Đánh giá tính đa hình ADN và khả năng chọn dòng tế bào đột biến ở một số giống lúa đặc sản

Lúa là cây lương thực quan trọng thứ ba trên thế giới, 90% diện tích trồng lúa và tiêu thụ chủ yếu ở châu Á . Hiện nay lúa được trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau ở c

MỞ ĐẦU

Lúa là cây lương thực quan trọng thứ ba trên thế giới, 90% diện tích trồnglúa và tiêu thụ chủ yếu ở châu Á Hiện nay lúa được trồng trong những điều kiệnsinh thái và khí hậu rất khác nhau ở cả ba vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đớitrên tất cả các châu lục [8, 12].

Việt Nam là một nước nông nghiệp với truyền thống trồng cây lúa nước vàđược xếp vào hàng những nước xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới Sản lượng gạoxuất khẩu năm 1999 lên tới 4,3 triệu tấn song hiệu quả xuất khẩu và khả năng cạnhtranh trên thị trường quốc tế còn thấp, một trong những nguyên nhân là do chấtlượng gạo chưa đáp ứng được nhu cầu về phẩm chất của thị hiếu người tiêu dùng.Trong khi đó nhiều địa phương của nước ta có những giống lúa rất quý như TámThơm, Tám Ấp Bẹ, Dự Thơm,Tẻ Di Hương hạt trong, cơm dẻo và rất thơm ngon.Đây là những giống có tiềm năng nâng cao giá trị xuất khẩu nhưng năng suất cònthấp vì cây cao, thân mềm chống đổ kém, lá dài, mỏng và rủ, hạt thưa, thời giansinh trưởng kéo dài, phản ứng chặt chẽ với ánh sáng ngày ngắn [4, 11, 12].

Bằng phương pháp chọn dòng tế bào mang biến dị soma Viện Công nghệsinh học đã chọn tạo được ba giống lúa DR1, DR2 và DR3 cho năng suất cao, ổnđịnh và có khả năng chịu hạn, chịu lạnh tốt hơn so với giống gốc X11 và CR203[14] Sử dụng công nghệ tế bào thực vật, công nghệ gen kết hợp với kỹ thuật gâyđột biến bằng tia gamma cho phép cải biến một số đặc điểm nông học còn hạn chếcủa các giống lúa nêu trên theo hướng hạ thấp chiều cao cây, chống đổ và rút ngắnthời gian sinh trưởng Mặt khác để nắm vững đặc điểm của các giống lúa đặc sảntrước hết cần sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để đánh giá sự đa dạng về di truyềncủa nhóm lúa Tám thu thập được ở các địa phương khác nhau.

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài "Đánh giá tính đa hìnhADN và khả năng chọn dòng tế bào đột biến ở một số giống lúa đặc sản" Nhằm

tìm ra mối quan hệ di truyền và đánh giá khả năng tạo mô sẹo, tái sinh cây lúa từmô sẹo xử lý tia gamma để xác định ngưỡng chiếu xạ thích hợp đối với mô sẹo củamột số giống lúa đặc sản góp phần vào việc chọn tạo giống lúa mới.

Chơng 1 Tổng quan tài liệu

1.1 ứng dụng kỹ thuật RAPD - PCR trong nghiên cứu đa hìnhADN

1.1.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)

Phơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Mullis và CS phát minh

năm 1985 Thực chất đây là một phơng pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện

diện của tế bào

Điều kiện của phản ứng PCR: ADN khuôn, 2 đoạn mồi (mỗi mồi dài từ 18 24 nucleotit), Taq polymeraza (là enzym chịu nhiệt), bốn loại deoxyribonucleotittriphosphat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), dung dịch đệm và ion Mg++ [21].

-Trớc đây phản ứng PCR thờng dùng ADN polymeraza I của E.coli và T4ADN polymeraza Các enzym này bị bất hoạt ở nhiệt độ cao nên qua mỗi chu kỳphản ứng phải phổ sung thêm enzym Việc phát hiện ra các loại ADN polymerazabền nhiệt (Vert ADN polymeraza, Pfu ADN polymeraza, Taq ADN polymeraza )đã cho phép quá trình nhân bản đợc thực hiện tự động hoá Ngoài độ bền nhiệt cácenzym này còn khác nhau về khả năng kéo dài chuỗi ADN cần nhân bản Thông

dụng nhất là Taq ADN polymeraza đợc tách từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermusaquaticus, sống ở nguồn nớc nóng 940C- 1000C Enzym này hoạt động tốt nhất ở700C - 800C Trọng lợng phân tử của Taq ADN polymeraza là 94 KD, gen tổng hợpdài 2499 cặp bazơ nitơ, mã hoá cho 832 axit amin [34].

Năm 1988, Saiki đã chỉ ra rằng hoạt tính của Taq polymeraza giảm 50% sau130 phút ở 92,50C; sau 40 phút ở 950C và sau 5-6 phút ở 970C Mặt khác, nồng độion Mg++ và dNTP trong hỗn hợp phản ứng cũng ảnh hởng rất nhiều đến hoạt tínhcủa Taq polymeraza [23, 34].

Đoạn mồi là những đoạn oligonucleotit đợc thiết kế bổ sung với mạch ADNkhuôn Để gắn mồi một cách đặc hiệu, đoạn mồi thờng đợc tổng hợp dài từ 18 - 24nucleotit Phản ứng PCR dùng một cặp mồi gồm một mồi xuôi (forward) và mộtmôi ngợc (reverse), mồi luôn gắn với ADN khuôn theo chiều từ 3’ - 5’ và ADNpolymeraza kéo dài chuỗi tổng hợp về đầu 5’.

Nhìn chung, trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi trong phản ứngPCR là những nhân tố quyết định sự thành công của phản ứng.

Phản ứng PCR là một chuổi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳgồm ba giai đoạn sau:

- Giai đoạn 1: biến tính ADN (denaturing), ở nhiệt độ khoảng từ 940C - 950C,trong thời gian ngắn từ 30 giây - 1 phút, để tách sợi ADN kép thành 2 sợi ADN đơn.

- Giai đoạn 2: giai đoạn gắn mồi (annealing), ở nhiệt độ 400C - 600C, haiđoạn mồi sẽ gắn vào ADN khuôn ở vị trí mã tơng đồng theo nguyên tắc bổ sung ởhai đầu đoạn ADN cần nhân Nhiệt độ của bớc gắn mồi tuỳ thuộc vào loại từng mồi

cụ thể, đợc tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi Vì vậy giaiđoạn này quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR.

Công thức tính nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi:

Tm =81.5 + 16.6 (log10{J+}) + 0.41 (%G + C) - (600/I) - 0.63 (%FA) [23].Trong đó: {J+} : nồng độ của các cation hoá trị I.

FA : chất dùng để gây biến tính ADN I : chiều dài của mồi.

- Giai đoạn 3: giai đoạn kéo dài (extension) ở nhiệt độ 720C, ADN Taqpolymeraza hoạt động tổng hợp, kéo dài các mạch theo nguyên tắc bổ sung từ haiđầu sợi khuôn ban đầu Geifand và White (1990) đã thông báo về tốc độ tổng hợpcủa Taq là: 150 nucleotit/giây ở 750C - 800C; >60 nucleotit/giây ở 700C; 24nucleotit/giây ở 550C; 1,5 nucleotit/giây ở 370C; 0,25 nucleotit/giây ở 220C [23].

Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn nh trên, từ một phân tử ADN khuôn đợcnhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa nhân bản trong mỗi chu kỳ lại làm khuôncho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi Do đósau mỗi chu kỳ tổng hợp đựơc lợng ADN gấp đôi và nh vậy sau n chu kỳ nhân bảnsẽ tạo ra 2n bản ADN khuôn ban đầu [13].

Công thức: Y = x.2n

Trong đó: Y: là tổng số bản sao ADNx: là số khuôn ADN ban đầun: số chu kỳ

PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích bộ genom của động vật vàthực vật vì nó có khả năng tạo ra một lợng lớn trình tự đặc hiệu ứng dụng của PCRvào nhiều mục đích khác nhau, bao gồm xác định trình tự của ADN đợc nhân bản,nhân bản quần thể mARN để làm mẫu lai, xác định trình tự đặc hiệu từ cADN hayth viện gen, xác định sinh vật chuyển gen, phân tích tiến hoá, phân tích sự đa dạngdi truyền ở mức độ ADN trong và giữa các quần thể Hiện nay PCR đợc xem là mộtphơng pháp nhanh và tơng đối đơn giản để đánh giá cây đợc chuyển gen [1, 26].

1.1.2 Kỹ thuật RAPD và ứng dụng

Để thực hiện phản ứng PCR cần phải xác định trình tự nucleotit ở hai đầu củađoạn gen cần nhân bản, để thiết kế đoạn mồi Trớc khi xuất hiện máy đọc trình tựADN tự động thì vấn đề này gây nhiều khó khăn cho công tác nghiên cứu Do đó,các nhà nghiên cứu nhanh chóng ủng hộ kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi có trình tựngẫu nhiên Đợc sử dụng rộng rãi nhất trong các kỹ thuật đó là kỹ thuật RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA = Tính đa hình các đoạn ADN đợc nhân bảnngẫu nhiên) Kỹ thuật này đợc hai nhóm nghiên cứu (Williams và CS, 1990) [37],(Welsh và CS, 1990) [36] đồng thời xây dựng một cách độc lập Nó là một kỹ chophép phát hiện tính đa hình các đoạn ADN đợc nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùngmột mồi đơn chứa một trật tự nucleotit ngẫu nhiên Thờng mồi này chứa từ 9 đến 12

nucleotit tối thiểu là 4 nucleotit Có hàng ngàn loại mồi chứa khoảng 10 nucleotitnhng số lợng mồi đợc dùng trong nghiên cứu là một con số hạn chế Trong phản ứngRAPD, các mồi đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của đoạnADN khuôn Nếu các điểm bắn mồi nằm trong khoảng cách có thể nhân bản đợc(thờng từ 200 đến 2000 nucleotit) thì đoạn ADN đó đợc nhân lên Sự có mặt của sảnphẩm này chứng tỏ đã có sự tơng đồng hoàn toàn hay một phần giữa ADN genomvới các mồi oligonucleotit Từ những nghiên cứu này, ngày nay kỹ thuật RAPD đãđợc thống nhất theo phơng pháp của Williams và CS (1990) [37] là sử dụng cácđoạn mồi ngẫu nhiên có chiều dài 10 nucleotit với thành phần G + C cao (60%) đểbám chặt vào ADN khuôn.

Điểm khác giữa RAPD so với PCR là nó chỉ sử dụng một mồi ngẫu nhiên dài10 nucleotit, quá trình nhân bản ADN là ngẫu nhiên Đoạn mồi này có thể bám vàobất kỳ vị trí nào trong bộ genom khi tìm đợc vị trí bổ sung Với chiều dài ngắn nênkhả năng đoạn mồi tìm đợc các đoạn tơng đồng trên các mạch đơn của ADN tronggenom không quá khó khăn Vì thế RAPD là một phơng pháp có hiệu quả để xácđịnh tính đa hình về trật tự nucleotit giữa các cá thể Tùy vào từng nhóm loại thựcvật hay vi sinh vật cụ thể mà các đoạn mồi ngẫu nhiên đợc thiết kế đặc dụng Theolý thuyết, số lợng các đoạn ADN đợc nhân bản phụ thuộc vào độ dài và vị trí gắncủa các đoạn mồi, kích thớc và mức độ phức tạp của cấu trúc genom Kết quả là saukhi điện di sản phẩm RAPD sẽ xuất hiện nhiều phân đoạn khác nhau Sự khác nhauđó gọi là tính đa hình

Sự đa hình của sản phẩm RAPD là do mức độ tơng đồng của trình tự ADNtrong genom với trình tự mồi và kích thớc của bộ genom Độ tơng đồng càng cao thìphân đoạn càng nhiều.

Kỹ thuật RAPD cũng giống PCR gồm ba giai đoạn nhng điểm khác là tronggiai đoạn gắn mồi RAPD có nhiệt độ bắt mồi thấp hơn (từ 350C - 450C) Đây cũng làmột nguyên nhân dẫn đến có nhiều phân đoạn ADN đợc nhân bản ngẫu nhiên [2]

RAPD là một phơng pháp có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tíchquần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài, lập bản đồ di truyền Kỹ thuậtRAPD đợc sử dụng để nhận biết và phân loại các giống cây trồng khác nhau, sự đadạng di truyền trong các kiểu gen lúa nớc và lúa nơng, sự đa dạng di truyền giữa lúaIndica và Japonica, xác định sự đa hình của các giống.

Yang và Quiros đã sử dụng 28 đoạn mồi có trình tự 10 nucleotit để nghiêncứu sự khác biệt của 23 giống cần tây và đợc chia làm ba nhóm Kết quả thu đợccũng trùng hợp khi sử dụng 6 chỉ thị protein để phân loại các giống cần tây trên(Yang và Quiros, 1993) [38] Tơng tự nh vậy nhiều tác giả đã sử dụng RAPD để lậpcây chủng loại phát sinh của các loài cây nh: ngô, lúa gạo, lúa mì, [24, 29, 32].

Orozco và CS, (1994) [31] đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát mối quanhệ di truyền và tiến hoá của các giống cà phê đợc tai tạo từ các loài bố, mẹ ở cácvùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục đích tạo con lai cóđặc điểm quý để lai tạo giống cà phê mới Bùi Mạnh Cờng và CS, (2000) [6] cũngcho biết khi sử dụng kỹ thuật RAPD đã phân biệt đợc hai giống đậu Vetch và lentil,

giống nhau về hình thái (trọng lợng1000 hạt, màu sắc, kích thớc ) Điều này có mộtý nghĩa lớn trong việc xác định độ thuần di truyền cũng nh mức độ lẫn tạp cơ giớicủa các loại giống cây trồng

Trong quá trình thiết lập mối quan hệ giữa các loài hay nhóm loài (Apostolvà CS, 1993) đã xây dựng kỹ thuật phân nhóm thông qua các biểu đồ RAPD Thựcchất của kỹ thuật này gồm ba bớc:

Bớc 1: So sánh từng cặp đối tợng trong nghiên cứu bằng cách tính toánkhoảng cách quan hệ giữa chúng.

Bớc 2: Lập ma trận gồm tất cả những giá trị tính đợc trớc đó.

Bớc 3: Giải ma trận và biểu diễn thành một biểu đồ đặc trng Các giá trị biểudiễn khoảng cách giữa các cá thể đợc thiết lập theo hệ số tơng đồng của Nei và Li(1985).

S =

Trong đó NAB là số băng có mặt ở cả hai loài A và B; NA là số băng chỉ có ở

loài A; NB là số băng chỉ có ở loài B.

Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã thiết lập đợc phần mềm máy tính để tựđộng vẽ nên biểu đồ mối quan hệ hay độ tơng đồng di truyền của các đối tợngnghiên cứu sau khi nhập dữ liệu về các băng nhân bản của các cá thể NTSYSpcversion 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) là tên của một trơng trình thuộckiểu trên để tạo các biểu đồ hình cây Biểu đồ thu đợc sẽ thể hiện mức độ gần nhaucủa các cá thể cho phép đánh giá đợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể đợcnghiên cứu Chơng trình này cho phép giảm bớt thời gian nghiên cứu và có độ chínhxác cao nên nó là một phần mềm có hiệu quả trong việc phân tích kỹ thuật RAPD.1.2 Đặc điểm của các giống lúa Đặc sản ở miền Bắc Việt Nam

ở nớc ta cây lúa giữ vị trí trọng yếu trong hệ thống cây lơng thực Ngày naykhi năng suất lúa gạo đã đáp ứng đủ nhu cầu trong nớc và có d để xuất khẩu thì ngờita quan tâm nhiều đến chất lợng gạo Các giống lúa đang đợc sản xuất trên diện tíchlớn mặc dù cho năng suất cao nhng chất lợng cha đáp ứng đợc nhu cầu của thị trờngđòi hỏi Vì vậy vị trí các giống lúa đặc sản ngày càng quan trọng trong việc nângcao chất lợng gạo Việt Nam

Các giống lúa đặc sản có chất gạo tốt và có mùi thơm ngon thuộc nhóm lúamùa chính vụ Đa số các giống lúa này đợc trồng ở một số tỉnh thuộc khu vực miềnBắc nớc ta (Thái Bình, Nam Định, Hà Tây, Hải Dơng, Hải Phòng ), nh Tám XoanHải Hậu, Tám ấp Bẹ Xuân Đài, Tám Cổ Ngỗng Nam Định, Dự Thơm, Tẻ Di H-ơng Là những giống lúa có tiềm năng xuất khẩu và đáp ứng nhu cầu thiết thựctrong nớc [12].

Nhng các giống lúa này có diện tích gieo trồng ít, năng suất còn thấp vàkhông ổn định, do có nhiều đặc điểm yếu nh cây cao (từ 145 -170 cm), thân mềmyếu, chống đổ kém, lá dài rủ, hạt tha, cổ bông dài, kém chịu phân, phản ứng chặt

A + NB

chẽ với ánh sáng ngày ngắn và có thời gian sinh trởng khá dài (từ 155-170 ngày) cầnkhắc phục những nhợc điểm nói trên cho phù hợp với điều kiện canh tác của từngvùng [11, 12].

Vì vậy việc nghiên cứu tạo các đột biến thực nghiệm kết hợp với chọn dòngtế bào nhằm chọn tạo các giống lúa chất lợng và năng suất cao từ các giống lúa địaphơng có một ý nghĩa rất lớn không chỉ đối với cây lúa mà còn đối với các giốngcây trồng khác.

1.3 nuôi cấy mô sẹo và cơ sở chọn dòng biến dị soma

Năm 1898, lần đầu tiên, nhà thực vật học ngời Đức tên là Haberlandt đã nhậnxét: "Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đa bào đều có khả năng tiềm tàngđể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào" [1] Bấtkỳ một bộ phận nào của cây (mầm, rễ, thân, lá, nhị ), đều có thể tạo nên cây hoànchỉnh thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Mô sẹo (callus) là một khối tế bào mô mềm, có mức độ cấu trúc thấp, chaphân hoá, có khả năng phân bào liên tục và thờng có tính biến động di truyền cao.

Trong nuôi cấy in vitro mô sẹo đợc tạo ra từ nuôi cấy các cơ quan của thực vật

(thân, lá, rễ, hạt, nhị ) ở các môi trờng nuôi cấy thích hợp có chứa các chất điềukhiển sinh trởng cần thiết nh (auxin, cytokinin) và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánhsáng, độ ẩm ) tối u Mô sẹo có thể đợc duy trì trên môi trờng nuôi cấy bằng cáchcấy chuyển định kỳ, tuy nhiên trong thực nghiệm cho thấy rằng: mô sẹo qua cấychuyển nhiều lần thì khả năng tái sinh cây giảm rõ rệt và tăng tính biến động ditruyền của mô [1, 9, 15]

Các tế bào mô sẹo có tính ổn định di truyền thấp Vậy muốn nhân nhanh vàduy trì tính đồng nhất di truyền thông qua mô sẹo của một số loài thực vật cần sửdụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh cây hoàn chỉnh Những cây tái sinh từ mô sẹo thờngcó những biến đổi di truyền phong phú (dị bội, đa bội) và các biến đổi di truyềnkhác, điều này có ý nghĩa trong chọn giống (Lê Trần Bình và CS, 1998) [2], (Oono,1983) [30] Bằng cách này nhiều tác giả đã thông báo thu đợc những giống câytrồng mới [3, 15, 20, 33].

Thuật ngữ “ biến dị soma” đợc Larkin và Scowcroft (1982) [27] dùng để chỉtất cả các biến dị xảy ra trong quá trình nuôi cấy mô và tế bào Biểu hiện của biến dịsoma đợc quan sát thấy ở kiểu hình của những cây tái sinh từ nuôi cấy mô sẹo.

Nguyên lý chung của việc chọn dòng mang biến di soma là ở tế bào nuôi cấy invitro tần suất biến động di truyền dao động từ 10-5- 10-8 trong môi trờng nuôi cấybình thờng khi không xử lý đột biến, còn nếu kết hợp với xử lý đột biến bằng chấthoá học (EMS, BU ) hoặc các loại bức xạ (tia UV, tia gamma ) thì tần số đột biếncó thể tăng lên gấp 10 - 100 lần, vì vậy có thể chọn ra các cá thể đột biến nhanh hơnvà có hiệu quả hơn so với các biện pháp chọn giống thông thờng khác áp dụng chocây nguyên vẹn ở mức độ tế bào, nhất là tế bào đơn bội hầu nh các đặc điểm độtbiến đợc thể hiện ra ngay Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào còn cho phép giảm bớt đángkể thời gian cần thiết để chọn đợc những tính trạng theo ý muốn [22].

Shepart và CS (1980) qua nuôi cấy tế bào trần của khoai tây đã chọn lọc vàđã thu đợc giống khoai tây có thời gian sinh trởng ngắn, củ đều, hình dạng đẹp vàchống chịu đợc một điều kiện bất lợi của môi trờng tốt hơn so với giống gốc [tríchdẫn từ 1]

Larkin và CS (1982) [27], Barwale và CS (1987) [19] cũng cho rằng biến dịsoma thờng xuất hiện ở các cây tái sinh đợc sau khi nuôi cấy tế bào qua giai đoạnmô sẹo Có nhiều kiểu đột biến nh: đột biến nhân, đột biến tế bào chất, đa bội thể vàcác bất thờng khác trong nhiễm sắc thể.

Trong nghiên cứu thực nghiệm Maliga (1984) [28] đã tiến hành xử lý tia cựctím đối với tế bào trần thuốc lá và xử lý tia gamma Co60 với tế bào thuốc lá cho thấytần số đột biến tăng lên 10 lần so với đối chứng

Những cây tái sinh từ mô sẹo xử lý đột biến dễ mang những biến động ditruyền về nhiễm sắc thể (di bội, đa bội) và các biến đổi di truyền khác.Vấn đề nàyđã mở ra một triển vọng lớn trong việc cải tiến di truyền những giống cây trồng có ýnghĩa kinh tế, tạo giống mới cho năng suất cao, chống chịu đợc các điều kiện ngoạicảnh bất lợi, chất lợng tốt và ổn định Nhiều công trình nghiên cứu đã thành côngtrong việc chọn dòng mang biến di soma trên các đối tợng cây trồng khác nhau đặcbiệt là cây lơng thực

Theo Lê Trần Bình và CS (1997) [1] bản chất và cơ chế của biến dị soma liênquan mật thiết đến những thay đổi trong genom của tế bào nuôi cấy Do nhiềunguyên nhân nh tác động của hoocmôn sinh trởng trong thời gian dài và các yếu tốkhác làm cho nhiễm sắc thể trong tế bào nuôi cấy tăng lên tạo ra các dạng đa bộilệch và mức bội thể cao Nhiều trờng hợp khác, các đoạn nhiễm sắc thể có thể bịchuyển đổi hoặc đảo ngợc Cấu trúc của phân tử ADN có thể bị thay đổi dẫn đếnthay đổi kiểu hình thực sự.

Adkins và CS (1995) [18] thông báo đã chọn đợc dòng lúa chịu hạn từ môsẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105 bằng việc bổ sung vào môi trờng nuôi cấy PEG8000 Các tính trạng nông sinh học quan trọng và khả năng chịu hạn đã duy trì và ổnđịnh ở thế hệ R2 Tơng tự một số tác giả cũng thu đợc các dòng cây chịu mất nớcnh cây anh đào, cây cao lơng

Sử dụng công nghệ tế bào thực vật kết hợp với kỹ thuật thổi khô mô sẹo(Đinh Thi Phòng và CS, 2001) [15] đã chọn tạo thành công ba giống lúa DR1, DR2và DR3 cả ba giống lúa đều thấp cây, ngắn ngày, chịu nóng hạn, chịu lạnh khá,chống đổ, đẻ nhánh và sinh trởng khoẻ, cho năng suất vợt giống gốc CR 203 Trongđó DR2 đã đợc công nhận là giống lúa Quốc gia 1998 và hiện nay DR2 không chỉđợc gieo trồng ở 12 tỉnh miền núi phía Bắc mà còn cả ở miền Trung (Kontum).Giống lúa DR3 đã qua ba vụ khảo nghiệm cơ bản và hiện đang đợc triển khai mởrộng sản xuất ở các vùng sinh thái khó khăn

Tơng tự nh vậy Viện lúa đồng Bằng sông Cửu Long cũng đã chọn tạo thànhcông dòng lúa Khao 105 có tính ứng dụng và các dòng chịu muối triển vọng từgiống lúa Một Bụi (Bùi Bá Bổng, 1997) [3] và hiện nay giống Khao 105 đã đợc côngnhận là giống Quốc gia Phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh

học cũng đã chọn tạo thành công giống lúa BR12 kháng bệnh đạo ôn, có nguồn gốctừ giống lúa CR203

Việc chọn đợc những dòng tế bào kháng nấm bệnh, kháng chất diệt cỏ,kháng kháng sinh, kháng kim loại nặng, thích nghi tốt với các yếu tố bất lợi của môitrờng (nóng, lạnh, khô, hạn, chua, mặn ), trên nhiều đối tợng cây trồng khác nhaucó một ý nghĩa to lớn trong nông nghiệp.

1.4 Đột biến thực nghiệm và ứng dụng trong chọn tạo giốngcây trồng

Vật chất di truyền đợc duy trì ổn định từ thế hệ này sang thế hệ khác, nhngkhông phải là tuyệt đối, có thể bị biến đổi bởi tác nhân tự nhiên hoặc gây tạo nh tácnhân gây đột biến vật lý và hoá học Ngời ta gọi những biến đổi dù là nhỏ nhất trongcấu trúc gen hoặc nhiễm sắc thể là đột biến [16].

Trong chọn giống cổ điển để chọn đợc một giống tốt, ổn định ngời ta phảicần ít nhất từ 6 đến 10 thế hệ vì những đột biến trong tự nhiên suất hiện với tần sốrất thấp Trong khi đó bằng phơng pháp đột biến nhân tạo (đột biến thực nghiệm),chỉ cần từ 3 đến 6 thế hệ, thậm chí cá biệt chỉ có trờng hợp cần 2-3 thế hệ (NguyễnHữu Đống, 2000) [10] Với phơng pháp đột biến nhân tạo, sử dụng các tác nhân gâyđột biến lý hoá có thể làm tăng nguồn đa dạng di truyền trong quần thể Trong hàngloạt các đột biến xuất hiện, những đột biến có lợi có thể nhân trực tiếp thành giốngmới hoặc đợc sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn giống Trong nhiềutác nhân gây đột biến thì các tác nhân vật lý (tia Rơnghen, tia gamma, bức xạnơtron ) hiện là những tác nhân gây đột biến có hiệu quả, giúp chọn tạo ra cácgiống cây trồng có những tính trạng tốt (chịu hạn, kháng nấm, năng suất cao, chất l-ợng tốt, thời sinh trởng ngắn ) Nhiều tác giả xử dụng phơng pháp gây đột biếnthực nghiệm bằng tia gamma đã chọn tạo đợc nhiều giống cây trồng mới, đặc biệt làcác cây lơng thực Đối với chiếu xạ tia gamma từ nguồn Co60 hoặc Cs137có hoạt tínhphóng xạ, tuỳ từng trờng hợp cụ thể có thể sử dụng hai cách chiếu xạ: chiếu xạ trongthời gian ngắn với liều lợng cao hoặc chiếu xạ trong thời gian dài với liều lợng thấp[7]

Bức xạ ion hoá gồm tia Rơnghen (tia X), tia gamma (tia ) và các hạt về bức

xạ do các nguyên tố phóng xạ giải phóng ra (các hạt ,  , proton, nơtron) Thuật

ngữ ion hoá hàm ý muốn nói rằng năng lợng của chúng lớn tới mức các phân tử nớcvà các phân tử khác khi bi tác dụng sẽ bị phá vỡ thành những phân tử tích điện Mọidạng bức xạ ion hoá đều có hiệu ứng gây chết và đột biến cho mọi tế bào và virut.Khi có mặt ôxy, bức xạ ion hoá sản sinh ra các gốc hydro peroxit và nhiều các chấtcó phản ứng mạnh Các chất này sẽ tác động trực tiếp đến các phân tử sinh học gâytổn thơng chúng, đặc biệt là những tác động lên bộ genom làm biến đổi vật chất ditruyền, tạo ra các đột biến gen và đột biến nhiễm sắc thể, có thể đợc di truyền lạicho các thế hệ sau [17].

Các phân tử sinh học nh ADN dới tác dụng của bức xạ ion hoá có thể bị badạng tổn thơng sau: đứt gãy một mạch đơn (đứt gãy khung đờng - photphat), đứt gãymạch kép và thay thế bazơ nucleotit, ảnh hởng đến qua trình sao chép ADN - ARN

và tổng hợp protein Cần nhấn mạnh rằng chỉ cần một sai lệch nhỏ của phân tử axítnucleic có thể dẫn đến những thay đổi lớn vì cơ chế hoá sinh của tế bào khuếch đạinó lên một cách đáng kể Nhiễm sắc thể cũng có thể bị biến đổi cấu trúc (mất đoạn,lặp đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn), hoặc thay đổi số lợng nhiễm sắc thể (dị bội, đabội).

Khi chiếu xạ bằng tia gamma từ nguồn Co60 lên tế bào hoặc mô thì các phântử sinh học chịu tác dụng trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hoá:

- Tác dụng trực tiếp: bức xạ trực tiếp ion hóa và kích thích các phân tử sinhhọc làm tổn thơng các phân tử đó.

Tác dụng gián tiếp: bức xạ ion hoá tác dụng lên các phân tử nớc (chiếm 85 95% trọng lợng tế bào) với ion H+, OH-, tạo ra các gốc tự do OH, H và các sảnphẩm oxy hoá mạnh nh H2O2 chúng có khả năng hoạt động rất mạnh về mặt hoáhọc, do đó nó công phá các phân tử sinh học làm thay đổi cấu trúc chức năng củachúng Nếu những tổn thơng hoá sinh không phục hồi đợc sẽ kéo theo những tổn th-ơng chuyển hoá dẫn đến những tổn thơng hình thái và chức năng [7].

Công tác chọn giống và tạo giống mới có vai trò hết sức quan trọng trong việcnâng cao năng suất và chất lợng cây trồng đặc biệt là cây lơng thực Chính công tácnày đã đóng vai trò quyết định trong cuộc cách mạng xanh trong những năm 1960 ởấn Độ và nhiều nớc khác trên thế giới [7] Một trong những thành tựu nổi bật nhấtcủa thế kỷ 20 là khám phá ra phơng pháp tạo giống bằng cách gây đột biến thựcnghiệm Với kết quả của hơn 60 nớc đã thu đợc chứng tỏ đây là một phơng pháp cóhiệu quả để tạo giống mới.

Theo thống kê của tổ chức lơng thực và tổ chức năng lợng nguyên tử thế giới(FAO/IAEA) năm 1960 chỉ có 7 giống cây trồng đột biến, năm 1975 có 145 giống,năm 1992 có 1330 giống, năm 1997 có 1870 giống Trung Quốc, Nhật Bản, ấn Độ,Liên Xô cũ là những nớc tạo ra nhiều giống bằng phơng pháp đột biến thựcnghiệm Trong đó chủ yếu là cây lơng thực nh, lúa mạch không đổ “Pallas”; lúamạch thấp cây, chín sớm “Mari” (Thuỵ Điển); lúa mạch “Vena” chống bệnh gỉ sắt(áo); lúa mì “Inta” sản lợng cao, chịu rét, rơm ngắn (Đức); lúa cho năng suất cao(ấn Độ, Nhật Bản); lúa chống sâu bệnh, chịu thâm canh (A20, DT10, xuân số 5 -Việt Nam); giống Tài nguyên ĐB - 100 không mẫn cảm với quang chu kỳ, thời giansinh trởng ngắn , năng suất và chất lợng cao (Việt Nam); giống đậu Hà Lan “Strol”năng suất cao (Thuỵ Điển); giống đậu tơng “Sanilak”, “Xiuei”, “Gretiot” chín sớm,chống nấm, chống bệnh đốm lá, không đổ (Mỹ); giống đậu tơng chín sớm, chốngnấm, hàm lợng protit, lipit cao (Nga, Đức, Mỹ); giống bông đột biến No.108 có bụidày, lá xanh đậm, chống đổ, chống bệnh giỏi, năng suất và chất lợng bông cao - nhờviệc xử lý tia  từ nguồn Co60 với liều lợng 2000rad (Nga) [16, 17]

ở Việt Nam, các nghiên cứu và ứng dụng của phơng pháp gây đột biến thựcnghiệm vào chọn giống thực vật đã đợc bắt đầu khá sớm Đó là vào năm 1966, tạiBộ môn Di truyền học, Trờng Đại học Tổng hợp Hà Nội, với các nghiên cứu trêncây lúa và cây đậu tơng (Vũ Nguyên Hiền, Trịnh Bá Hữu, Phan Phải, Trần MinhNam, Lê Duy Thành, Phạm Thành Hổ, Phạm Bá Phong, 1970; 1978; 1986; 1990 ).

Sau đó hớng nghiên cứu đã đợc triển khai ở nhiều cơ sở khác nh, Viện KHKTNNViệt Nam (Trần Đình Long, Nuyễn Hữu Nghĩa ), Viện di truyền nông nghiệp( Phan Phải, Trần Duy Quý, Nguyễn Hữu Đống, Hoàng Tuyết Minh ), Trờng Đạihọc S phạm I Hà Nội (Nguyễn Minh Công, Lê Đình Trung ), Trờng Đại học Nôngnghiệp I (Lê Song Dự, Trần Tú Ngà, Đoàn Thị Thanh Nhàn ), Và nhờ vậy, chođến nay nớc ta có hàng chục giống mới đợc tạo ra bằng phơng pháp gây đột biếnthực nghiệm ở một số cây chồng, cho năng suất cao, chất lợng tốt và chống chịu đợccác điều kiện bất lợi của môi trờng, nh giống lúa (A- 20, DT10, DT11, DT13, DT33,Xuân số 5, Xuân số 6, Tép hành đột biến), giống lạc (V79, 4329, A329, DT332 ),giống ngô (DT-6, DT-8 ), đậu tơng ( M103, DT83, DT84, DT90, V48 ), cà chua(“Hồng Lan” ) [17, 25, 35]

Gần đây Nguyễn Minh Công và CS (1999) [4] đã tạo đợc giống Tám Thơmđột biến không cảm quan, có thể cấy đợc cả hai vụ Phạm Văn Chơng, 2001) [5]cũng thông báo chọn tạo đợc ba giống lúa BM9855, LT2 và Khao 85 đột biến khôngcảm quang, gieo cấy đợc cả hai vụ, có chất lợng gạo cao (hạt gạo trong, dài, ngoncơm ), năng xuất khá Riêng giống Khao 85 hiện nay là giống lúa duy nhất ở miềnBắc Việt Nam đạt tiêu chuẩn quốc tế về gạo xuất khẩu chất lợng cao Giống LT2 đ-ợc xếp vào loại giống lúa đặc sản của Việt Nam

Chơng 2 đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

2.1 đối tợng nghiên cứu

1 Đối tợng nghiên cứu tính đa hình ADN là 20 giống lúa Tám có nguồn gốckhác nhau đợc trình bày ở bảng 2

2 Đối tợng dùng nghiên cứu chọn dòng đột biến là 4 giống lúa: Tám Xoan,Tám ấp Bẹ, Dự Thơm và Tẻ Di Hơng.

Tất cả các giống lúa này đợc Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật thuộcViện Khoa học Kỹ Thuật Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.

- Nguồn chiếu xạ tia gamma từ nguồn Co 60 đợc tiến hành tại Trung tâmchiếu xạ Quốc gia Từ Liêm, Hà Nội.

- Thiết bị sử dụng: máy ly tâm lạnh (Sigma), máy PCR (Thermal Cycler PTC100 hãng MJ), máy điện di (Biorad), máy đo quang phổ Model 8425A (HewlettPackard), máy chụp ảnh Gel Doc (Pharmacia), máy chụp ảnh (Polaroid), dàn cây,buồng tối và bình nuôi cấy.

Bảng 1: Đặc điểm nông học của các giống lúa nghiên cứu chọn dòng đột biến

Đặc điểmTám XoanTám ấp BẹDự ThơmTẻ Di HơngThời gian sinh

trởng (ngày) 160 - 165 165 - 168 155 – 158 142 - 145Chiều cao cây

Hạt nhỏ, trongvà ngon cơm

Hạt nhỏ, ngon và rất thơm

Cơm mềm, dẻo và thơm

Cơm mềm, dẻo và thơm

Đặc tính chống chịu

Thân mềm, chống đổ kém

Thân mềm, chống đổ kém

Hạt các giống lúa

Tạo cây và thu lá

Đánh giá đa hình ADN bằng kỹ

thuật RAPD

Tái sinh cây và xác định ng ỡng xử lý đột biến

Tạo mô sẹo

Hạt gạo đã khử trùng đợc cấy lên môi trờng MS cơ bản, có bổ sung 1%saccharoza + 0.8% agaroza, pH = 5,8 Mật độ cấy 10-15 hạt/bình Nuôi ngoài ánhsáng đèn trong phòng cấy với cờng độ 2000 lux, thời gian chiếu sánh 10/24 giờ,nhiệt độ nuôi cấy 250C Sau 2 tuần cắt thu lấy lá dùng ngay hoặc bảo quản ở tủ lạnhsâu - 200C Thu lá non vì lá non có ít sản phẩm của trao đổi chất gây trở ngại chokhả năng hoà tan của ADN thu đợc.

2.2.1.2 Tách ADN tổng số từ lá lúa

Quy trình tách chiết ADN tổng số từ lá lúa dựa theo phơng pháp tách ADNcủa Egnin, 1998.

a) Hoá chất sử dụng:

1M Tris-HCl, pH = 8.0; 5M NaCl; 0.5 EDTANa2; PVP; 5% SDS (Sodiumdodecyl sulfate); RnazaA 10 mg/ml; 3M CH3C00Na, pH 5,3 or pH 7.0; TE (10 mMTris, pH=8.0 + 1mM EDTA, pH=8.0); isopropanol; Phenol: Chlorofom: Isoamyl(25:24:1) và Cồn 80%.

b) Pha đệm tách ADN:

Bảng 3: Nồng độ của hoá chất tách ADN tổng số

Nồng độ chuẩnNồng độ cần phaTrong 50 ml

- Chuyển nhanh sản phẩm nghiền vào ống eppendorf, giữa trong đá hoặc chovào tủ lạnh sâu -20 cho đến khi cần dùng.

- Thêm 9-12 ml dung dịch đệm tách ADN trộn đều bằng cách đảo ngợc nhẹ.Nếu dùng ống eppendorf 2 ml thì thêm 500 l - 1ml đệm A trộn đều

- Giữ trong đá 2-5 phút, Thêm 9 ml dung dịch (Phenol: Chlorofom: Iso amin)(25: 24: 1) đảo đều cho đến khi có màu trắng sữa, cho vào đá.

- Ly tâm với tốc độ 10.000 - 12.000 vòng/phút, ở 40C trong 15 phút.

- Chuyển dịch trên sang ống eppendorf mới, có chứa 9ml dung dịch Isopropanol (nhẹ nhàng không khuấy cặn) Dịch nổi trên cùng có thể lọc qua một mànglọc vô trùng trớc khi thêm Iso propanol.

- Đảo đều để trong nhiệt độ 40C, 10-30 phút (hoặc cho kết tủa qua đêm ởnhiệt độ 4 0C).

- Ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/phút, ở 40C trong 3-5 phút nếu ADN là lớn cóthể thấy lơ lửng, nếu không ly tâm ở số vòng lớn hơn 10.000 vòng/phút trong 5 phút.- Loại bỏ phần dịch nổi ở trên, làm khô phần kết tủa (không làm khô quá lâu)bằng máy Speed-Vac.

- Hoà tan kết tủa trong 500 l TE, hoặc ít hơn nếu vật liệu ban đầu dùng ít, đểở 40C qua đêm cho cục kết tủa hết và ADN không bị gãy.

- Thêm 3 -7 l enzym RnazaA, trộn đều và ủ ở 370C trong 30 phút.

- Ly tâm 14.000 vòng/phút chuyển dịch trên sang một ống mới 1,5ml cẩnthận không sẽ bị khuấy cặn.

- Thêm 100l CH3C00Na, lắc đều và thêm 1ml Isopropanol để kết tủa lại.- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi và thêm 1mlcồn 80%.

- Ly tâm14.000 vòng/phút, bỏ dịch cồn trên và làm khô bằng máy Speed-Vac(ADN phải khô mới có thể hoà tan hoàn toàn trong TE).

- Hoà tan lại trong 50 - 100 l TE, để qua đêm , bảo quản ADN ở -200C

2.2.1.3 Phơng pháp xác định hàm lợng và độ sạch của ADN

a) Điện di trên gel agaroza:

- Pha agaroza 0.8% trong TBE 0.5X, đun nóng, để nguội khoảng 600C đổ vàokhuôn gel 30ml có cài lợc.

- Sau 30 phút tháo lợc ra, đổ đệm chạy điện di TBE 0.5X ngập bảng gel 1mm.- Lấy 2l DNA mẫu + 1l Thuốc nhuộm 10X + 7l H2O trộn đều Dùngpipet cho vào giếng.

- Chạy điện di: 60V, 70 phút.

- Nhuộm gel: nhuộm gel bằng Ethidium bromid 0.5 g/ml trong 10 phút, rửasạch bằng nớc.

- Soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.