đánh giá sự đa dạng của các dòng, giống đậu tương dựa trên chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử SSR

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------- TRIỆU THỊ THỊNH ðÁNH GIÁ SỰ ðA DẠNG CỦA CÁC DÒNG, GIỐNG ðẬU TƯƠNG DỰA TRÊN CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên nghành: Trồng trọt Mã số: 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ ðình Hòa HÀ NỘI- 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan các số liệu kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc, những tập thể và cá nhân giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn. Tác giả luận văn Triệu Thị Thịnh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii LỜI CẢM ƠN Hoàn thành cuốn luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới PGS.TS. Vũ ðình Hòa người ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tạo ñiều kiện ñể tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ tận tình của cô Vũ Thị Thúy Hằng, giáo viên Bộ môn Di truyền – Giống ñã giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ của thầy cô giáo trong Khoa Nông học, Viện ðào Tạo Sau ðại Học, Khoa Công nghệ sinh học, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh ñạo Trung Tâm Nghiên Cứu Bệnh Cây Nhiệt ðới cùng các anh chị trong Trung Tâm ñã giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cám ơn tới bạn bè, ñồng nghiệp, gia ñình ñã ñộng viên, giúp ñỡ, tạo mọi ñiều kiện ñể tôi hoàn thành luận văn này. Tác giả luận văn Triệu Thị Thịnh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv MỤC LỤC PHẦN I. MỞ ðẦU .i 1.1. ðặt vấn ñề 1 1.2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài . 3 1.2.1. Mục ñích 3 1.2.2. Yêu cầu 3 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 4 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của ñề tài . 4 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn 4 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 5 2.1. Mở ñầu . 5 2.2. Tình hình nghiên cứu ñậu tương ở trên thế giới và Việt Nam . 6 2.2.1. Tình hình nghiên cứu ñậu tương trên thế giới 6 2.2.2. Tình hình nghiên cứu ñậu tương ở Việt Nam . 13 2.3. ða dạng di truyền và chỉ thị phân tử . 16 2.3.1. ða dạng di truyền . 16 2.3.2. Chỉ thị di truyền . 17 2.3.3. Một số chỉ thị phân tử 20 2.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong ñánh giá ña dạng di truyền 23 2.5. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong ñánh giá ña dạng di truyền của ñậu tương 26 PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1. Vật liệu nghiên cứu 29 3.2. Nội dung nghiên cứu 29 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 3.3. Gieo trồng và theo dõi các chỉ tiêu hình thái 29 3.3.1. ðặc ñiểm sinh trưởng và hình thái . 29 3.3.2. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất . 34 3.4. Phân tích chỉ thị SSR 34 3.4.1. Tách chiết ADN . 34 3.4.2. Phản ứng PCR . 35 3.4.3. ðiện di và score vạch . 37 3.5. Phương pháp xử lý số liệu 37 3.5.1. Phân tích ña dạng di truyền dựa trên hình thái . 37 3.5.2. Phân tích ña dạng di truyền dựa trên chỉ thị SSR . 37 PHẦN 4. KẾT QỦA NGHIÊN CỨU . 38 4.1. ðặc ñiểm sinh trưởng và phát triển của các mẫu giống ñậu tương 38 4.1.1. Kiểu thời gian sinh trưởng . 38 4.1.2. Thời gian sinh trưởng và phát triển 39 4.1.3. ðặc ñiểm chiều cao cây . 43 4.2. Khả năng chống chịu của một số mẫu giống ñậu tương 45 4.2.1. Mức ñộ nhiễm sâu bệnh . 45 4.2.2. Khả năng chống ñổ 49 4.3. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các mẫu giống ñậu tương 51 4.3.1. Số cành cấp 1 và số ñốt hữu hiệu của các mẫu giống ñậu tương 51 4.3.2. Tổng số quả/cây và khối lượng 1000 hạt 53 4.3.3. Năng suất của các mẫu giống ñậu tương 57 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi 4.4. Mối tương quan giữa một số tính trạng tới năng suất của các mẫu giống ñậu tương trong thí nghiệm . 60 4.5. Sự ña dạng của các mẫu giống ñậu tương dựa trên ñặc ñiểm hình thái61 4.5.1. ðặc ñiểm thân mầm . 61 4.5.2. ðặc ñiểm lá ñậu tương . 64 4.5.3. ðặc ñiểm hoa, quả và hạt ñậu tương 67 4.6. Sự ña dạng di truyền của các mẫu giống ñậu tương dựa trên chỉ thị hình thái 70 4.7. Tính ña hình về chỉ thị phân tử SSR của các mẫu giống ñậu tương . 73 4.7.1. Kết quả tách chiết ADN . 73 4.7.2. Mức ña hình của 10 cặp mồi SSR 74 4.7.3. ða dạng di truyền của các mẫu giống ñậu tương dựa trên chỉ thị phân tử SSR . 76 4.7.4. So sánh giữa sự ña dạng dựa vào chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử SSR . 79 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ . 81 5.1. Kết luận 81 5.1.1. Khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất của các mẫu giống ñậu tương . 81 5.1.2. ðánh giá 36 mẫu giống ñậu tương bằng tính trạng hình thái 81 5.1.3. ðánh giá 36 mẫu giống ñậu tương bằng chỉ thị phân tử SSR . 81 5.2. ðề nghị 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC 91 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC CÁC BẢNG 1. Bảng 3.1. Nguồn vật liệu ñậu tương sử dụng trong ñánh giá ña dạng di truyền……………………………………………………………………… .30 2. Bảng 3.2. Các tính trạng ñược ñánh giá……………………………… 32 3. Bảng 3.3. 10 cặp mồi SSR ñược sử dụng trong thí nghiệm…………….35 4. Bảng 3.4. Thành phần các chất tham gia phản ứng PCR…………………35 5. Bảng 3.5. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR ñối với ñậu tương……… … 36 6. Bảng 4.1. Thời gian sinh trưởng của các dòng, giống ñậu tương ……… 39 7. Bảng 4.2. Chiều cao cây của các dòng, giống ñậu tương………………43 8. Bảng 4.3. Mức ñộ nhiễm sâu của các dòng, giống ñậu tương tham gia thí nghiệm……………………………………………………………………….45 9. Bảng 4.4. Mức ñộ nhiễm bệnh của các dòng, giống ñậu tương tham gia thí nghiệm………………………………………………………………………47 10. Bảng 4.5. Khả năng chống ñổ của các dòng, giống ñậu tương………….49 11. Bảng 4.6. Một số ñặc ñiểm thực vật học chính của các dòng, giống ñậu tương…………………………………………………………………………51 12. Bảng 4.7. Các yếu tố cấu thành năng suất của ñậu tương……………….54 13. Bảng 4.8.Năng suất của các dòng, giống ñậu tương tham gia thí nghiệm……………………………………………………………………….56 14. Bảng 4.9. Hệ số tương quan giữa năng suất với một số tính trạng…… .57 15. Bảng 4.10. Một số ñặc ñiểm hình thái của các dòng, giống ñậu tương tham gia thí nghiệm……………………………………………………………… 60 16. Bảng 4.11. Một số ñặc ñiểm về hình dạng lá chét của các dòng, giống ñậu tương…………………………………………………………………………63 17. Bảng 4.12. Một số ñặc ñiểm của hoa, quả , hạt ñậu tương………………66 18. Bảng 4.13. Một số ñặc ñiểm thực vật học của các nhóm……………… 69 20. Bảng 4.14. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất……………… 70 21. Bảng 4.15. Số băng và thông tin ña hình PIC của 10 cặp mồi SSR…… 73 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 PHẦN I. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn đề Cây ñậu tương Glycine max (L) Merrill là một trong những cây trồng quan trọng ở nước ta. ðậu tương là cây họ ñậu ngắn ngày, có thể trồng ñược 3 - 4 vụ trong năm trong các hệ thống luân canh tăng vụ trên 7 vùng sinh thái của nước ta. Sản phẩm cây ñậu tương không những là nguồn thực phẩm giàu protein, vitamin và các khoáng chất trong bữa ăn hàng ngày của người dân các nước ñang phát triển mà còn là nguyên liệu cho các nghành công nghiệp chế biến và là nguồn thức ăn quan trọng cho chăn nuôi. Bên cạnh ñó, cây ñậu tương cũng ñược coi là một thành phần quan trọng trong hệ thống canh tác về phương diện sinh thái. Do có khả năng cố ñịnh ñạm, ñậu tương ít bị phụ thuộc vào phân ñạm hơn so với các cây trồng khác. ðậu tương cũng góp phần nâng cao ñộ phì nhiêu của ñất và cung cấp nguồn ñạm cho cây trồng vụ sau. Vì thế ñậu tương ñã trở thành cây trồng quan trọng trong luân canh và trồng xen ở nhiều nước trên thế giới. ðối với Việt Nam, ñậu tương là một cây luân canh, xen canh, gối vụ rất quan trọng trong cơ cấu cây trồng, góp phần nâng cao năng suất cây trồng vụ sau và nâng cao hệ số sử dụng ñất. ðiều này có ý nghĩa to lớn trong phương châm chuyển ñổi cơ cấu, ña dạng hóa cây trồng ở nước ta hiện nay. ðặc biệt, trong chiến lược thâm canh tăng vụ, việc ñưa vào luân canh những cây trồng có giá trị cải tạo ñất là một vấn ñề thiết yếu, nhằm nâng cao năng suất cây trồng và sử dụng ñất bền vững. Chính vì những giá trị ñó, cây ñậu tương chiếm giữa một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp ở nước ta. Sự phát triển nhanh và mạnh mẽ của công nghệ sinh học ñã mang lại nhiều thành tựu to lớn trong nông nghiệp. Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 2 sinh học trong chọn giống cây trồng ñã ñược nhiều nhà khoa học quan tâm. Trong các công cụ, chỉ thị phân tử là công cụ hữu ích ñối với chọn tạo giống cây trồng, ñó là RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD (Ramdom amplified polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), STS (Sequence Tagged Site) . ðối với vật liệu chọn giống chỉ thị phân tử ñược sử dụng ñể phân tích ña dạng di truyền và xác ñịnh các mối quan hệ trong nguồn gen hay nguồn vật liệu khởi ñầu. Chỉ thị phân tử còn ñược dùng trong thiết lập bản ñồ gen hoặc xác ñịnh locus tính trạng chất lượng và số lượng nhằm cung cấp thông tin di truyền của các tính trạng. Trong các chỉ thị phân tử, chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats) hay microsatellite có nhiều ưu ñiểm: i) ñồng trội và dựa trên PCR, ii) có ñộ tin cậy cao và chính xác, iii) ña allen và biến ñộng mạnh. Chỉ thị SSR là những ñoạn lặp lại ngắn phân bố ngẫu nhiên và ñồng ñều trên toàn genom (Hamada và CS, 1982) [44]. Sự biến ñộng mạnh về số lượng các ñơn vị SSR làm cho chỉ thị SSR là một công cụ tuyệt vời ñể phân hóa kiểu gen, phân tích phả hệ và ñánh giá khoảng cách di tuyền giữa các cá thể hay quần thể. Chỉ thị SSR ñã ñược sử dụng thành công ñể phân tích kiểu gen của nhiều loài cây trồng, như cà chua (Phillips và CS, 1994) [63], cải dầu (Kresovich và CS, 1995) [53], khoai tây (Schneider và Douches, 1997) [66] và những cây trồng khác. Tính ña hình cao ở các locus SSR cũng ñã ñược phát hiện ở ñậu tương (Akkaya và CS, 1992; Cregan và CS, 1994; Narvel và CS, 2000; Messang và CS, 2001) [33], [37], [61], [59]. Chỉ thị SSR ñã ñược sử dụng thành công và hiệu quả trong phân tích ña dạng di truyền, phân loại các giống cây trồng, xây dựng bản ñồ liên kết, phân lập (gen), xác ñịnh quan hệ di truyền giữa các dòng giống cây trồng và chẩn ñoán cặp lai cho ưu thế lai (Akash, 2003) [60]. ðậu tương là một cây trồng tự thụ phấn, có sự biến ñộng di truyền hạn chế. Chỉ thị hình thái và chỉ thị RFLP cho thấy sự ña dạng di truyền thấp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 3 (Keim và cộng sự, 1992) [52]. Những chỉ thị khác như RAPD, SSR ñã ñược kiểm chứng là những chị thị có ích ñể phát hiện sự ña dạng di truyền ở ñậu tương (Akkaya và CS, 1992) [33]. Vì vậy, sự ña dạng di truyền của nguồn vật liệu ñậu tương không thể chỉ dựa vào sự ña dạng hình thái, mà cần bổ sung bằng chỉ thị phân tử nhằm cung cấp cở sở cho các nhà chọn giống ñánh giá ñể sử dụng trong cải tiến tạo các giống theo mục tiêu cho trước. Tuy nhiên, ở nước ta chưa có nhiều tài liệu ñề cập ñến ñánh giá sự ña dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử. ðề tài của chúng tôi trình bày kết quả bước ñầu về: “ðánh giá sự ña dạng của các dòng, giống ñậu tương dựa trên chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử SSR” 1.2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 1.2.1. Mục ñích ðánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất của 36 dòng, giống ñậu tương. Xác ñịnh ñược mối quan hệ di truyền giữa các dòng, giống ñậu tương bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử. 1.2.2. Yêu cầu ðánh giá các ñặc ñiểm thực vật học, sinh trưởng và năng suất của dòng, giống ñậu tương. Dùng các tính trạng hình thái ñể ñánh giá ña dạng di truyền giữa 36 dòng, giống ñậu tương, xác ñịnh khoảng cách di truyền, vẽ biểu ñồ biểu hiện mối quan hệ này. Sử dụng phương pháp SSR ñể ñánh giá ña dạng di truyền giữa 36 dòng, giống ñậu tương trên cơ sở phân tích ADN, xác ñịnh khoảng cách di truyền, vẽ biểu ñồ biểu hiện mối quan hệ này. . BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------- TRIỆU THỊ THỊNH ðÁNH GIÁ SỰ ðA DẠNG CỦA CÁC DÒNG, GIỐNG ðẬU TƯƠNG DỰA TRÊN CHỈ THỊ HÌNH. giá sự ña dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử. ðề tài của chúng tôi trình bày kết quả bước ñầu về: “ðánh giá sự ña dạng của các dòng, giống ñậu tương dựa