tương ựồng di truyền 0,72, 38 Mẫu giống chè ựược chia thành 6 nhóm khác nhau có quan hệ chặt chẽ về nguồn gốc và vùng ựịa lý.
Phân tắch ựa dạng di truyền của 19 dòng/giống lúa bằng 15 cặp mồi SSR cho thấy mức ựộ ựa hình lớn, dao ựộng từ 0,06 - 1. Dựa trên cơ sở ựa dạng di truyền của 19 dòng/giống lúa này, tổ hợp lúa lai TGMS-VN1 x D24 ựã ựược lựa chọn và dự ựoán cho ưu thế lai cao với khoảng cách di truyền 0,67 - 0,90 (Nguyễn Văn đồng và cộng sự, 1999) [6].
Ngoài ra, sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu 10 dòng/giống lúa có nguồn gốc khác nhau ựã xác ựịnh ựược tương ựồng di truyền dao ựộng từ 0,49 - 0,96. Các Mẫu ựã ựược phân loại thành các nhóm có khoảng cách di truyền khác nhau và sử dụng làm cơ sở ựể chọn bố mẹ cho chọn giống lúa lai (Võ Thị Minh Tuyền, 2007) [27].
Trong những năm gần ựây, việc sử dụng chỉ thị phân tử ở nước ta tập trung chủ yếu vào các tắnh trạng kháng sâu bệnh, chống chịu ựiều kiện bất lợi của môi trường và các tắnh trạng chất lượng. Vắ dụ, Lưu Ngọc Huyền (2005) [9] sử dụng 50 cặp mồi SSR ựể xác ựịnh tắnh kháng rầy nâu ở một số dòng/giống lúa. Kết quảựã xác ựịnh ựược 15 chỉ thị SSR nằm ở NST số 4 của hệ gen lúa và sử dụng làm chỉ thị trợ giúp ựể chọn lọc các cá thể mang gen kháng rầy nâu. Chỉ thị SSR RM234 liên kết với locut quy ựịnh hàm lượng protein (GPC) trong gạo ựược xác ựịnh nằm trên NST số 7 (Trương Bá Thảo và cộng sự, 2005) [20].
2.5. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong ựánh giá ựa dạng di truyền của ựậu tương tương
Rất nhiều loại chỉ thị phân tử khác nhau ựã ựược sử dụng trong nghiên cứu ựa dạng di truyền của ựậu tương.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ27
Trong ựánh giá 72 giống ựậu tương của Ấn độ, 12 mồi AFLP cho 1257/1319 ựoạn ựa hình (chiếm 95%). Các Mẫu giống nhìn chung có ựộựang dạng cao (Satyavathi và cộng sự, 2006) [65].
đặc biệt, 131 mẫu giống thu thập từ 14 nước trong khu vực châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam, Lào và Thái Lan, ựã ựược sử dụng ựểựánh giá ựa dạng di truyền với 20 mồi SSR. Các mồi cho trung bình 11,9 allen với thông tin di truyền PIC (Polymophism Information Content ) cao (0,78). Các mẫu thu từ Nhật Bản và Trung Quốc hình thành hai nhóm khác biệt hẳn nhau. Các mẫu thu từ Hàn Quốc thuộc cả nhóm Nhật Bản và Trung Quốc. Các mẫu còn lại thu từ các nước khác có hệ số tương ựồng cao với các mẫu thu từ Trung Quốc (Abe và cộng sự, 2003) [32].
Tương tự, Wang và Takahata (2007) [73] sử dụng 10 mồi SSR ựánh giá ựa dạng di truyền trên 45 và 60 mẫu giống ựậu tương dại (Glycine soja) từ Trung Quốc và Nhật Bản. Số băng ựoạn ADN thu ựược nhiều (từ 16 - 25) và 99% các ựoạn thu ựược là ựa hình. Mẫu giống giữa hai nước rất khác biệt nhau. Như vậy, Nhật Bản và Trung Quốc hai vốn gen ựậu tương chắnh của Châu Á.
Mặc dù có rất nhiều nghiên cứu về ựa dạng di truyền của ựậu tương trên thế giới, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu và ựánh giá vềựa dạng di truyền của ựâu tương Việt Nam. Cho ựến nay, mới có nghiên cứu sử dụng 20 mồi RAPD ựểựánh giá 50 mẫu giống ựậu tương. Số ựoạn thu ựược từ 2 - 6 ựoạn. Mặc dù 50 Mẫu giống ựược xếp vào 3 nhóm nhưng các mẫu giống có hệ số tương ựồng di truyền cao (> 0,57) chứng tỏ các mẫu giống có sự ựa dạng di truyền thấp (Phạm Thị Bé Tư, 2003) [24].
Vũ Thanh Trà và Trần Thị Phương Liên (2006) [22] ựã nghiên cứu sự ựa dạng di truyền trong phản ứng với bệnh gỉ sắt của một số giống ựậu tương, nhằm bước ựầu cung cấp thông tin di truyền, góp phần lưu giữ và duy trì
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ28
nguồn gen của một số giống ựậu tương ựịa phương vùng núi phắa Bắc cũng như giống ựược trồng ựại trà ở Việt Nam. Kết quả phân tắch trên 12 cặp mồi SSR cho thấy có 8 cặp mồi cho ựa hình và thu ựược 32 alen. Các mẫu giống không có sựựang dạng di truyền cao trong phản ứng với bệnh gỉ sắt do hệ số tương ựồng di truyền dao ựộng trong khoảng 0,58 Ờ 0,81.
Nguyễn đức Thuận Và Nguyễn Thị Lang (2006) [21] ựã tiến hành ựánh giá sự ựa dạng di truyền của 30 giống ựậu tương sưu tập tại ngân hàng gen của Viện Lúa đồng bằng Sông Cửu Long bằng 13 bộ mồi RAPD. Kết quả cho thấy có 9 bộ mồi cho ựa hình. 30 giống ựậu tương ựược chia thành 4 nhóm chắnh với mức ựộ tương ựồng di truyền nằm cao (0,80 Ờ 0,98) chứng tỏ các mẫu có sựựa dạng di truyền thấp.
Tóm lại, ựa dạng di truyền có vai trò quan trọng vì nó cung cấp nguồn gen cho công tác chọn giống. Chỉ thị phân tử là công cụ hữu ắch trong chọn tạo giống cây trồng .Trong các loại chỉ thị phân tử, chị thị SSR có nhiều ưu ựiểm hơn các chỉ thị khác như RFLP, ALFP và RAPD. đối với Việt Nam, cây ựậu tương là một loại cây công nghiệp ngắn ngày có ý nghĩa và giá trị về mặt kinh tế nên chọn tạo giống ựậu tương cũng ựã ựược chú trọng và tiến hành từ rất sớm. Tuy nhiên, chọn tạo giống ựậu tương vẫn chủ yếu dựa trên phương pháp truyền thống. Hơn nữa, cũng có rất ắt nghiên cứu ựánh giá ựa dạng di truyền của nguồn gen ựậu tương trong nước.
Do vậy, mục ựắch của ựề tài là ựánh giá ựa dạng di truyền ở ựậu tương sử dụng chỉ thị phân tử SSR và hình thái, từựó cung cấp thông tin cho công tác chọn tạo giống ựậu tương trong nước.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ29
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu gồm 36 mẫu giống ựậu tương (Bảng 3.1) do Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển ựậu ựỗ, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và TS. Vũ đình Chắnh (Bộ môn Cây công nghiệp, Khoa Nông học, Trường đại Học Nông nghiệp Hà Nội) cung cấp. Trong 36 mẫu giống này, 13 mẫu giống nhập nội, 17 mẫu giống ựịa phương, phần mẫu giống còn lại là những giống ựược chọn tạo trong nước bằng ựột biến hoặc lai.
3.2. Nội dung nghiên cứu
đánh giá sựựa dạng của các mẫu giống ựậu tương bằng chỉ thị hình thái. đánh giá sựựa dạng của các mẫu giống ựậu tương bằng chỉ thị phân tử SSR.
3.3. Gieo trồng và theo dõi các chỉ tiêu hình thái
để theo dõi các ựặc ựiểm sinh trưởng, hình thái và năng suất các mẫu giống ựược trồng ngoài ựồng trong vụ Xuân, từ tháng 2 ựến tháng 6 năm 2009 tại khu thắ nghiệm ựồng ruộng Khoa Nông học. Các mẫu giống ựược gieo theo ô diện tắch 2,5 m2/mẫu giống, không lặp lại, giống DT84 ựược dùng làm ựối chứng. Mỗi ô gồm 2 hàng, mật ựộ duy trì sau khi gieo là 30 cây/m2.
3.3.1. đặc ựiểm sinh trưởng và hình thái
Các tắnh trạng theo dõi ựểựánh giá ựược dựa trên phiếu mô tả và ựánh giá nguồn gen ựậu tương của Trung tâm tài nguyên di truyền thực vật Việt Nam (Bảng 3.2).
Các tắnh trạng ựược theo dõi bắt ựầu từ khi cây ựậu tương mọc (tùy theo từng tắnh trạng).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ30
Bảng 3.1. Nguồn vật liệu ựậu tương sử dụng trong ựánh giá ựa dạng di truyền
TT Mẫu giống Nguồn gốc TT Mẫu giống Nguồn gốc
1 DT84 đột biến từ dòng lai 8-33 19 đH4 tắm Chọn tạo trong nước 2 K6844 Giống nhập nội 20 Thanh Tiên Giống ựịa phương (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3 K9133 dạng 1 Giống nhập nội 21 đT12 đột biến
4 No-515526 Giống nhập nội 22 Phú Bình Giống ựịa phương
5 G82 Giống nhập nội 23 D907 Chọn tạo trong nước
6 4923 Giống nhập nội 24 H-666-1 Giống nhập nội
7 4924 Giống nhập nội 25 đậu Miên Giống ựịa phương
8 Palga Giống nhập nội 26 đậu Trắng Thuận Châu Giống ựịa phương
9 4981 Giống ựịa phương 27 Minh Tân Giống ựịa phương
10 4988 Giống ựịa phương 28 6666 Giống ựịa phương
11 đậu Bont Giống ựịa phương 29 Tuần Giáo Giống ựịa phương 12 D140 Tạo từ tổ hợp lai: DL02x đH4 30 Phong Niên Giống ựịa phương 13 đậu Phú Yên Gia Lai 1 Giống ựịa phương 31 TaiWan1 Giống nhập nội
14 đT2000 Nhập từ đài Loan 32 Sơn La Giống ựịa phương
15 Bắc Ngâm Giống ựịa phương 33 Ba Bể Giống ựịa phương 16 AK06 Chnhọn từ dòng 55 của giống
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ31
17 Thái Giao Giống ựịa phương 35 đVN10 Chọn tạo trong nước
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ32
* đánh giá mức ựộ nhiễm sâu bệnh hại, khả năng chống ựổ của các dòng, giống
đánh giá mức ựộ nhiễm ựối với một số sâu, bệnh hại chắnh của ựậu tương theo tiên chuẩn ngành 10TCN 339 Ờ 2006.
- Sâu ựục quả - Eitiella zinekenella (%):
Tỷ lệ quả bị hại = Số quả bị hại/tổng số quảựiều tra.
điều tra 10 cây ựại diện theo phương pháp 5 ựiểm chéo góc. - Sâu cuốn lá - Lamprosema indicata (%):
Tỷ lệ lá bị hại = Số lá bị cuốn/tổng số lá ựiều tra. điều tra 10 cây ựại diện theo phương pháp 5 ựiểm chéo góc.
- Bệnh gỉ sắt - Phakopsora pachyrhizi Sydow (cấp) và bệnh sương mai-
Peronospora manshurica (cấp); bệnh phấn trắng.
điều tra 10 cây ựại diện theo phương pháp 5 ựiểm chéo góc, trước thu hoạch
Rất nhẹ Cấp 1 (<1% diện tắch lá bị hại)
Nhẹ Cấp 3(1% ựến 5 % diện tắch lá bị hại)
Trung bình Cấp 5 (>5% ựến 25% diện tắch lá bị hại)
Nặng Cấp 7 (> 25% - 50% diện tắch lá bị hại)
Rất nặng Cấp 9 (>50% diện tắch lá bị hại)
- Bệnh lở cổ rễ-Rhizoctonia solani Kunh (%): ựiều tra ở thời kỳ cây con (sau mọc ≈ 7 ngày)
Tỷ lệ cây bị bệnh= Số cây bị bệnh/tổng số cây ựiều tra. điều tra toàn bộ các cây trên ô (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tắnh chống ựổ (ựiểm): điều tra toàn bộ các cây trên ô trước thu hoạch
Không ựổ điểm 1 (Hầu hết các cây ựều ựứng thẳng)
Nhẹ điểm 2 (<25% số cây bịựổ rạp)
Trung bình điểm 3 (25% - 50% số cây bị ựổ rạp, các cây khác nghiêng ≈ 45%)
Nặng điểm 4 (5 - 75% số cây bịựổ rạp)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ33
Bảng 3.2. Các tắnh trạng ựược ựánh giá
Tắnh trạng Phương pháp ựánh giá Tắnh trạng Phương pháp ựánh giá
Tắnh trạng chất lượng
Chu kỳ sinh trưởng Sớm Trung bình Muộn
Kiểu sinh trưởng 1- Hữu hạn 2- Vô hạn 3- Bán hữu hạn Màu thận hạ diệp 1- Xanh 2- Tắm
Hình dạng lá chét 3- Hẹp 5- Trung gian 7- Rộng Cuống lá 1- Không có 2- Có
Lông/lá 1- Không có 2- Có
Màu sắc lá 1- Xanh 2- Xanh nhạt 3- Xanh ựậm Mật ựộ lông 3- Thưa 5- Hơi thưa 7- Trung bình 9- Dày Màu lông 1- Xám 2- Nâu nhạt 3- Nâu
Dạng lông 1- Thẳng 2- Cong
Màu sắc cánh hoa 3- Trắng 5- Tắm ựậm 7- Tắm Màu sắc quả 3- Nâu nhạt 5- Nâu 7- đen Màu vỏ hạt 1- Vàng sáng 2- Vàng 3-Xanh Kiểu rốn hạt 1- Rốn nông 2- Rốn sâu
Màu rốn hạt 1- Trắng 2- Vàng 3- Nâu nhạt 4- Nâu 5-Nâu ựậm 6-đen
độ bóng của hạt 3- Bóng 5- Trung bình 7- đục Chất lượng hạt giống 1- Kém 2- Trung bình 3- Tốt
Hình dạng hạt 1-Elip 2- Trứng 3- Tròn dẹt 4- Tròn 5- Hình thận
Tắnh trạng số lượng
Thời gian sinh trưởng
- Thời gian từ khi gieo ựến khi 70% số cây ra hoa (ngày).
- Thời gian từ khi gieo ựến khi ựậu quả (ngày).
- Thời gian từ khi gieo ựến khi thu hoạch (ngày). Số lá chét 3 lá 4 - 6 lá
Số cành cấp 1/cây: đếm số cành cấp 1/10 cây/ô thắ nhiệm (cành).
độ dài cành cấp1: đo cành dài nhất/10 cây/ô thắ nghiệm (cm). Sốựốt/thân chắnh: đếm 10 cây/ô thắ nghiệm (ựốt).
Chiều cao cây cuối cùng: Khi thu hoạch ựo 10 cây/ô thắ nghiệm (cm)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ34
3.3.2. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất
Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất ựược xác ựịnh khi thu hoạch, bao gồm: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Số quả trên cây (quả/ cây): tổng số quả trên cây khi thu hoạch ựược ựếm trên 10 cây trên 1 ô thắ nghiệm. Tổng số quả ựược phân chia thành quả chắc, số quả 1 hạt, 2 hạt, 3 hạt và tắnh tỉ lệ phần trăm từng loại: + Tỷ lệ quả chắc (%) = x 100 + Tỷ lệ quả 1,2 hay 3 hạt (%) = x 100 - Khối lượng 1000 hạt (g) - Năng suất cá thể (g/cây) - Năng suất thực thu (tạ/ha) 3.4. Phân tắch chỉ thị SSR 3.4.1. Tách chiết ADN
Lá non của các mẫu giống ựược sử dụng ựể tách chiết ADN. Mẫu lá non của các mẫu giống sau khi thu có thể dùng ngay ựể tách chiết ADN hoặc bảo quả trong tủ lạnh ở - 850C ựể tách chiết sau.
Quy trình tách chiết ADN tổng sốựược tiến hành theo các bước sau: + Nghiền mẫu bằng chày và cối trong dung dịch Tris-HCl+SDS+H2O. Sau ựó chuyển ống eppendorf 1.5ml.
+ Ủ mẫu ở 650C trong 15 phút, trong 15 phút tiến hành ựảo 2 lần
+ Bổ sung 200ộl 5MK-acetate, lắc nhẹ rồi ựể trên ựá 30 phút (có thể ựể qua ựêm trong tủ lạnh)
+ Ly tâm ở 12.000 vòng/phút ở 20oC trong 20 phút
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ35
+ Ly tâm ở 12.000 vòng/phút ở 20oC trong 20 phút
+ Hút 500 ộl dung dịch nổi sang ống eppendorf 1.5ml mới + Cho 500 ộl ethanol (cồn tuyệt ựối), lắc ựều
+ Ly tâm ở 12.000 vòng/phút ở 20oC trong 20 phút và loại bỏ dịch nổi
+ Sau ựó tiến hành rửa 2 - 3 lần bằng cách cho 500 ộl ethanol 70%, lắc ựều rồi ly tâm với 12.000 vòng/phút ở 20oC trong 5 phút và loại bỏ dịch nổi
+ để khô ở 37oC trong 30 phút
+ Hòa tan trong 50 ộl TE, lắc ựều và bảo quản trong tủ lạnh ở -20oC.
3.4.2. Phản ứng PCR
10 cặp mồi ựược sử dụng ựể phân tắch SSR theo Wang and Takahata (2007) [73]. Trình tự 10 cặp mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) ựược trình bày trong bảng 3.3.
Các hóa chất gồm: Tris-HCl, EDTA (Ethylene diaminete traacetic acid), SDS (Sodium dodecyl sulfate: natri dodecyl sulfate), Buffer Dream, dNTP, MgCl2, Taq Dream, Agarose Ầ(Phụ lục 3) và 10 cặp mồi do công ty Fermentas cung cấp.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ36
Bảng 3.3. 10 cặp mồi SSR ựược sử dụng trong thắ nghiệm Chỉ thị
SSR Trình tự mồi
Nhiệt ựộ gắn mồi
(oC)
Satt228 F - TCATAACGTAAGAGATGGTAAAACT R - CATTATAAGAAAACGTGCTAAAGA 50 GSatt230 F - CCGTCACCGTTAATAAAATAGCAT R - CTCCCCCAAATTTAACCTTAAAGA 56 Satt242 F - GCGTTGATCAGGTCGATTTTTATTTGT R- GCGAGTGCCAACTAAACTACTTTTATGA 58 Satt245 F - AACGGGAGTAGGACATTTTATT R - GCGCCTCCTGAATTTCAAAGAATGAAGA 58
Satt279 F - GCGCAAAAGGACGCCCACCAATAG R - GCGGTGATCGGATGTTATAGTTTCAG 62 Satt309 F - GCGCCTTCAAATTGGCGTCTT R - GCGCCTTAAATAAAACCCGAAACT 58 Satt373 F - TCCGCGAGATAAATTCGTAAAAT R - GGCCAGATACCCAAGTTGTACTTGT 58 Satt521 F - GCGCTTCACTCTGGTGTAGTGTAG R - GCGTTAGATAACGACACATTATTA 59
Satt556 F - GCGATAAAACCCGATAAATAA R - GCGTTGTGCACCTTGTTTTCT 55 Satt565 F - GCGCCCGGAACTTGTAATAACCTAAT R - GCGCTCTCTTATGATGTTCATAATAA 59
Phản ứng PCR với tất cả 10 mồi ựược thực hiện trên máy PCR iCycler, với thể tắch phản ứng 25ộl, trong ựó chứa các thành phần phản ứng gồm: Bảng 3.4. Thành phần các chất tham gia phản ứng PCR Thành phần Nồng ựộ gốc Thể tắch cần lấy (ộl) H2O 19,4 10X buffer Dream 10X 2,5 dNTP 10mM 0,5
Primer Forward 10pmol/ộl 0,5
Primer Reverse 10pmol/ộl 0,5