thấy thêm hàm lượng

β-caryophellen (12) tương đối cao trong tinh dầu ở sáu loài thuộc chi Pinus bản địa ở Trung

Quốc [14]

1.2.2 Các hợp chất terpenoid từ chi Pinus

Các triterpenoid được tìm thấy trong chi Pinus chủ yếu có khung seratane và

lanostane Trong một công bố vào năm 1991, từ vỏ loài thông trắng Trung Quốc P

loài thông trắng miền Tây ở Bắc Mỹ là P monticola, và loài thông Luchu P luchuensis đã

tách được tám triterpenoid khung seratane (23-30) trong các công bố vào năm 1984, 1975

và 2001 [16, 17, 18] Ngoài ra, các seratane triterpenoid kể trên cũng được tìm thấy từ các

loài P massoniana, P taiwanensis, P monticola và P strobus [12] Các lanostane

triterpenoid được tìm thấy chủ yếu từ loài P monticola và P luchuensis Cụ thể là, năm

1981, mười chất (31-40) đã được phân lập từ loài P monticola [19]; năm 2000, có bốn chất mới (41-44) được xác định từ loài P luchuensis [20]; năm 2010, hợp chất mới pinusyunnanol (45) được phân lập từ loài P yunnanensis phân bố ở vùng Vân Nam, Trung

Quốc [21] Ngoài ra trước đó, trong một công bố khác, các chất

(24S)-3β-methoxy-5α-lanost-9(11)-ene-24,25-diol (31), (32) và (5α,24S)-3-oxolanost-9(11)-ene-24,25-diol (46),

(3α,5α,24S)-lanost-9(11)-ene-3,24,25-triol (47) đã được tách ra từ loài P luchuensis [18]

Có thể nói diterpenoid là nhóm chất chính có trong chi Pinus Cho đến nay, các

diterpenoid chủ yếu được tách ra từ các loài thuộc chi này có thể chia thành ba nhóm với đặc trưng cấu trúc chứa các bộ khung pimarane, abietane và labdane Các chất 48-58 thuộc

nhóm có khung pimarane thường hay gặp ở loài P massoniana và P armandii Cụ thể là

sandaracopimaric acid (49), 2β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-oic acid (53), pimaric acid (54), pimara-8(14),15-dien-18-al (55), 3β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-ol (56) và

từ loài P armandii đã tách được isopimaric acid (48), isodextropimaric acid (51) cùng với

49 và 54 [12, 24] Các chất isopimarol (50) và pimarol (52) có trong loài P kesiya còn

manoyl oxide acid (58) đã được tìm thấy trong các loài P sylvestris, P nigra và P pumila

[12]

Cho đến nay, trong các loài Pinus thì các chất thuộc nhóm abietane (59-118) được

tìm thấy với số lượng nhiều nhất so với các diterpenoid còn lại Từ loài P massoniana đã

tách được hai mươi ba chất abietane diterpenoid đó là levopimaric acid (60), palustric acid

(61), neoabietic acid (62), abietic acid (63), dehydroabietic acid (66), 7-oxodehydroabietic acid (67), 7α- hydroxydehydroabietan-18-oic acid (68), 7β- hydroxydehydroabietan-18-

oic acid (69), abieta-6,8,11,13-tetraene-15,19-diol (70), 2β-hydroxydehydroabietic acid

(72), 15-hydroxydehydroabietic acid (73), 7β-hydroxydehydroabiet-15-enoic acid (76),

13β-ethoxy-7-oxoabiet-8(14)-en-18-oic acid (90), podocarp-8(14)-ene-7,13-dion-18-oic acid (92), 12α-hydroxydehyroabietic acid (98), abieta-7,13,15-trien-18-oic acid (99), 15-hydroxy-12-oxoabietic acid (100), 12β-methoxyabietic acid (103), 13-hydroxypodocarpa-8,11,13-trien-18-oic acid (113), 12-hydroxypodocarpa-8,11,13-trien-18-oic acid (114), 7β-

hydroxy-13-oxopodocarp-8(14)-en-18-oic acid (115),

7α-hydroxy-13-oxopodocarp-8(14)-en-15-oic acid (116) và 13-oxopodocarp-8(14)-en-18-oic acid (117) trong các công bố vào

năm 1993 và 2010 [12, 22, 23] Trong các năm 2010 và 2011, từ loài P yunnanensis các

nhà khoa học đã phân lập được dehydroabietane (64), 66, diol (71), 73, abiesadine N (75), 15-hydroxy-7-oxodehydroabietic acid (79), 15,18-dihydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (80), 4,15-dihydroxy-18-norabieta-8,11,13-trien-7-one (81), 18-hydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (82), 4-hydroxy-19-norabieta-8,11,13-trien-7-one (83), abieta-8,11,13-triene-7a ,15,18-triol (84), methyl 7α ,15-dihydroxydehydroabietate (85), 7α,15-dihydroxypodocarp-8(14)-en-13-one (86), 12α,13β-

abieta-6,8,11,13-tetraene-15,18-dihydroxy-7-oxoabiet-8(14)-en-18-oic acid (87), daturabietatriene (93), 8,11,13-triene-4,15-diol (94), abiesadine I (95), dehydroabietinol (96), 18-norabieta-8,11,13-trien-4-ol (97), 12α -methoxyabietic acid (102), pinyunin A (104), pinyunin B

18-norabieta-(105), 113 và 117 [25, 26] Ngoài ra, các hợp chất abietane diterpenoid cũng đã được tìm

thấy từ các loài P koraiensis, P pumila, P densiflora, P strobus, P taeda, P kesiya, P

armandii, P sylvestris, P luchuensis, P sibirica và P banksiana trong các công bố khoa

học từ năm 1970-2010 [12]

Bảng 1.1 Các khung cơ bản của các terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus

labdane

Các hợp chất labdane diterpenoid (119-159) cũng thường có mặt trong thành phần

hóa học của nhiều loài Pinus Năm 1985, từ loài Thông đen P nigra, Duane và cộng sự đã

tách được: chất 120, labda-13(16),14-dien-8-ol (132), pinifolic acid (133), epiimbricataloic acid (134), dimethyl pinifolate (147), methyl 15-methyl-15-oxolabd-8(17)-en-18-oate (148), 4-Epiimbricataloate (149) và 19-hydroxy-15,16-dinorlabd-8(17)-en-13-one (150) [27] Năm 2002, các chất (E)-communic acid (119), (E)-15-norlabda-

4-8(17),12-diene-13,19-dioic acid (125), (E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-19-oic acid

(126) và 19-hydroxy-15,16-dinorlabd-8(17)-en-13-one (150) đã được tách ra từ loài P

Quốc đã phân lập được tám labdane, đó là (+)-isocupressic acid (140), demethyl pinusolide

(145), 16-hydroxy-14-oxo-15-norlabd-8-en-19-oic acid (152), pinusolide (153), hydroxylabda-8(17),13-diene-15,19-dioic acid butenolide (154), lambertianic acid (155), labda-8(17),13-dien-16,14-olid-18-oic acid (156) và 15-hydroxylabda-8(17),13-dien-16,14-olid-18-oic acid (157) [24, 29] Năm 2008, từ loài P densiflora các nhà khoa học

16-Hàn Quốc đã tách ra được hai labdane là 4-epicommunic acid (120)và

(E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-18-oic acid (127) [30] Năm 2010, từ loài P massoniana đã tách

được elliotinol (121), (E)-19-acetoxylabda-8(14),12,15-triene (122), 13-epimanool (128)

và 8,14-dioxo-8,14-secoabiet-13(15)-en-18-oic acid (138) [23] Trong các năm 2006, 2008

và 2010, từ loài P sylvestris các nhà khoa học đã tách được chất 133, 134,

15-acetoxylabd-8(17)-en-18-oic acid (135), 15-ethyl 18-methyl pinifolate (136), 15-oic acid (137), 15-norpinifolic acid (139), (13E)-18-hydroxylabda-8(17),13-dien-15-yl

18-acetoxylabd-8(17)-en-acetate (142), (13E)-18-acetoxylabda-8(17),13-dien-15-oic acid (143),

(13E)-3β-hydroxylabda-8(17),13-dien-15-oic acid (144) và monomethyl pinifolate (146)[12, 31, 32]

Ngoài ra, các hợp chất diterpenoid khung labdane cũng đã được tìm thấy ở các loài

(14S)-14,17-cyclolabda-8(17),12-dien-18-oic acid (160) là một là một chất tương đối khác

lạ với cấu trúc vòng C có bảy cạnh, đã được phân lập từ vỏ của loài P strobus [33] Chất isocembrol (161) và 18-norcembra-2,7,11-trien-4-one (162) là các macrocyclic diterpene

có trong dầu-nhựa của loài P koraiensis [12, 34]

Năm 2009, từ phần ethyl acetate của chiết xuất methanol lá loài P densiflora đã tách được một diterpenoid glucoside mới là 9α,13α-epoxy-8β,14β-dihydroxy-abietic acid-18-O-

được tìm thấy trong chi này đó là bornyl 6-O-α-L-arabinofuranosyl

(1→6)-β-D-glucopyranoside (164) và bornyl 6-O-β-D-apiofuranosyl (1→6)-β-D-glucopyranoside

(165)[35]

Bảng 1.2 Cấu trúc các chất terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus

1.2.3 Các hợp chất flavonoid từ chi Pinus

Flavonoid cũng là một lớp chất tương đối phổ biến có trong các loài họ Thông nói

chung và trong chi Pinus nói riêng Chiếm đa số trong các chất 166-212 đã được tìm thấy

từ các loài Pinus thì chủ yếu là dạng cấu trúc flavone, flavonol, flavanone, flavanonol và

một số ít chất khác có cấu trúc flavan-3-ol

Bảng 1.3 Những khung cơ bản của các flavonoid đã được phân lập từ các loài Pinus

flavan-3-ol

Vào năm 1987, từ loài Thông trắng P morrisonicola Đài Loan, Y.S Cheng và các

cộng sự đã phân lập được chrysin (166), tectochrysin (167), apigenin (168), pinocembrin

(169), pinostrobin (170), pinobanksin (171), pinobanksin 3-acetate (172), strobochrysin (173), cryptochrysin (174), genkwanin (175), izalpinin (176), galangin (177), poriol (178), 3-acetoxy-5,7-dihydroxy-6-methylflavanone (179) và 3,5,7-Trihydroxy-6-methyl-fla-vanone (180) [36]

Từ loài Thông trắng P armandii Trung Quốc, đã phân lập được các flavonoid

166-172, catechin ( 190) và naringenin 4′,7-dimethyl ether (203) trong các công bố vào năm

1988 và 1991 [12, 29, 37]

Năm 1996, các nhà khoa học Thụy Điển đã phân lập được chất 190, catechin

3-β-D-glucopyranoside (191), 3′-O-methylcatechin (192), (2R,3R)-dihydroquercetin (193),

(2R,3R)-dihydroquercetin 3′-O-β-D-glucopyranoside (194), (2R,3R)-dihydroquercetin 7- O-β-D-glucopyranoside (195), kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranoside (202), proanthocy-anidin B1-B3 (208-210) và epicatechin-(4β→ 8)-epicatechin-(4β→ 8)-catechin từ loài

Thông Scotland P sylvestris [38] Trong số đó các chất 209-211 là biflavone và duy nhất một triflavone là 212 Ngoài ra, cũng trong năm này các flavonoid là 6-methyltectochrysin (196), 6-methylpinostrobin (198) và 6-methylchrysin (199) cũng đã được phân lập từ loài

kaempferol 3-O-β-D-(6-O-acetylgalactopyranoside) (182), quercetin

3-O-β-D-glucopyra-noside (197), 6-methylkaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (200) và kaempferol

3-O-β-D-glucopyranoside (201) [35, 42]

Khi nghiên cứu về loài thông lá dẹt P krempfii Việt Nam, H Erdtman đã phân lập

được bốn flavonoid từ thân gỗ đó là: chrysin (166), strobopinin (204), cryptostrobin (205), demethoxymatteucinol (206) Trong đó, các hợp chất C-methyl flavanoid như 205, 206 và

207 là các hợp chất có cấu trúc rất thú vị [43] Vào năm 2013, nhóm các nhà khoa học Việt

Nam khi nghiên cứu về hóa học rễ loài P krempfii đã phân lập và xác định cấu trúc được

sáu flavononoid đó là tectochrysin (167), pinostrobin (170), pinobanksin (171), galangin

(177) , 205 và 206 Sàng lọc về hoạt tính sinh học bước đầu cho thấy các chất 171, 177, 206

có hoạt tính tương đối tốt với các dòng tế bào KB, Hep-G2, LU, MCF-7 [44]

Bảng 1.4 Cấu trúc các chất flavonoid đã được phân lập từ một số loài Pinus

1.2.4 Các hợp chất lignan từ chi Pinus

Các hợp chất lignan cũng thường được tách ra từ các loài Pinus Trong đó có, hai

benzodioxane là massonianoside E (212) được phân lập từ loài P massoniana [12] và

cupressoside A (213) được phân lập từ loài P densiflora [42] Mười một benzofuran

neolignan (214-224) đã được phân lập từ các loài P armandii, P massoniana, P koraiensis

và P densiflora [12, 45] Ba lignanolide chứa vòng γ-lactone được xem là các dibenzylbutyrolactone (225-227) đã được phân lập từ các loài P armandii, P massoniana

và P koraiensis [12] Bảy tetrahydrofuran (228-234) đã được phân lập từ các loài P

phân lập từ các loài P massoniana, P yunnanensis, P koraiensis và P sylvestris [12] Một

diepoxylignan là pinoresinol (238); ba arylnaphthalene (244-246) và một dibenzocyclooctene là schizandrin (247) được phân lập từ các loài P armandii, P

Bảng 1.5 Cấu trúc các chất lignan đã được phân lập từ một số loài Pinus

1.2.5 Các hợp chất khác từ chi Pinus

Có hai mươi bảy dẫn xuất của phenol và anisole (249-285) được phân lập và xác

định cấu trúc từ các loài thuộc chi Pinus như P massoniana, P strobus, P taeda, P

armandii, P sylvestris, P densiflora, P koraiensis và P kesiya Ngoài ra còn có một số

loại chất khác như coumarin (286), các acid béo (287-291), các steroid (292-293) và (-) shikimic acid (294) [12, 5, 45]

Bảng 1.6 Cấu trúc một số chất khác đã được phân lập từ một số loài Pinus

1.3 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Thông ba lá

Năm 2013, từ quả của loài Thông ba lá, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập

được bốn hợp chất lignan đó là cedrusin (214), matairesinol (225), pinoresinol (238) và dihydrodehydrodiconiferyl alcohol (248), cùng với một flavonoid là 4′,5,7-

trihydroxyflavanonol-3′-O-β-D-glucopyranoside (207) và một phenol là

3,4-dihydroxybenzoic acid (271) [4] Tiếp sau đó vào năm 2014, cũng từ quả của loài này đã tách thêm được ba diterpenoid là 15-hydroxydehydroabietic acid (73), imbricatolic acid (158), junicedric acid (159) cùng với hai sterol là 292 và 293 [5]

1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ các loài thuộc

chi Pinus

Diterpenoid là nhóm chất chủ yếu có trong các loài thuộc chi Thông (Pinus), tiếp

đến là các hợp chất flavonoid, lignan và phenol cũng tương đối phổ biến Trong chi này, các thành phần dầu dễ bay hơi và các phần rất phân cực như dịch chiết cồn, dịch nước chứa nhiều polyphenol và polysaccharide thể hiện nhiều hoạt tính mạnh mẽ nhất như chống oxi hóa, kháng viêm, kháng nấm, kháng khuẩn, chống ung thư, kháng HIV, vv… nhiều chất sạch đã được sàng lọc hoạt tính và một số đã cho thấy được chúng là những hoạt chất tiềm năng Những nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính có thể mở ra cơ hội sử dụng các thành phần

có hoạt tính từ các loài thuộc chi này để làm thuốc trị bệnh trên người, động vật và cả thực vật Sau đây là một số thống kê đáng chú ý

1.4.1 Hoạt tính kháng viêm và giảm đau

Dịch chiết H2O từ lá của loài P massoniana cho thấy khả năng làm tăng đáng kể ngưỡng chịu đau và giảm số lượng chuột bị cơn đau quằng quại ở mô hình gây phù tai chuột vào năm 1999 [12] Khi cho chuột thử nghiệm uống hoặc tiêm qua màng bụng thì các nhà

khoa học thấy rằng tinh dầu của loài P pumila có khả năng ức chế hệ thống thần kinh trung

ương và liều gây chết 50% đối tượng thử LD50 = 0,577 ± 0,056 mL/kg [12] Chiết xuất H2O

từ lá của loài P armandii cũng biểu hiện tỉ lệ ức chế 50.8% tại liều lượng thử 100m g/kg ở

mô hình gây phù nề cấp tính cho tai chuột bằng dầu [12]

Vào năm 2007, ở phép thử nghiệm in vivo trên mô hình gây quặn đau bằng acetic

acid, mô hình gây đau bằng formalin và mô hình gây đau bằng đĩa nóng tại liều lượng thử tại liều lượng thử 100 mg/kg và 200 mg/kg; kết quả là chiết xuất ethanol từ phấn hoa loài

P densiflora đã tạo ra ức chế đáng kể (thể hiện qua thông số tỉ lệ giảm các cơn đau) ở cả

ba mô hình trên khi so sánh với chất đối chiếu là aminopyrine Thêm vào đó, khả năng kháng viêm của chiết xuất ethanol này cũng được thể hiện qua những thử nghiệm ở chuột trên các mô hình gây phù nề chân bằng carrageenan, bằng formalin và gây phù nề tai bằng arachidonic acid so sánh với chất đối chiếu là indomethacin [46]

Năm 2012, khi nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm và giảm đau của các chất có

trong loài P roxburghii, các nhà khoa học Ấn Độ đã thấy rằng chiết xuất ethanol phần lá

của loài này thể hiện hoạt tính ức chế đáng kể phù nề chân chuột trên mô hình gây phù bằng carrageenan, tại liều lượng thử 100 mg/kg, 300 mg/kg và 500 mg/kg trọng lượng chuột

được thử nghiệm khi so sánh với tác nhân đối chiếu là indomethacin; hoạt tính kháng viêm của chiết xuất ethanol còn được thể hiện ở khả năng ức chế các u hạt cấy dưới da chuột (mô

hình “cotton pellet granuloma”) khi so sánh với tác nhân đối chiếu là diclofenac sodium

Về hoạt tính giảm đau, cao chiết này cũng thể hiện được hiệu quả đáng kể qua hai mô hình

thử nghiệm là mô hình gây đau bằng cách tiêm acetic acid (Acetic Acid Induced Writhing

Test) và mô hình giảm đau trung ương theo phương pháp nhúng đuôi chuột (Tail Immersion

của tinh dầu một số loài thuộc chi này như P brutia Ten., P halepensis Mill., P nigra Arn., P pinea L và P sylvestris L [48]

Các diterpenoid pinyunin A (104), pinyunin B (105) và hợp chất lignan mới là [2,3-dihydroxy-5-(3-hydroxypropyl)phenyl]-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propane-1,3-diol (237) thể hiện hoạt tính kháng viêm thông qua khả năng ức chế COX-2 với tỉ lệ ức

2-chế là 84.83, 83.71 và 88.25% tương ứng trong các phép thử nghiệm in vitro [25, 49] Các

flavonol kaempferol 3-O-𝛽-D-(6-O-acetylgalactopyranoside) (182) và tectochrysin (196) có hoạt tính ức chế đáng kể NO với nồng độ ức chế 50% đối tượng thử IC50 lần lượt là 26,8 và 27,1 μg/mL, và còn ức chế ở mức độ vừa phải prostaglandin E2 (PGE2) khi IC50 là 56,2 và 24,8 μg/mL tương ứng [12]

6-methyl-1.4.2 Hoạt tính ức chế các khối u và kháng ung thư

Hoạt tính này được thể hiện nhiều ở phần cao chiết và tinh dầu, một số chất sạch được tách ra cũng thể hiện được khả năng kháng ung thư đáng quan tâm Từ những năm

1987, các nhà khoa học Nhật Bản đã thấy rằng, chiết xuất nước nóng từ quả của loài P

parviflora (PCE) có tác dụng ức chế các khối u gây bụng báng (u cổ trướng-ascites tumor cells) trên chuột Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các polysaccharide có tính acid trong chiết

xuất từ dịch chiết dung dịch NaOH có hoạt tính mạnh nhất [50] Sau đó, vào năm 1992, Nagasawa và các cộng sự cũng đã công bố rằng, khi các con chuột đang cho con bú được tiêm tĩnh mạch hoặc uống PCE cùng với dehydrogenation polymer của ferulic acid (DHP-FA) thì thấy có tác dụng ngăn chặn đáng kể sự phát triển của chủng virus gây ung thư vú (mouse mammary tumour virus-MMTV) [51]

Năm 2006, các chiết xuất từ vỏ của loài P maritima đã chứng tỏ khả năng ngăn ngừa

ung thư da trên chuột khi được thử nghiệm trên hai mô hình gây ung thư da bằng bức xạ cực tím (UVR) và mô hình UVR kết hợp với 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)

[52]; chiết xuất từ vỏ của loài này cũng được chứng minh có nhiều hoạt tính tốt như tiêu diệt các tế bào ung thư, chống oxi hóa, bảo vệ tim mạch, trị tiểu đường, và đã được đưa

ra thị trường với tên thương phẩm là Pycnogenol® Trong một công bố vào năm 2007, các nhà khoa học Trung Quốc đã chỉ ra rằng, các procyanidin có trong các chiết xuất từ vỏ của

loài P koraiensis thể hiện tác dụng ức chế sự tăng sinh trưởng cũng như sự biểu hiện của kháng nguyên liên quan đến sự tăng sinh tế bào (proliferating cell nuclear antigen-PCNA)

và cả yếu tố hoại tử u α (TNF-α) ở ung thư cổ tử cung trên chuột [53] Năm 2009, các nhà

khoa học đã thấy rằng, các chiết xuất từ vỏ của loài P pinea và P sylvestris thể hiện hoạt

tính gây độc tế bào mạnh mẽ kháng lại các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt (PC-3,

DU-145, LNCaP) và ung thư tuyến vú (MCF-7) [54] Vào năm 2010, một nghiên cứu khoa học

đã chỉ ra rằng, dịch chiết từ vỏ của loài P massoniana không chỉ có tác dụng kích hoạt các caspase để cảm ứng và kích hoạt quá trình chết tự nhiên (apoptosis) ở các tế bào ung thư gan ở người (Hep-G2) trong thử nghiệm in vitro mà còn ức chế sự tăng trưởng của các khối

u được cấy ghép trên cơ thể chuột qua các phép thử in vivo [55] Sau đó, vào năm 2012, khi

nghiên cứu về hoạt tính kháng ung thư của tinh dầu từ lá của loài P densiflora, các nhà

khoa học Hàn Quốc đã thấy rằng tinh dầu này cũng có khả năng cảm ứng và kích hoạt quá trình chết tự nhiên của các tế bào ung thư miệng ở người (YD-8) qua việc kích hoạt được

các caspase và các phần tử hoạt động chứa oxygen (reactive oxygen species-ROS) [56] Tiếp theo, năm 2013, một công bố khoa học đã cho thấy rằng polysaccharide từ các chiết

xuất ethanol của quả khô loài P koraiensis cho hoạt tính ức chế tế bào ung thư gan ở người

(Hep-G2), trong đó hai chiết xuất sử dụng dịch chiết là dung dịch ethanol 30% và 80% có hoạt tính mạnh nhất [57] Mới đây, năm 2016, W Natthida và các cộng sự đã thấy rằng chiết xuất ethanol-H2O (50:50) của cành nhỏ loài thông ba lá P kesiya khi kết hợp với melphalan theo một tỉ lệ thích hợp cho thấy khả năng gây độc tế bào tốt trên hai dòng tế bào ung thư máu (U-937) và ung thư gan (Hep-G2), quan trọng hơn, sự kết hợp này cũng làm giảm độc tính của melphalan xuống khoảng 4-9 lần [58]

Một số chất sạch được tách ra từ các loài Pinus cũng có những hoạt tính khá thú vị

Cụ thể là, 15-ethyl-18-methyl pinifolate (136) có hoạt tính kháng lại các dòng tế bào ung thư ở người như Hela, u nguyên bào thần kinh (SK-N-SH) và ung thư gan (Bel-7402) tại

các phép thử in vitro [31] Một nghiên cứu vào năm 2001 về hợp chất triterpenoid là (5α, 24S)-3-oxolanost-9(11)-ene-24,25-diol (46) có hoạt tính ức chế nhẹ khả năng xúc tác của enzyme Topoisomerase II với giá trị IC50 là 186 μM [18] Các chất isopimaric acid (48) và dehydroabietic acid (66) có ảnh hưởng ức chế mạnh mẽ các khối u da ở chuột trên mô hình

gây ung thư bằng DMBA và TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13- acetate) [59] Các hợp

chất 3β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-ol (56), elliotinol (121) và

(E)-19-acetoxylabda-8(14),12,15-triene (122) cho thấy khả năng kháng mạnh mẽ lại các tế bào ung thư biểu mô (A-431) và ung thư phổi (A549) với giá trị IC50 tương ứng là 1.60, 0.38, 4.74 μM (với dòng

tế bào A-431) và 16.44, 2.00, 19.62 μM (với dòng tế bào A-549); người ta giải thích rằng

122 thể hiện hoạt tính mạnh mẽ nhất có thể là do ảnh hưởng của khung labdane và nhóm ester -OAc tại vị trí C-19 [23] Chất 15-norpinifolic acid (139) thể hiện hoạt tính kháng ung thư trên hai dòng tế bào ung thư ác tính ở người-Hela và dòng tế bào ung thư biểu mô liên kết sợi ở chuột (L-929); hoạt tính của chất này có được có thể là do đặc thù cấu trúc khung labdane kết hợp với vị trí C-15 kém phân cực của phân tử này [32] Gần đây, vào năm 2014,

các nhà khoa học đã thấy rằng, α-terpineol (6)-một monoterpenoid có trong tinh dầu nhiều

loài Pinus, có thể kháng lại hai dòng tế bào ung thư Hela và ung thư vú (T-47D) Ngoài ra,

6 còn có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) theo cơ chế kích hoạt lại quá

trình chết tự nhiên (apoptosis) của dòng tế bào này bằng cách làm suy giảm số lượng gene

Bcl-2 (một loại gene ức chế chết tế bào theo chương trình) và tăng số lượng biểu hiện của các gene Bax [60]

1.4.3 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Từ những năm 1994, khả năng kháng vi sinh vật của lá các loài Pinus đã được kiểm

chứng qua các thử nghiệm; người ta thấy rằng chúng có hiệu quả trong việc chống lại sự phát triển theo quá trình amôn hóa của các vi sinh vật gây thối trong thực phẩm [12] Trong những năm về sau đã có thêm nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng

nấm từ các dịch chiết của ở loài Pinus Năm 2006, các nhà khoa học đã thấy rằng dịch chiết

nước và alcohol từ lá, thân, vỏ và quả khô của loài P roxburghii có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh đó là Agrobacterium tumefaciens (gây bệnh khối

u cho thực vật), Escherichia coli (gây bệnh đường ruột trên người), Salmonella arizonae (gây bệnh đường ruột trên người), Salmonella Typhi (gây bệnh đường ruột trên người) và

Staphylococcus aureus (có khả năng gây cách bệnh ngoài da, gây viêm, mủ trên người)

[12] Tinh dầu của các loài P densiflora và P thungergii thể hiện khả năng kháng khuẩn

đối với các dòng Klebsiella pneumoniae (gây ra các bội nhiễm ở đường hô hấp), Shigella

flexneri (bệnh lỵ trực khuẩn), Proteus vulgaris (có thể gây ra các viêm nhiễm) với nồng độ

kiềm khuẩn tối thiểu (MIC) đều nhỏ hơn 0.4 mg/mL [61] Năm 2012, các nhà khoa học Mỹ

và Canada đã nghiên cứu ra rằng, một peptide giàu hàm lượng cysteine tên là PmAMP1

được phân lập từ loài P monticola có khả năng kháng lại các chủng nấm gây bệnh trên loài cải dầu (Brassica napus) [62] Một công bố khoa học vào năm 2013 cho thấy dầu từ nhựa

loài thông Scotland P slyvestris có khả năng kháng lại mười ba chủng vi khuẩn gây bệnh

trên cây trồng với liều lượng tác dụng hiệu quả cao nhất là 300 µg/mL; và kháng lại sáu chủng nấm gây bệnh trên thực vật liều lượng tác dụng hiệu quả cao nhất là 200 µg/mL [63]

Trong một nghiên cứu khác, phần tinh dầu và dịch chiết chloroform của loài P roxburghii

có khả năng ức chế các dòng vi khuẩn thử nghiệm Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh), Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus

đầy hứa hẹn về việc sử dụng nhựa-dầu của loài P elliottii làm thuốc chữa bệnh héo rũ trên hoa màu do vi nấm Sclerotium rolfsii gây ra khi giá trị MIC lên loài này là 1.95 μg/mL Cũng trong nghiên cứu này, nhựa-dầu của loài P tropicalis thể hiện hoạt tính tốt kháng lại dòng nấm Colletotrichum gloeosporioides (gây bệnh thán thư trên cây trồng) và Fusarium

solani (gây bệnh vàng lá, thối rễ) với giá trị MIC tương ứng là 31.25 μg/mL và 62.5 μg/mL,

điều này cũng đã mở ra hy vọng cho việc sử dụng nhựa-dầu loài P tropicalis làm thuốc

sinh học điều trị các bệnh trên cây trồng do một số loài vi nấm gây ra [65] Gần đây, từ hai

loài P brutia và P pinea ở vùng Địa Trung Hải, người ta nhận thấy tinh dầu của chúng

không những có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm mà còn có khả năng diệt trừ sâu bọ rất tốt Phát hiện này mở đường cho khả năng sử dụng làm tác nhân bảo vệ thực vật sinh học

thân thiện với môi trường [9] Bên cạnh đó, tinh dầu của một số loài P halepensis Mill., P

Nhiều chất sạch được tách ra từ các loài Pinus cũng có hoạt tính kháng khuẩn và

kháng nấm hiệu quả Các chất diterpenoid abieta-8,11,13-trien-7-ol (65), dehydroabietic acid (66), 7-oxodehydroabietic acid (67), 15-hydroxydehydroabietic acid (73), 18-hydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (82), dehydroabietinol (96), 18-norabieta-8,11,13-trien-4-ol (97), (E)-communic acid (119) và (E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-18-oic acid

(127) đều có khả năng ngăn ngừa mụn khi chúng có hoạt tính ức chế lại chủng vi khuẩn

cho rằng isopimaric acid (48) tách từ loài P nigra có tác dụng kháng lại các chủng đa kháng thuốc (EMRSA) ở loài Staphylococcus aureus [68] Ngoài ra, đã có những nghiên cứu chỉ

ra rằng, hoạt tính kháng khuẩn ở các diterpenoid khung pimarane có được là do nhóm –COOH ở vị trí C-19 và hoạt tính này sẽ tăng thêm hơn nữa khi nhóm carboxyl được thay thế bằng các nhóm chứa oxymethylene (–CH2OR) [69] Một số hợp chất phenolic như pinobanksin (171), 6-methyltectochrysin (196), (E)-pinosylvin monomethyl ether (249) và pinosylvin (252) có thể kháng lại nấm Cladosporium herbarum (gây bệnh thối rễ ở cây

trồng) Ngoài ra, chất 249 và dihydropinosylvin monomethyl ether (257) còn có tác dụng

ức chế năm chủng loại nấm gây thối rễ khác và còn có khả năng hoạt hóa enzyme lactase [12]

1.4.4 Hoạt tính chống oxi hóa

Có nhiều nghiên cứu bước đầu khẳng định các chiết xuất của nhiều loài Pinus thể

hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt [12] Sau đó, cũng có nhiều nghiên cứu về hoạt tính chống

oxi hóa của các loài từ chi này Các polyphenolic từ chiết xuất của hạt loài P koraiensis

thể hiện tính chống oxi hóa tốt qua các phép thử DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl),

HO. và O2. với giá trị nồng độ 50% tác dụng tối đa EC50 lần lượt là 0,023 ± 0,004 mg/mL, 0,391 ± 0.055 mg/mL và 4,37 ± 0.19 mg/mL tương ứng [70] Năm 2011, Kim Mihyang và các cộng sự, bằng phương pháp gốc tự do DPPH , đã thấy rằng dịch chiết nước nóng của

loài P densiflora thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh mẽ với IC50 = 0,27 mg/mL tương

đương với vitamin C (IC50 = 0,26 mg/mL) Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, dịch chiết này

cũng có tác dụng ngăn chặn mạnh mẽ lên các LOPs (Lipid Oxidation Products – các sản

phẩm oxi hóa lipid bằng gốc tự do peroxide hay superoxide gây tổn thương tế bào) trong gan và hồng cầu của chuột [71] Chiết xuất alcohol của loài P ro xburghii cũng được chứng

minh có hoạt tính chống oxi hóa tốt qua các thử nghiệm theo phương pháp TEAC (xác định hoạt tính chống oxi hóa khi so sánh với khả năng chống oxi hóa của Trolox) [72] Năm

2016, nghiên cứu về chiết xuất methanol của nhựa loài P nigra đã hứa hẹn rằng chúng sẽ

sử dụng như là một chất chống oxi hóa tự nhiên khi nó thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tương đối tốt trên các phép thử nghiệm DPPH, tạo phức chelate với Fe2+, TEAC, dọn hydrogen peroxide (H2O2) và dọn gốc tự do peroxide (O2.–) [73]

Các chất như 6-methylkaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (200) và kaempferol

IC50 tương ứng là 3,86 ± 0,41 μM và 4,02 ± 0,18 μM trong khi giá trị IC50 của chất so sánh L-penicillamine là 3,04 ± 0,74 μM [35]

1.4.5 Hoạt tính kháng virus và một số hoạt tính khác

Các chất isopimaric acid (48), sandaracopimaric acid (49) neoabietic acid (62), dehydroabietic acid (66) và (E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-19-oic acid (126) có ảnh hưởng ức chế mạnh mẽ chủng virus có thể gây ung thư máu, ung thư vòm-mũi họng Epstein-Barr (EBV) [28, 59] Các thử nghiệm dược lý cũng cho thấy rằng abietic acid (63)

có tác dụng chống co thắt [12] Các phức lignin-carbohydrate (Lignin – carbohydrate

complexes: LCC) có trong quả khô và hạt của nhiều loài Pinus như P parviflora, P

densiflora, P thunbergii, P elliottii, P taeda, P caribaea, P sylvestris và P armadii được

cho là có khả năng ức chế sự phát triển của của dòng virus nguy hiểm trên người HSV (Herpes Simplex Virus), đây là loại virus gây mụn mủ, lở loét ở da, niêm mạc phần trên của cơ thể như mắt, mũi, miệng và bộ phận sinh dục [74]

Các hợp chất polysaccharide có tính acid từ loài P parviflora được cho là có khả

năng kháng lại các virus cúm theo cách ức chế, “đầu độc” quá trình tổng hợp protein và enzyme quan trọng trong quá trình tự nhân đôi của DNA (enzyme RNA-dependent RNA polymerase) [75] Năm 1998, Masatoshi Nakano và các cộng sự đã một nghiên cứu cho

thấy rằng chiết xuất kiềm từ vỏ hạt loài P koraiensis có khả năng ức chế virus gây suy