Nghiên cứu tính đa hình AND của các dòng vải thiều Thanh Hà bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Hải Dương là nơi xuất xứ của giống vải thiều Thanh Hà nổi tiếng. Đây là giống vải quí của nước ta, với những ưu điểm hạt nhỏ, cùi dày, chất lượng quả ngon, có vị thơm đặc trưng mà các gi

MỞ ĐẦU

Hải Dương là nơi xuất xứ của giống vải thiều Thanh Hà nổi tiếng Đâylà giống vải quí của nước ta, với những ưu điểm hạt nhỏ, cùi dày, chất lượngquả ngon, có vị thơm đặc trưng… mà các giống vải khác không có.

Hiện nay, ở thôn Thuý Lâm, xã Thanh Sơn, huyện Thanh Hà, tỉnh HảiDương vẫn còn cây vải tổ của giống vải này Theo Hội những người làmvườn Việt Nam cho biết thì đây là cây vải thiều lâu năm nhất của nước ta.Tuổi của nó vào khoảng 180 năm [14].

Qua tìm hiểu, chúng tôi thấy rằng tất cả các cây vải thiều trồng ở ThuýLâm từ xưa tới nay đều là các thế hệ con cháu (cành chiết) của cây vải tổ này.Tìm hiểu các xã khác của huyện Thanh Hà, các địa phương khác của tỉnh HảiDương và các tỉnh khác như Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Tây, Hoà Bình, QuảngNinh , chúng tôi được nhân dân cho biết họ đều lấy giống vải thiều ở xãThanh Sơn, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương về trồng

Với nhu cầu về cây giống phục vụ cho việc mở rộng diện tích trồng vảingày càng cao đã dẫn tới tình trạng cây dùng làm giống bị kiệt sức do chiếtcành quá nhiều Trước đây, ở huyện Thanh Hà các cây vải cổ thụ dùng đểchiết cành làm giống thì nay hầu như không dùng được nữa Thay vào đó làsử dụng thế hệ con cháu của các cây vải này Mặt khác, vải là giống cây thụphấn chéo nên hạt phấn lẫn tạp không thuần Với những lý do đó có thể dẫnđến sự thoái hoá của giống bán ra, có những cây chất lượng quả không tốtbằng giống gốc Vì vậy, vấn đề đặt ra cho chúng ta là phải nghiên cứu tính đahình ADN của quần thể vải thiều trồng ở huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dươngđể đánh giá mức độ lẫn tạp và xác định sự chuẩn xác của giống.

Có rất nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để phân tích tính đahình ADN hệ gen như RFLP, AFLP, SSR Tuy nhiên, các phương pháp này

rất phức tạp, yêu cầu thông tin về trình tự cần nghiên cứu và đòi hỏi mộtlượng lớn ADN hệ gen nên chỉ có kỹ thuật RAPD (Random AmplifiedPolymorphic DNA - đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên) làđược sử dụng phổ biến.

Nói chung, RAPD là kỹ thuật đơn giản, ít tốn kém và có độ nhạy cao,dựa trên nguyên tắc của phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) với các mồi ADNkhông đặc thù để nhân bản các đoạn ADN một cách ngẫu nhiên Các đoạnADN nhân ngẫu nhiên có thể đa hình bởi các đoạn nhân có thể có trong mẫuADN của cá thể này nhưng lại không có trong mẫu ADN của cá thể khác[56].

Bằng kỹ thuật này, Sun và cộng sự đã khảo sát tính đa hình ADN của

các giống lúa mì xuân kháng bệnh Fusarium, Tongpamnak và cộng sự đã xác

định tính đa hình di truyền của các giống vải trồng tại Thái Lan Các kết quảthu được từ các nghiên cứu này không chỉ giúp các nhà khoa học đánh giámột cách chính xác mối quan hệ di truyền, tiến hoá giữa chúng mà còn tạo cơsở cho công tác lai tạo giống [1], [66], [67]

Có thể nói rằng, kỹ thuật RAPD là một công cụ hữu hiệu cho phân tíchtính đa hình ADN, lập bản đồ gen liên kết, xác định chỉ thị phân tử để phânbiệt các giống khác nhau cũng như phân tích con lai F1 của nhiều loài độngvật, thực vật và vi sinh vật [15], [20], [26].

Xuất phát từ những cơ sở nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu tính đa hình AND của các dòng vải thiều Thanh Hà bằng kỹ

thuật sinh học phân tử”

Chơng 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Giới thiệu chung về cây vải1.1.1 Phân loại, nguồn gốc và phân bố

1.1.1.2 Nguồn gốc, phân bố

Nguồn gốc cây vải là ở miền Nam Trung Quốc Hiện nay, ở núi Tạ HảiSơn (tỉnh Quảng Đông), núi Lôi Hồ Lĩnh, Kim Cổ Lĩnh (đảo Hải Nam), ởvùng phía nam của Xi Suang Ba Na (Vân Nam) còn có những cánh rừng cónhiều cây vải dại Đặc biệt núi Kim Cổ Lĩnh ở đảo Hải Nam vải dại mọc thànhrừng Lâm trờng Bạch Tinh đã chặt 534 ha rừng vải già để trồng cây khác,hiện còn 50 ha vải rừng xanh tốt Kim Cổ Lĩnh ở độ cao 600 - 700 m so vớimặt biển, tại đây có những cây vải già có chu vi thân 7,5 m [8].

Trung Quốc là nơi thuần hóa cây vải trớc tiên cách đây hơn 2000 năm.Đời Hán Vũ Đế Nguyên Đinh năm thứ 6 (111 năm trớc Công nguyên) đã cholập vờn vải trong cung vua, lấy cây từ Lĩnh Nam lên Đời nhà Tống, vào năm1059, Thái Tơng viết quyển “Lệ Chi Phổ” mô tả lịch sử vùng trồng, đặc điểmgiống, kỹ thuật trồng trọt, chăm sóc và chế biến Đây đợc coi là công trìnhxuất bản đầu tiên trên thế giới về cây vải [14], [37].

Cây vải có mặt ở Myanma, ấn Độ vào cuối thế kỷ 17, các nớc ở Đôngấn vào thế kỷ 18, Ôxtrâylia, Nam Phi, Hawaii vào cuối thế kỷ 19 Ngày nay,vải đợc trồng ở các nớc nằm trong phạm vi 20 - 30 vĩ độ Bắc và Nam đờngxích đạo gồm có các vùng sau [37]:

Châu á: Trung Quốc, ấn Độ, Thái Lan, Việt Nam, Myanma, Lào,Campuchia, Malaixia, Philipine, Inđonexia, Srilanka, Nhật Bản, Ixarael.

Châu Phi: Nam Phi, Môrithiuyt, Madagatca, Gabông, Cônggô.Châu Mỹ: Hoa Kỳ, Hoduras, Panama, Cuba, Pooctorico, Braxin.Châu úc: Ôxtrâylia, Niuzilân.

1.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ vải trên thế giới

Trên thế giới hiện nay có trên 20 nớc trồng vải, trong đó các nớc châu ácó diện tích và sản lợng lớn nhất Sản xuất vải có tính thơng mại gồm các nớc:Trung Quốc, ấn Độ, Thái Lan, ôxtrâylia, Reunion, Nam Phi, Mađagatxca,ixrael, Việt Nam… Diện tích vải trên thế giới năm 1990 là 183.700 ha với sản Diện tích vải trên thế giới năm 1990 là 183.700 ha với sảnlợng 251.000 tấn, năm 1999 sản lợng vải của thế giới khoảng 1,6 - 1,8 triệutấn [14].

Trung Quốc là nớc đứng đầu về diện tích và sản lợng vải, trong đó tỉnhQuảng Đông là tỉnh đứng đầu về cả diện tích và sản lợng Năm 1999, tỉnhQuảng Đông có 530.000 ha vải, diện tích cây cho quả mới chỉ 55,5% mà sảnlợng đã lên đến 950.000 tấn, chiếm gần 50% sản lợng vải của thế giới Năngsuất bình quân đạt 42,75 tạ/ha Dự báo 10 năm đầu của thế kỷ 21, sản lợng vảicủa tỉnh này sẽ đạt 0,8 - 1 triệu tấn [37]

ấn Độ là nớc đứng thứ hai về diện tích và sản lợng vải Theo Menzel vàSimpson, năm 1986 diện tích vải ở ấn Độ là 10.333 ha nhng đến năm 1998diện tích vải đã lên tới 56.000 ha với sản lợng là 310.000 tấn [36] ấn Độ chỉtrồng vải đợc ở vùng Đông Bắc, 95% diện tích vải là ở vùng đồng bằng rộnglớn bang Bihar Trên loại đất cát pha có nhiều canxi, pH = 8, tầng dày, tới tiêuthuận lợi nên cây vải sinh trởng và cho quả tốt Sản lợng vải của ấn Độ chacao, dân số lại đông nên chỉ cung cấp cho thị trờng trong nớc [36].

Theo Subhadrabandhu (1993), năm 1991, diện tích vải ở Thái Lan là15.045 ha, sản lợng 24.000 tấn trồng ở 9 tỉnh phía Bắc Trong đó, 90% diệntích vải toàn quốc tập trung ở Chiềng Mai và Chiềng Rai.

ở Thái Lan, vải là một trong những cây ăn quả có hiệu quả kinh tế, chủyếu cho nội tiêu, xuất khẩu khoảng 10% Năm 1993, xuất khẩu 1.477 tấn vảithu đợc 2,368 triệu đôla Mỹ, đứng thứ 4 (sau nhãn 11,908 triệu USD, sầuriêng 10,964 triệu USD, bởi 2,876 triệu USD) trong 9 loại hoa quả nhiệt đớixuất khẩu Năm 2002, diện tích vải của Thái Lan lên tới 23.000 ha với sản l-ợng vải thu hoạch là 80.000 tấn [36].

Trong những năm gần đây, diện tích và sản lợng vải của Việt Nam ngàycàng tăng Tính đến năm 1998, toàn bộ diện tích vải đã lên tới 25.000 ha vàsản lợng đạt 25.000 tấn (trong đó có 10.000 ha vải cha cho quả) [68].

Bảng 1 Diện tích trồng và sản lợng vải của một số nớc trên thế giới

(Thông tin khoa học kỹ thuật trồng vải, Quảng Đông, Trung Quốc 1990)

Tên nớcDiện tích trồng (ha)Sản lợng (tấn)

Trung QuốcThái Lanấn ĐộĐài Loan ÔxtrâyliaMađagatcaNam PhiMauritiusReunionMỹ

1.1.3 Cây vải ở Việt Nam

1.1.3.1 Nguồn gốc, phân bố, tình hình sản xuất và triển vọng.

ở Việt Nam, theo các tài liệu và th tịch cũ, cây vải đã đợc trồng cáchđây gần 2000 năm Dới thời Bắc thuộc, vải là một trong những cống vật hàngnăm Việt Nam phải nộp cho các vua Trung Quốc Năm 722, Mai Thúc Loanhiệu triệu những ngời dân phu phải đi gánh vải nộp cho chính quyền nhà Đ-ờng nổi dậy khởi nghĩa [14].

Điều đó cho thấy, cây vải có ở nớc ta và là một sản vật quý Vậy ViệtNam có phải là quê hơng của cây vải không? Theo tài liệu của Pháp để lại thìcó những cây vải dại mọc ở sờn núi Ba Vì, tỉnh Hà Tây Vào năm 1982, Giáos Vũ Công Hậu đã gặp ở chân núi Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc một số cây vảidại có cùi mỏng ăn chua và cho rằng “Việt Nam cũng là một trong những nơiđã thuần hóa và trồng vải sớm, có điều kiện tự nhiên thích hợp để phát triểncây vải” [37].

Vùng phân bố tự nhiên cây vải của nớc ta từ 18 - 190 vĩ Bắc trở ra ởmiền Nam khí hậu đặc trng nhiệt đới, mùa đông nhiệt độ quá cao, vải khôngphân hóa mầm hoa đợc nên không có quả Vùng trồng vải chủ yếu của ViệtNam là vùng đồng bằng sông Hồng, trung du, miền núi Bắc Bộ và một phầnkhu 4 cũ Những vùng trồng vải lớn, nổi tiếng trong nớc nh Lục Ngạn (BắcGiang), Thanh Hà, Chí Linh (Hải Dơng), Đông Triều (Quảng Ninh) có diệntích vải từ 3.000 - 7.000 ha Ngoài ra, còn có vờn vải giống chín sớm dọc sông

Đáy, thuộc các huyện Đan Phợng, Hoài Đức, Chơng Mỹ, Thanh Oai, QuốcOai (tỉnh Hà Tây) [8].

Vải là cây ăn quả đặc sản của miền Bắc, có giá trị dinh dỡng cao Nếulà giống tốt, phần ăn đợc (cùi) chiếm 70 - 80%, vỏ từ 8 - 15%, hạt từ 4 - 18%khối lợng quả Trong 100 g phần ăn đợc có: nớc - 77,69 g, năng lợng - 335 kJ,protein - 0,94 g, lipit - 0,29 g, hydratcacbon - 20,77 g, xơ - 0,16 g, tro - 0,37 g,các chất khoáng (Ca - 4 mg, Fe - 0,37 mg, Mg - 16 mg, P - 35 mg, K - 255mg, Na - 7 mg) và các vitamin (vitamin C - 40,2 mg, B - 0,035 mg, B2 - 0,084mg, PP - 1,91 mg) Nớc ép từ cùi ra có độ Brix cao 19 - 21 (đu đủ, cam, quít,bởi chỉ có 9 - 12) Độ chua từ 0,2 - 0,5 Tỷ lệ đờng vào loại tốt, thích hợp chokhẩu vị cả ngời châu á lẫn ngời châu Âu, có mùi thơm thanh khiết, do đó từlâu vải đã đợc coi là một trong những loại quả nhiệt đới ngon nhất Sách TrungQuốc viết “Vải bổ não, khoẻ ngời, khai vị, có thể chữa bệnh đờng ruột, là mộtthực phẩm quí đối với phụ nữ và ngời già” [14]

Quả vải ngoài ăn tơi còn đợc chế biến thành các sản phẩm có giá trị: nớcvải, vải hộp, vải khô Vỏ quả, thân cây và rễ có nhiều tanin có thể dùng làmnguyên liệu trong chế biến các loại thuốc và một số ngành công nghiệp khác.

Trồng vải không phải chỉ để lấy quả mà còn để phục vụ cho việc nuôiong lấy mật Hoa vải là nguồn mật nuôi ong có chất lợng cao, trong một vụhoa vải nếu đặt một thùng ong có thể thu đợc 20 - 30 kg mật Hạt vải còn đợcdùng làm thuốc chữa một số bệnh đờng ruột, mụn nhọt Hạt vải chứa nhiềutinh bột (37%) nên còn có thể dùng để lên men rợu, làm giấm [6].

Gỗ vải là một loại gỗ quí, bền, không bị mọt đục, có thể dùng xây dựngnhà cửa, để đóng đồ gỗ Cây vải trồng làm cây cảnh rất đẹp Tán tròn, tự tạolấy, không phải đốn tỉa phức tạp, màu lá xanh thẫm, mặt trên bóng, bốn mùa t-ơi tốt góp phần cải thiện điều kiện môi trờng.

Ưu thế lớn của cây vải là tính thích ứng mạnh, dễ trồng Vải lại chịu đấtchua, đất dốc là loại đất phổ biến ở vùng đồi núi phía Bắc nớc ta Tác hại dobão lụt cũng ít do quả chín vào tháng 5, 6 khi bão mới chỉ bắt đầu Tháng 11,12, khi đọt hoa bắt đầu hình thành thì trời bắt đầu rét và hạn giúp kích thích rahoa Tháng 4, 5, khi quả sắp chín cần nhiều nớc lại là lúc bắt đầu mùa ma, khíhậu ẩm ít khi thiếu nớc [6].

Trồng vải trong vờn gia đình mang lại thu nhập khá cao so với các câyăn quả khác (cam, chuối, hồng xiêm… Diện tích vải trên thế giới năm 1990 là 183.700 ha với sản) Nhân dân cho biết cùng trên một đơnvị diện tích, nếu trồng vải thiều sẽ thu giá trị kinh tế gấp 6 lần trồng lúa.

ở huyện Lục Ngạn (Bắc Giang) nhờ trồng vải thiều mà từ một huyệnmiền núi đói nghèo đã trở thành một huyện giàu có Năm 1998, hàng chục hộnông dân có thu nhập từ 20 - 90 triệu đồng Năm 1998, giá trị thu nhập củahuyện đạt 105 tỷ đồng, riêng vải thiều đạt 65 tỷ, gấp 4 lần so với năm 1994.Năm 1998, Lục Ngạn có 7092 ha vải đạt đợc che phủ đất khoảng 35% trongkhi đó chỉ tiêu quốc gia về độ an toàn che phủ là 40% [14].

Mấy năm gần đây phong trào làm vờn đang phát triển mạnh Nhiều tỉnhnh Thái Nguyên, Hoà Bình, Hà Tây, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Yên Bái, Lào Cai,Lạng Sơn, Thanh Hoá, Nghệ An,… Diện tích vải trên thế giới năm 1990 là 183.700 ha với sản đang có kế hoạch tăng diện tích cây trồngvà coi vải thiều nh một cây chủ lực trong cơ cấu cây ăn quả trong vờn Theo sốliệu của Tổng cục Thống kê năm 1997, diện tích trồng vải thiều ở miền Bắc là25.114 ha, trong đó có 10.313 ha đang ở độ tuổi cho thu hoạch, sản lợng đạt27.193 tấn Căn cứ vào số liệu này, Việt Nam đợc coi là nớc đứng thứ haitrong danh sách nêu ở bảng 1 về diện tích và sản lợng vải.

Do diện tích vải ngày càng tăng và mở rộng ở nhiều tỉnh phía Bắc, sảnlợng cao, chín tập trung, chủ yếu tiêu thụ trong nớc nên giá bán thấp Vì vậy,chiến lợc phát triển của nớc ta hiện nay là nâng cao diện tích trồng song songvới việc nâng cao chất lợng giống, tìm các giống khác nhau để rải vụ, cải tiếncông nghệ sau thu hoạch và tăng cờng xuất khẩu.

Xuất phát từ nhận thức này và do nớc ta là một nớc nông nghiệp vớikhoảng 80% dân số sống ở vùng nông thôn nên các nghiên cứu cơ bản nhằmtìm kiếm và phát hiện ra các nguồn gen quí trong quỹ gen của các giống câytrồng có giá trị kinh tế cao trong sản xuất nông nghiệp, nh cây ăn quả đặc sảnvải thiều Thanh Hà, sẽ không chỉ có ý nghĩa khoa học cơ bản, mà còn gópphần thiết thực vào việc bảo tồn và phát triển sự đa dạng sinh học của các câyăn quả nói riêng và các giống cây trồng ở nớc ta nói chung.

1.1.3.2 Giống vải thiều Thanh Hà

ở Việt Nam, hiện có 3 nhóm giống vải chủ yếu đó là: vải chua, vải nhỡvà vải thiều Vải chua hay còn gọi là vải ta là giống vải địa phơng, trồng từ lâuđời bằng hạt nên đặc tính không ổn định, ăn quả có vị chua, chất lợng nói

chung thấp hơn vải thiều Vải nhỡ (vải lai) là giống vải lai giữa vải chua và vảithiều Vải thiều còn gọi là vải Tàu vì ngời ta cho rằng nó đợc đa từ TrungQuốc sang Giống vải này hiện nay có hai loại là vải thiều Phú Hộ (Phú Thọ)và vải thiều Thanh Hà (Hải Dơng) [14]

Hình 1 Cây vải thiều tổ tại thôn Thuý Lâm

(ảnh: Nguyễn Văn Hợi)

Cây vải thiều Thanh Hà có tán tròn, cành và lá nhỏ, nhiều chùm quả ng quả tha, quả hình cầu, cuống quả cắm xiên, gai trung bình Quả chín cómàu đỏ trên nền hơi vàng Quả nặng 18 - 20 g Tỷ lệ cùi 72 - 76% Độ Brix 19- 20 Quả cha chín hẳn ăn đã tốt, độ chua 0,4%

nh-Vải thiều Phú Hộ là giống nhập nội từ trớc năm 1945 ở Trung tâmnghiên cứu chè và cây ăn quả Phú Hộ (Phú Thọ) Chùm nhiều quả, quả to 25-27 g nhng ít chùm Khi chín quả có màu đỏ sẫm, hình trái tim, vai quả hơinghiêng, hình gai nhiều cạnh, độ lớn không đều Hạt cũng vậy, to nhỏ khôngđều (hạt to nhất 3,5 g, hạt bé nhất 0,4 g), trọng lợng trung bình 1,8 g Tỷ lệphần ăn đợc trên dới 70%, độ khô 20 - 21%, cao hơn vải thiều Thanh Hà, độchua cũng cao hơn Theo đánh giá của nhà máy hoa quả Tơng Mai (Hà Nội)thì vải thiều Phú Hộ làm đồ hộp rất tốt, tuy nhiên không bằng vải thiều ThanhHà

Hiện nay, cha có ai nghiên cứu tuổi thọ của cây vải thiều ở nớc ta nhngtheo Hội những ngời làm vờn Việt Nam (VACVINA) thì cây vải thiều lâunăm nhất của nớc ta đợc trồng ở thôn Thuý Lâm, xã Thanh Sơn, huyện ThanhHà, tỉnh Hải Dơng Đây là cây vải thiều đầu tiên đợc trồng ở Việt Nam và vìvậy đợc gọi là cây “Vải Tổ” của giống vải thiều Thanh Hà Cây vải này cónguồn gốc từ Thiều Châu - Trung Quốc, nên giống vải Thanh Hà đợc gọi làvải thiều Thanh Hà [14].

Qua tìm hiểu thấy rằng tất cả các cây vải thiều trồng ở Thuý Lâm từ xatới nay đều là các thế hệ con cháu (cành chiết) của cây vải tổ này Tìm hiểucác xã khác của huyện Thanh Hà, các địa phơng khác của tỉnh Hải Dơng vàcác tỉnh khác nh Bắc Giang, Hà Tây, Hoà Bình, chúng tôi đợc nhân dân chobiết họ đều lấy giống vải thiều từ xã Thanh Sơn, huyện Thanh Hà Hiện nay, ởThanh Sơn có một bộ su tập “sống” các cây vải thiều có tuổi cây từ vài nămđến khoảng 180 năm tuổi Một số cây đợc dùng làm giống gốc để chiết cành,nhng do chiết quá nhiều cành nên cây vải mẹ bị kiệt sức, thoái hoá giống và l-ợng cây giống không đủ cung cấp cho việc mở rộng diện tích trồng.

Vì vậy, vấn đề đặt ra cho các nhà khoa học là phải nghiên cứu tính đahình ADN hệ gen của quần thể vải thiều Thanh Hà để đánh giá mức độ lẫntạp, xác định phẩm chất của giống, bảo tồn và phát triển nguồn gen quí.

Hiện nay, một trong những kỹ thuật tỏ ra có tính u việt để đánh giá tínhđa hình di truyền của sinh vật nói chung và tính đa hình ADN hệ gen của cácquần thể vải nói riêng là kỹ thuật RAPD

sống nh E.coli hoặc nấm men [4]

1.2.1.2 Nguyên tắc của phơng pháp PCR

Về cơ bản PCR là một phơng pháp in vitro cho phép nhân bản nhanh

một đoạn ADN dựa trên cơ sở đặc tính hoạt động của các ADN polymerase.ADN polymerase có mặt tự nhiên trong các cơ thể sống Chúng thực hiệnchức năng sao chép ADN trớc khi tế bào phân chia Chúng liên kết với một sợiADN đơn và tổng hợp nên một sợi đơn mới bổ sung với sợi ban đầu, từ vị trímồi (một trình tự ADN ngắn) đã bắt cặp sẵn với khuôn

ở phơng pháp mà Kary Mullis đa ra ban đầu, enzym đợc sử dụng in

thành hai sợi đơn thì ADN polymerase bị mất hoạt tính Cho nên việc bổsung thêm enzym sau giai đoạn gia nhiệt của mỗi chu kỳ đã làm cho phơngpháp này trở thành phơng pháp kém hiệu quả, tốn thời gian, yêu cầu một l-ợng ADN polymerase quá lớn và phải theo dõi liên tục trong suốt quá trìnhPCR [4].

Về sau phơng pháp này đợc cải tiến bằng cách sử dụng ADNpolymerase tách từ vi khuẩn a nhiệt sống ở các suối nớc nóng trên 110oC.ADN polymerase tách từ các vi khuẩn này bền nhiệt (bền vững ở nhiệt độ cao)và trong phản ứng PCR nó không bị mất hoạt tính khi hỗn hợp gia nhiệt đểtách các sợi ADN Do vậy, không cần thiết phải bổ sung thêm ADNpolymerase mới vào mỗi chu kỳ và quá trình nhân bản một sợi ADN cần lựachọn có thể đợc đơn giản hoá và thực hiện tự động [56].

Phản ứng PCR là một quá trình tơng đối đơn giản, gồm một chuỗi cácphản ứng với nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn [4]:

+ Giai đoạn 1 (biến tính): ADN đợc biến tính ở nhiệt độ khoảng 950Ctrong thời gian khoảng 1 phút, khi đó các liên kết hidro bị đứt và sợi ADN képtách thành hai sợi đơn.

+ Giai đoạn 2 (gắn mồi): ở nhiệt độ từ 300C đến 650C trong khoảng 30giây đến 1 phút thì các mồi bắt cặp với sợi ADN khuôn theo nguyên tắc bổsung ở hai đầu đoạn ADN cần nhân Nhiệt độ của bớc gắn mồi tùy thuộc vàotừng loại mồi cụ thể, đợc tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạnmồi.

Công thức tính nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi:

Tm = 81,5 + 16,6(log10 {J+}) + 0,41(%G + C) - (600/I) - 0,63(%FA)Trong đó: {J+}: nồng độ của các cation hóa trị I

FA : chất dùng để gây biến tính ADN I : chiều dài của mồi

+ Giai đoạn 3 (tổng hợp ADN): ở nhiệt độ khoảng 720C, trong khoảngthời gian từ 30 giây đến nhiều phút (tuỳ thuộc vào chiều dài đoạn ADN cần

tổng hợp), khi đó, enzym Taq polymerase hoạt động và quá trình tổng hợp

ADN diễn ra trên những đoạn giữa cặp mồi theo chiều từ 5’- 3’

Một chu kỳ gồm 3 bớc trên đợc lặp đi lặp lại nhiều lần và qua mỗi lầnlàm tăng gấp đôi số mẫu lần trớc Sự tăng lợng mẫu này theo cấp số nhân, nênsau n chu kì số mẫu thu đợc là:

A = x 2nTrong đó A: Tổng số bản sao ADN

x: Số lợng phân tử ADN làm khuôn ban đầu n: Số chu kỳ

Số chu kỳ lặp lại của phản ứng PCR trung bình vào khoảng 30 - 40 chukỳ, tuỳ theo yêu cầu.

1.2.1.3 Thành phần của phản ứng PCR

Các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR gồm: ADN khuôn, hai

đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN, Taq polymerase, hỗn

hợp bốn tiền chất deoxyribonucleotit, dung dịch đệm chứa một số cation hóatrị 1, ion Mg2+ và dung môi (nớc khử ion, vô trùng) [4], [56].

- ADN khuôn (template)

ADN khuôn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng PCR nên đòi hỏi phải cóđộ tinh sạch cao ADN khuôn có thể là sợi đơn hoặc sợi đôi của chuỗi ADNhay ARN, đợc biết trớc trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi Thông thờng nồngđộ của ADN khuôn đợc đa vào phản ứng PCR khoảng 10 - 500 ng.

- Đoạn mồi (primer)

Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đợc chọn để chặn hai đầu của đoạnADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới đợc bắt đầu tại mỗiđoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia

Các đoạn mồi thực chất là các oligonucleotit dài khoảng 6 - 10 nucleotit(đối với mồi ngẫu nhiên) hoặc khoảng 12 - 24 nucleotit (đối với mồi đặc trng)nhng không quá 50 nucleotit Việc lựa chọn độ dài của đoạn mồi và nhiệt độđể tách chúng phụ thuộc vào một số điều kiện Thứ nhất, nhiệt độ nóng chảycủa một đoạn mồi (không đợc nhầm lẫn với nhiệt độ nóng chảy của ADNtrong bớc đầu tiên của phản ứng PCR) đợc xác định thấp hơn nhiệt độ mà mồisẽ bắt cặp với ADN khuôn và cao hơn nhiệt độ mà mồi sẽ tách ra khỏi ADNkhuôn Thứ hai, nhiệt độ nóng chảy tăng theo độ dài của mồi Những mồi quángắn sẽ bắt cặp tại một vài vị trí trên sợi ADN khuôn dài và nh vậy sẽ tạo ra

các bản sao không đặc hiệu Mặt khác, độ dài của mồi bị giới hạn bởi nhiệt độcần thiết để làm nóng chảy nó Nếu nhiệt độ nóng chảy quá cao (trên 80oC)cũng có thể là nguyên nhân của các vấn đề vì ADN polymerase sẽ giảm hoạtđộng Vì vậy, chiều dài thích hợp của mồi khoảng 20 nucleotit với nhiệt độnóng chảy vào khoảng từ 50oC - 60oC.

Nói chung, cặp mồi đặc trng cần đáp ứng các yêu cầu sau:+ Không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngợc.+ Mồi không có cấu trúc thứ cấp.

+ Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngợc không quá lớn, tối uvới các đoạn nhỏ hơn 1Kb.

+ Tm của mồi xuôi và mồi ngợc không chênh nhau quá xa.+ Các cặp mồi chọn phải đặc trng cho trình tự ADN cần nhân,không trùng với trình tự lặp lại trên gen.

Nồng độ mồi thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 10 - 20 pM/25

μl hỗn hợp phản ứng Lợng mồi đa vào phản ứng PCR phải phù hợp với lợngADN cần tổng hợp (thờng 106 phân tử ADN cần 108 phân tử mồi) Nếu nồngđộ mồi quá thấp thì mồi sẽ hết trớc khi số chu kỳ kết thúc, còn nồng độ mồiquá cao thì sẽ dễ làm tăng sản phẩm không đặc hiệu.

Các đoạn mồi cần có tính đặc thù để làm tăng tính đặc hiệu của phảnứng Mồi phải đợc thiết kế sao cho không đợc bổ trợ lẫn nhau, số lợng 4 loạibazơ nitơ trong mồi nên xấp xỉ nhau, lợng G - C giữa hai mồi phải bằng nhau,tránh những vùng trình tự không bình thờng nh polypurine hoặc polypymidinehay các trình tự lặp.

- Taq polymerase

ADN polymerase bền nhiệt đầu tiên đợc tách từ vi khuẩn Thermus

aquaticus và đợc gọi là Taq Hiện nay Taq ADN polymerase đợc sử dụng rất

rộng rãi trong các phản ứng PCR Tuy nhiên, sự sao chép nhờ Taq ADN

polymerase có tỷ lệ sai sót khá cao (10-4, có nghĩa là cứ 10.000 nucleotit thìenzym gắn sai một nucleotit) Đặc tính này không gây ảnh hởng nghiêm trọngnếu ta chỉ cần xem xét kích thớc hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại,nhng có ý nghĩa rất lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotit củaADN

Ngày nay, nhiều enzym loại polymerase chịu nhiệt đã đợc đa ra thị

tr-ờng với nhiều chức năng chuyên biệt và hoàn thiện nh Tth polymerase, Pwovà Pfu Tth pol đợc tách chiết từ Thermus thermophilus có khả năng hoạt động

nh một enzym phiên mã ngợc khi có mặt ARN khuôn và ion Mn2+, nhng vớisự có mặt của ADN khuôn và ion Mg2+ thì Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch

đại ADN Enzym này cho phép khuếch đại bản mẫu là ARN thông qua sự

hình thành cADN Pwo và Pfu đợc tách từ các Archaea, có cơ chế đọc và sửa

lỗi do vậy có khả năng làm giảm đáng kể số lợng các đột biến xảy ra trongtrình tự ADN đợc nhân bản Hiện nay ngời ta thấy rằng, việc kết hợp giữa các

enzym này và Taq polymerase có thể tạo ra phân tử ADN có độ chính xác và

độ tin cậy cao.

Enzym Taq có trọng lợng phân tử là 94 kDa, không mất hoạt tính ở

nhiệt độ cao trong giai đoạn gây biến tính ADN nhng giảm 50% hoạt tính sau150 phút ở nhiệt độ 92,50C, sau 40 phút ở nhiệt độ 950C và sau 5 - 6 phút ởnhiệt độ 970C Nếu nhiệt độ tăng lên tới 950C trong 20 giây để biến tính ADN

kép thành sợi đơn thì hoạt tính enzym Taq còn lại 65% sau 50 chu kì phản ứng

Nồng độ enzym Taq tối u cho phản ứng PCR là 0,5 - 2,5 đơn vị, nhng

nếu nồng độ enzym quá cao sẽ làm giảm hiệu xuất xúc tác của phản ứng.Ngoài ra, nồng độ Mg2+ và dNTP cũng ảnh hởng đến hoạt tính của enzym

- Các nucleotit (dNTPs)

Hỗn hợp dNTPs bao gồm bốn loại deoxyribonucleotit (dATP, dTTP,dGTP, dCTP) Tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu, các nhà khoa học còn cóthể sử dụng một số nucleotit đã đợc thay đổi nh gắn thêm biotin hoặcdigoxigenin Nồng độ phản ứng của các dNTPs thờng dùng vào khoảng 200mM mỗi loại, tuy nhiên ở nồng độ dNTPs thấp (10 - 100 mM), Taq ADNpolymerase hoạt động chính xác hơn Hơn nữa, nồng độ tối u của chúng phụthuộc vào rất nhiều yếu tố nh:

+ Nồng độ Mg2+ + Nồng độ chất mồi

+ Độ dài của sản phẩm đợc khuếch đại + Số chu kỳ của phản ứng

- Dung dịch đệm PCR (buffer)

Thành phần của dung dịch đệm PCR phụ thuộc vào loại enzympolymerase đợc sử dụng Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg2+.Ion Mg2+ làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của ADN mạch đôi, tạo ra phứcchất tan với dNTPs để hình thành cơ chất mà enzym polymerase có thể nhậnra, điều này rất cần thiết cho quá trình liên kết của các dNTPs Nồng độ Mg2+trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5 - 5,0 mM (nồng độ này cóthể thay đổi khi cần thiết) Nồng độ ion Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm khả năngtổng hợp của enzym polymerase, còn nếu nồng độ quá cao sẽ tạo ra nhữngphân đoạn không đặc hiệu.

Nhìn chung, nồng độ MgCl2 có ảnh hởng nhiều tới hiệu quả và tính đặcthù của phản ứng Ngoài Mg2+ còn một số chất khác trong dung dịch đệm nhAMSO, DMSO, formamide đợc thêm vào nh các chất phụ gia nhằm tạo ra cácsản phẩm PCR có kính thớc lớn [56].

1.2.1.4 ứng dụng của phơng pháp PCR

Từ khi đợc Kary Mullis đề xuất và hoàn thiện, phơng pháp PCR đã cónhững ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, cả trongkhoa học công nghệ và đời sống xã hội.

Phơng pháp PCR đủ nhạy để tìm ra lợng ADN ít ỏi trong mọi loại mẫu.Nó đợc sử dụng để tách dòng các đoạn ADN từ các xác ớp và những động vậttuyệt chủng nh loài voi mamut có lông, qua đó tạo ra các lĩnh vực mới về khảocổ học phân tử và cổ sinh vật học phân tử Ngoài lợi ích đối với việc tách dòngADN, nó còn là một công cụ hữu hiệu trong pháp y Nó cũng đợc sử dụng đểchuẩn đoán virut trớc khi chúng gây nên các triệu chứng hay gây ra các đápứng miễn dịch trông thấy hoặc trong phát hiện các bệnh di truyền trớc khi sinh[56].

Những ứng dụng thực tiễn đa dạng của phơng pháp PCR thật vô cùngtận Nếu nh năm 1985 mới có 3 công trình đợc công bố về PCR thì chỉ 5 nămsau, kỹ thuật này đã đợc sử dụng trong hàng nghìn phòng thí nghiệm trênkhắp thế giới Ngay ở nớc ta, kỹ thuật PCR cũng đang đợc dùng trong nhiềutrờng đại học, viện nghiên cứu và ngày càng trở nên phổ biến Phản ứng chuỗitrùng hợp thực sự đã đa lại một cuộc cách mạng trong lĩnh vực ứng dụng thựctế của di truyền học phân tử [4].

Hiện nay, kỹ thuật PCR giúp ích hữu hiệu cho việc xác định trình tựnucleotit của các đoạn ADN đợc nhân, giúp phát hiện đột biến, cho phép phântích liên kết gen từ những tế bào riêng lẻ thậm chí có thể giúp nghiên cứu quátrình tiến hoá ở mức độ phân tử Một trong những ứng dụng của phản ứngPCR trong phân tích quá trình tiến hoá là kỹ thuật RAPD.

1.2.2 Kỹ thuật RAPD

1.2.2.1 Nguyên lý của phơng pháp RAPD

Trong những năm qua, với sự ra đời của sinh học phân tử và công nghệgen, một ngành khoa học mới đã xuất hiện: Phân loại học phân tử (moleculartaxonomy), chủ yếu dựa trên các kỹ thuật phân tích ADN Các kỹ thuật “điểmchỉ ADN” phân tích và so sánh trình tự nucleotit của các đoạn ADN đã giúpcho việc phát hiện các loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phânloại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và tiến hoácủa nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật [56].

Các kỹ thuật đợc sử dụng trong phân loại phân tử bao gồm: kỹ thuậtisozym (đồng enzym), các kỹ thuật phân tích đoạn ADN nh phơng pháp đahình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment LengthPolymorphism - RFLP), các kỹ thuật trên cơ sở của phản ứng PCR nh ADNtiểu vệ tinh (Simple Sequence Repeats - SSR), đa hình các đoạn ADN nhânbản ngẫu nhiên (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA), đa hìnhchiều dài các đoạn ADN nhân bản (Amplified Fragment LengthPolymorphism - AFLP), kỹ thuật điểm chỉ ADN đa locus, lai ADN, phân tíchtrình tự ADN

- Kỹ thuật AFLP cho phép ta phát hiện đợc tính đa dạng về chiều dàicác đoạn ADN đợc nhân bản chọn lọc - cắt ra bởi enzym giới hạn Sử dụng kỹthuật này có thể nhân cùng một lúc một cách đặc trng với số lợng lớn cácđoạn ADN có kích thớc giới hạn Kỹ thuật AFLP kết hợp đợc những u điểmcủa RFLP và RAPD nên nó có hiệu quả trong việc phát hiện đa hình ADN.Ngoài ra, kỹ thuật này có thể phân tích tính đa hình một cách nhanh chóng, ổnđịnh và đáng tin cậy [42].

- Kỹ thuật RFLP đợc sử dụng để tạo nên các đoạn cắt có chiều dài khácnhau, đợc phân biệt bằng phơng pháp điện di Nhợc điểm của kỹ thuật này là

quy trình phức tạp, cồng kềnh, khó tự động hoá, tốn kém và sử dụng chất đồngvị phóng xạ gây nguy hiểm cho ngời thao tác [4], [9].

- Kỹ thuật SSR dựa trên các đoạn ADN có sự lặp lại của một trật tựnucleotit đơn giản nào đó Kỹ thuật SSR cho phép phát hiện đợc tính đa hìnhvề độ dài các trật tự nucleotit đơn giản Nhợc điểm của kỹ thuật SSR là tốnkém về tiền của, công sức trong việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locusđa hình (để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự mộtsố lợng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa đoạn lặp lại) [9]

- Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phối hợp phản ứng sử dụng polymerasecủa phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) với các mồi ADN không đặc thù để nhâncác đoạn ADN một cách ngẫu nhiên Các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên có thểđa hình bởi các đoạn nhân có thể có trong mẫu ADN của cá thể này nhng lạikhông có trong mẫu ADN của cá thể khác [73].

Năm 1990, William và cộng sự đã phát triển kỹ thuật RAPD dựa trên cơsở của phơng pháp PCR Về cơ bản, kỹ thuật này sử dụng những đoạn mồingắn khoảng 4 - 10 nucleotit ngẫu nhiên để tiến hành phản ứng PCR Sảnphẩm PCR khi dùng với mồi ngẫu nhiên thờng đa dạng, có chiều dài từ 100 -5000 nucleotit và khi điện di trên gel agarose đợc phân tách thành các phânđoạn khác nhau Tính đa dạng thu đợc nhờ kỹ thuật RAPD là đáng tin cậy vìkhi có các đột biến hay sự sắp xếp lại một số nucleotit nào đó ở vị trí gắn mồithì nó sẽ ngăn cản việc gắn kết của mồi vào ADN khuôn Ngoài ra, sự mấtđoạn nhiễm sắc thể, sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng nh sự xen vào của mộtgen nào đó có thể sẽ làm thay đổi kích thớc của đoạn ADN đợc nhân bản Dovậy, mỗi đoạn mồi có thể tạo ra một hoặc một vài sự đa dạng, có thể phát hiệnđợc và cho ra phổ điện di đặc trng trên biểu đồ RAPD [7].

Thông qua các biểu đồ RAPD Apostol và cộng sự (1993), đã xây dựngkỹ thuật phân nhóm để thiết lập mối quan hệ giữa các loài hay nhóm loài [18].

Nguyên lý qui trình này dựa trên 3 bớc:

B1: So sánh từng cặp đối tợng trong nghiên cứu bằng cách tính toánkhoảng cách quan hệ giữa chúng.

B2: Lập ma trận gồm tất cả những giá trị tính đợc trớc đó.

B3: Giải ma trận và biểu diễn thành một biểu đồ đặc trng Các giá trịbiểu diễn khoảng cách giữa các cá thể đợc thiết lập theo hệ số tơng đồng củaNei và Li (1985).

1.2.2.2 ứng dụng của kỹ thuật RAPD trong đánh giá đa hình ADN

Kỹ thuật RAPD đợc sử dụng để phân tích và xác định mối quan hệ thânthuộc giữa các loài hay giữa các cá thể để phục vụ cho công tác lai tạo hoặcphân loại Chúng cũng đợc sử dụng nh những chỉ thị phân tử để xác địnhnhững gen kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở cây trồng,nh tính trạng chất lợng chất lợng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virut ở càchua [9], [30].

Ưu điểm của kỹ thuật này là nhanh, rẻ và cho phép tiến hành với số ợng mẫu lớn Kỹ thuật RADP không yêu cầu mẫu dò ADN, không cần biếtthông tin về trình tự đoạn ADN cần nghiên cứu, quy trình tiến hành nhanh, chỉcần một lợng nhỏ ADN khuôn và có thể thực hiện tự động [33] Với một bộmồi ta có thể sử dụng đợc với các loài khác nhau trong khi các mẫu dò RFLPchỉ có thể dùng đợc cho các loài có quan hệ gần gũi Tính đa dạng thu đợc từcác chỉ thị RAPD đợc đánh giá cao hơn so với kỹ thuật RFLP trong trờng hợpthực hiện trên cùng một vật liệu và cho phép phát hiện đợc tính đa dạng ngaycả trong các đoạn chứa các trật tự nucleotit lặp lại [21], [33]

l-Bên cạnh đó, RAPD còn là một kỹ thuật lấy dấu ADN có độ nhạy cao,có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, lập bản đồ di truyền, lập bản đồ genliên kết và phân tích con lai F1 Bằng phơng pháp này có thể xác định đợcngay các gen liên kết của quần thể F1 mà không cần chờ các tính trạng củathế hệ F1 biểu hiện khi trồng và thu hoạch Nhợc điểm của kỹ thuật này là: chỉthị RAPD có tính chất trội do đó những gen điều khiển tính trạng nào đó cótính lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trên gel điện di [26], [45], [71].

Hiện nay, kỹ thuật RAPD đợc sử dụng trong nhận biết, phân loại vàphân tích đa hình di truyền của các loài khác nhau nh phân tích sự đa dạng

ADN giữa các giống Saccharum [35], xác định và phân loại các kiểu di truyền

của các giống đậu Hà Lan [59], phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài

Orobanche [55], phân tích các biến đổi di truyền trong loài cỏ ba lá trắng ở

Bắc Mỹ [34].

Hai nhà khoa học Yang và Quiros đã sử dụng 28 đoạn mồi có trình tự10 nucleotit để nghiên cứu sự khác biệt của 28 giống cần tây và đợc chia làmba nhóm Kết quả thu đợc càng trùng hợp khi sử dụng 6 chỉ thị protein đểphân loại các giống cần tây trên [72] Tơng tự, nhiều tác giả đã sử dụng RAPDđể lập cây chủng loại phát sinh của ngô, lúa gạo, lúa mì [1], [60].

Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất hiệu quả trong việc tìm ra cácchỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau Sun và cộng sự(2003) đã sử dụng 160 mồi RAPD để phân tích tính đa hình ADN của 35

giống lúa mì xuân kháng bệnh FHB (Fusarium head blight) và phát hiện ra 3chỉ thị RAPD liên quan đến tính kháng bệnh FHB [66].

Orozco và cộng sự (1994) đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát mốiquan hệ di truyền và tiến hoá của các giống cà phê đợc lai tạo từ các loài bố,mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mụcđích tạo con lai có đặc điểm quý Bùi Mạnh Hùng cùng cộng sự (2000) cũngcho biết khi sử dụng kỹ thuật RAPD đã phân biệt đợc hai giống đậu Vetch vàLentil cùng giống nhau về hình thái (trọng lợng 1000 hạt, màu sắc, kích th-ớc ) Điều này có một ý nghĩa lớn trong việc xác định độ thuần di truyềncũng nh mức độ lẫn tạp cơ giới của các loại giống cây trồng [7], [48]

Lansium domesticum Corr (Bòn bon) là loài cây ăn quả đợc trồng phổ

biến ở Malaysia Các giống đợc trồng tại đây là giống Dokung, Duku,

Langsat… Diện tích vải trên thế giới năm 1990 là 183.700 ha với sản, chúng khác nhau ở một số đặc điểm hình thái học, sinh học hayvùng phân bố Ngoài ra, cũng có những giống khác nhau do chúng là dạng conlai hoặc do sự đặt tên khác nhau của ngời dân địa phơng Sự phức tạp này đãgây ra hiện tợng mất tên hoặc sai tên của một số loài Để giải quyết vấn đềnày, Song và cộng sự (2000) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích mốiquan hệ di truyền giữa chúng Công trình này đã làm sáng tỏ mối quan hệ di

truyền và cung cấp những kiến thức sâu hơn để tìm ra các loại L domesticum

khác nhau [61].

Đối với cây vải, khi kỹ thuật RAPD cha ra đời, việc phân tích tính đahình di truyền thờng sử dụng các dấu chuẩn isozyme Dấu chuẩn kiểu này đãđợc Aradhya và cộng sự (1995) sử dụng để xác định mối quan hệ di truyềntrong quần thể vải nghiên cứu thông qua hệ thống 8 enzym [74] Bên cạnh đó,Spranger và cộng sự (1998) đã phân tích các hợp chất phenol có trong vỏ quảbằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp lỡng cực (diode array HPLC) để xác định

mối quan hệ di truyền của các giống vải (Litchi chinensis Sonn.) dựa trên

ch-ơng trình thống kê ứng dụng (NTSYS-pc program) [19], [44], [62].

Về sau, các nghiên cứu đa hình di truyền của các quần thể vải chủ yếusử dụng kỹ thuật RAPD Bằng kỹ thuật này, Lee và cộng sự (2001) đã phântích mối quan hệ di truyền của 13 giống vải Đài Loan Các giống vải này đợctrồng từ rất lâu trên một diện tích lớn đã có những biến đổi dẫn đến nhận biếtvà phân loại rất khó khăn Vì vậy, 18 dòng vải của 13 giống vải đã đợc sửdụng để xác định mối quan hệ di truyền nhằm cung cấp cơ sở cho công tácphân loại và lai giống [39].

Cũng bằng kỹ thuật RAPD, nhiều quần thể vải đã đợc phân tích mốiquan hệ di truyền và lập bản đồ liên kết gen trong các công trình nghiên cứucủa nhiều nhà khoa học nh Chiangda và cộng sự (1998) [21], Anuntalabhochaivà cộng sự (2002) [17], Tongpamnak và cộng sự (2002)… Diện tích vải trên thế giới năm 1990 là 183.700 ha với sản [41], [58], [67].

Ngoài việc phân tích đa hình ADN của quần thể vải, kỹ thuật RAPDcũng đợc sử dụng trong lập bản đồ liên kết gen của vải Ding X.D và cộng sự(2001) đã lập bản đồ liên kết gen dựa trên quần thể F1 đợc tạo ra từ sự lai tạogiữa hai giống vải khác nhau Từ bản đồ liên kết gen có thể sẽ xác định đợckiểu gen của cây bố mẹ và định vị đợc các gen điều khiển các tính trạng nhphẩm chất quả, kích thớc quả, sức sống của cây, tính kháng bệnh và khả năng

chịu đựng các điều kiện môi trờng khác nhau mà không cần trồng thế hệ F1để theo dõi [26].

ở Việt Nam, kỹ thuật RAPD cũng đã đợc sử dụng để nghiên cứu tínhđa dạng di truyền của nhiều giống cây trồng khác nhau Đinh Thị Phòng(2001) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá tính đa hình ADN của cácdòng lúa đợc tạo ra bằng các kỹ thuật tạo dòng chịu hạn [7] Nguyễn VănThiết và cộng sự (1999) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu mối quanhệ di truyền giữa các giống nhãn trồng ở Việt Nam và tìm ra 19 marker ADNđặc hiệu cho từng giống nhằm phục vụ nhu cầu chọn giống, xác định và đánhgiá chất lợng giống [3], [11], [12].

Khi nghiên cứu mối quan hệ giữa cây vải cổ thụ ở huyện Kim Bôi, HoàBình với cây vải tổ ở huyện Thanh Hà, Hải Dơng và giống vải chua bằng kỹthuật RAPD, Nguyễn Văn Thiết và cộng sự cho rằng, về mặt di truyền cây vảicổ thụ này thuộc giống vải thiều và có quan hệ rất gần gũi với cây vải tổ ởthôn Thuý Lâm Cả hai cây này đều có mối quan hệ di truyền nh nhau vớigiống vải chua [13].

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

Công trình nghiên cứu đợc thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào thựcvật thuộc Viện Công nghệ Sinh học.

Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là của các hãng sản xuấtchuyên dụng cung cấp nh: Máy ly tâm (Beckman), máy PCR System 9700(Pharmacia), máy điện di (Biorad), máy đo quang phổ Diode ArraySpectrophotometer của hãng Hewlett - Packard, máy chụp ảnh gel - Doc(Pharmacia), máy ổn nhiệt, máy soi UV, lò vi sóng, các hóa chất tách chiết

ADN, hóa chất PCR, mồi

2.2 Phơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Điều tra về diện tích trồng vải và giống vải thiều Thanh Hà

- Điều tra về diện tích- Điều tra về cơ cấu giống

2.2.2 Phơng pháp phân tích các chỉ tiêu sinh học

2.2.2.1 Điều tra các đặc điểm sinh lý

- Tuổi cây

- Tình hình sinh trởng- Dáng tán, chu vi tán- Hình dạng lá, màu sắc lá

- Thời gian chín quả, màu sắc quả, trọng lợng quả và các thành phầnBảng 2 Danh sách các dòng vải nghiên cứu

(TH)

2.2.2.2 Phân tích các chỉ tiêu sinh hoá

2.2.2.2.1 Xác định hàm lợng đờng tan trong cùi vải

Hàm lờng đờng tan đợc xác định theo phơng pháp anthron bao gồm cácbớc sau [5]:

- Cân 1 gram cùi vải cho vào cối sứ, cho thêm một ít bột thuỷ tinh +CaCO3 và vài ml nớc cất (60oC - 70oC), nghiền thành dạng đồng thể.

- Trút mẫu nghiền vào bình tam giác có thể tích 250 ml, tráng kỹ chàyvà cối bằng nớc cất 60oC - 70oC rồi để mẫu ở 60oC-70oC trong 30 - 40 phút.

- Để mẫu nguội, sau đó lọc hoặc ly tâm, rửa cặn bằng nớc cất 60oC 70oC 2 - 3 lần Thu dịch trong để xác dịnh đờng tan.

Thêm 5 ml axetat chì 10% vào dịch trong để kết tủa protein Lên thểtích đến 100 ml bằng nớc cất Lấy 20 ml dịch lọc ở trên cho vào bình tamgiác, dùng Na2SO4 để tủa chì d (cho từng giọt), lắc và lọc Dịch lọc phải trong.

- Lấy 1 ml dịch thu đợc, cho thêm 3 ml dung dịch anthron 0,1% Đunnóng 90oC trong 14 phút, sau đó làm lạnh và để 30 phút trong bóng tối rồi đotrên máy quang phổ ở bớc sóng 620 nm

- Tính hàm lợng đờng tan theo đờng chuẩn glucose

Cho thêm 3 - 5 giọt tinh bột 1%, lắc nhẹ.

Chuẩn độ bằng dung dịch iôt 0,01N đến khi xuất hiện màu xanh tímnhạt thì ngừng chuẩn độ Ghi thể tích dung dịch iôt đã dùng chuẩn độ (ml) [5].

Tính hàm lợng vitamin C theo công thức:

X(%) = (a V 0,00088 100)/ m vTrong đó a: Thể tích dung dịch iôt dùng để chuẩn độ

V: Toàn bộ thể tích dịch chiết ban đầum: Khối lợng mẫu dùng để phân tích v: Thể tích dịch chiết đem chuẩn độ

0,0008: Số g vitamin C tơng đơng với 1 ml I2 0,01N

2.2.2.2.3 Xác định hàm lợng protein hoà tan trong dịch ép cùi vải

Hàm lợng protein hoà tan trong dịch ép cùi vải đợc xác định theo phơngpháp microburet [38].

Cân 5 gram cùi vải cho vào cối sứ, nghiền nhỏ.

Ly tâm thu dịch trong vào bình định mức, rửa cặn 3 lần bằng nớc cất,sau đó dùng nớc cất để định mức đến 50 ml.

Lấy 1 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, cho thêm 2 ml dung dịch A(gồm 0,21% CuSO4.5H2O, 30% NaOH) Lặp lại thí nghiệm 3 lần và thực hiệnsong song với mẫu đối chứng gồm 1 ml H2O + 2 ml dung dịch A

Lấy 1 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, cho thêm 2 ml dung dịch B(gồm NaOH 30%) Lặp lại thí nghiệm 3 lần và thực hiện song song với mẫuđối chứng gồm 1 ml H2O + 2 ml dung dịch B.

Để hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 20 phút sau đó đo trênmáy quang phổ ở bớc sóng 310 nm.

Tính hàm lợng protein hoà tan trong dịch ép cùi vải theo đờng chuẩntizorin.

2.2.3 Phơng pháp phân tích sinh học phân tử

2.2.3.1 Tách chiết và làm sạch ADN từ lá vải

a- Thu và bảo quản lá

Cắt búp lá vải non, không bị dập nát cho vào ống eppendorf 2 ml, nhanhchóng cho vào nitơ lỏng Chúng đợc dùng ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh ởnhiệt độ - 830C cho đến khi sử dụng.

b- Hoá chất sử dụng: Đệm rửa (Washing buffer):

Các hoá chất khác: - Isopropanol.

- Ethanol 80%.

- Chloroform : isoamyl (24:1) - Nitơ lỏng.

c Quy trình tách chiết:

B1: Cân 200 mg lá vải non cho vào ống eppendorf 2 ml.

B2: Cho nitơ lỏng vào ống eppendorf có chứa mẫu lá Nghiền bằng đũathủy tinh có đầu nhọn vừa với ống eppendorf thành dạng bột mịn.

B3: Bổ sung 1,5 ml đệm rửa vào ống eppendorf chứa bột nghiền lá vải,votex tạo thành dịch đồng nhất Ly tâm 13.000 v/p trong 5 phút Loại bỏ dungdịch nổi (lặp lại bớc này 2 lần).

B4: Bổ sung 800 μl đệm tách ADN, đảo nhẹ để tạo thành hỗn hợp đồngnhất, ủ trong 30 phút ở 650C.

B5: Để nguội ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.

B6: Bổ sung 800 μl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl (24:1) hoặc hỗn hợpPhenol : Chloroform : Isoamyl (25:24:1), đảo đều.

B7: Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút để phân tách thành 2 pha, hút cẩnthận dịch nổi cho vào ống eppendorf mới.

B8: Tủa dịch nổi bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1), đảo nhẹ, để ở tủ - 200C chođến khi ADN kết tủa (khoảng 20 phút).

B9: Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút loại bỏ dịch nổi (hoặc vớt kết tủaADN bằng đầu côn).

B10: Rửa ADN 3 lần bằng ethanol 80%.

B11: Làm khô ADN bằng máy Speed - Vac hay ở nhiệt độ phòng.

B12: Hoà tan ADN trong 300 μl TE 1X.

B13: Bổ sung 3 μl RNase (10 mg/ml), ủ ở 370C trong 30 phút.B14: Thêm 10 μl Sodium acetate 3M đảo nhẹ.

B15: Bổ sung 2,5 V ethanol tuyệt đối, đảo nhẹ để ở - 200C ít nhất 1 giờ.B16: Ly tâm 13.000 v/p trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi.B17: Rửa ADN 2 lần bằng ethanol 80%.

B18: Hoà tan ADN trong 300 μl TE 1X, giữ ở -200C đến khi sử dụng.

2.2.3.2 Xác định hàm lợng và độ tinh sạch của ADN

2.2.3.2.1 Phơng pháp xác định hàm lợng và độ tinh sạch của ADN

Việc xác định hàm lợng và độ tinh sạch của ADN có thể đợc thực hiệnbằng cách đo độ hấp thụ tia UV ở các bớc sóng 230, 260, 280 nm trên máy đoquang phổ Khi đó ADN có đỉnh hấp thụ cực đại ở bớc sóng 260 nm Từ giátrị OD260 ta sẽ tính đợc hàm lợng của ADN thu đợc (chẳng hạn số đo trên máylà 1,0 thì hàm lợng ADN sẽ vào khoảng 50 mg/1 ml mẫu) Độ tinh sạch củaADN có thể đợc xác định bằng tỷ số OD260/OD280 và OD260/ OD230 Các tỷ sốnày lần lợt chỉ ra sự có mặt của các tạp chất là protein, các hợp chấtpolyphenol và carbonhydrate Một mẫu ADN đợc coi là tinh sạch nếu tỷ sốOD260/OD280 và OD260/OD230 đạt 1,8 - 2.

Các bớc đo đợc tiến hành nh sau:

- Chỉnh cân bằng máy: dùng nớc cất 2 lần khử ion, vô trùng để làmchuẩn.

- Kiểm tra máy: đo một mẫu ADN có nồng độ chuẩn đã biết trớc (ADN

HSPL: Hệ số pha loãng,

OD230: chỉ số đo đợc ở bớc sóng 230 nm, OD260: chỉ số đo đợc ở bớc sóng 260 nm, OD280: chỉ số đo đợc ở bớc sóng 280 nm.

2.2.3.2.2 Phơng pháp xác định chất lợng của ADN

Đôi khi, ADN tách chiết đợc có độ tinh sạch không cao cho nên việcxác định hàm lợng ADN bằng cách đo độ hấp thụ tia UV trên máy máy đoquang phổ có thể có sai sót do ảnh hởng của ARN và các tạp chất không phảiaxit nucleic Trong trờng hợp này phải xác định chất lợng của ADN tổng sốbằng phơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%.

- Hóa chất: + Agarose

+ Dung dịch TAE 1X (Tris bazơ 48,8 g/l : axit axetic 10,2 ml/l :EDTA 0,5M 20 ml/l pH 8,0)

+ Ethidium Bromide (EtBr) 0.5 μg/ml + Đệm tra mẫu (Buffers 10X)

- Chuẩn bị gel: Cân 0,8 g agarose hòa tan trong 100 ml dung dịch TAE1X Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn (nếu trong quá trình đunbị mất nớc thì bỏ thêm H2O đến thể tích 100 ml) Để nguội đến 500 - 600C, đổdung dịch vào khuôn gel điện di đã cài sẵn răng lợc Sau 30 - 60 phút, khi gelagarose đã đông cứng, gỡ khay gel cài vào bể điện di Đổ đệm TAE 1X ngậpbản gel agarose khoảng 2 mm, tháo lợc ra khỏi bản gel.

- Tra mẫu: Trộn mẫu theo tỷ lệ (2 μl ADN/1 μl đệm tra mẫu 10X : 7 μlH2O) và tra vào giếng.

- Điện di: Điện thế dùng để điện di từ 60 - 80 V ADN chuyển từ cựcâm sang cực dơng Quan sát sự di chuyển bằng mầu của bromophenol đểbiết lúc nào ngừng điện di.

- Nhuộm ADN: Nhuộm ADN bằng Ethidium Bromide Bản gel đ ợc

lấy ra khỏi khay điện di và đa vào dung dịch EtBr 0,5μg/ml trong thời giankhoảng 15 phút trên máy lắc nhẹ.

- Soi ADN: Soi trên máy UV và chụp ảnh bằng máy Gen - Doc.

2.2.3.3 Phân tích tính đa hình ADN các dòng vải thiều bằng kỹ thuật RAPD.

2.2.3.3.1 Đoạn mồi ngẫu nhiên

Chúng tôi tiến hành sàng lọc trên 80 đoạn mồi ngẫu nhiên do phòngCông nghệ tế bào thực vật cung cấp Kết quả chọn đợc 26 đoạn mồi ngẫu

nhiên cho tính đa hình để phân tích hệ gen của 45 dòng vải nghiên cứu Kýhiệu và trình tự của các đoạn mồi này đợc trình bày trong bảng 6.

2.2.3.3.2 Phản ứng PCR- RAPD

Phản ứng PCR đợc thực hiện trên máy PCR System 9700 với thể tích 20

μl (trong ống eppendorf dung tích 500 μl) trong đó chứa các thành phần vànồng độ của các chất tham gia phản ứng đợc trình bày trong bảng 3.

Bảng 3 Thành phần và nồng độ của các chất tham gia phản ứng PCR

Dùng pipet chia đều hỗn hợp ra các ống phản ứng có sẵn 3 μl ADN củatừng mẫu nghiên cứu Các ống đợc trộn đều 1 - 2 giây sau đó li tâm nhẹ trong5 giây.

Chu kỳ nhiệt: B1 : 94oC trong 4 phút B2 : 92oC trong 1 phút B3 : 35oC trong 1 phút B4 : 72oC trong 1 phút B5 : ở 72oC trong 10 phút B6 : lu giữ ở 4oC

Chu trình nhiệt từ B2 đến B4 đợc lặp lại 45 chu kỳ.

Tiêu chuẩn hoá sản phẩm RAPD theo quy ớc:Số 1: xuất hiện phân đoạn ADN.

Số 0: không xuất hiện phân đoạn ADN.

Phân tích số liệu theo quy ớc: 1 = phân đoạn ADN xuất hiện và 0 = phânđoạn ADN không xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD với các đoạn mồi ngẫunhiên.

Xác định hệ số tơng quan di truyền theo 3 phơng pháp [47]:+ Theo Nei và Li, 1979 (hệ số Dice)

+ Theo Jaccard, 1908 (hệ số Jaccard)

+ Theo Sokal và Michener, 1958 (hệ số Simple Matching: SM)

Trong đó Sij: hệ số giống nhau giữa hai cá thể i và j a: số phân đoạn ADN xuất hiện ở cá thể i và j

b: số phân đoạn ADN xuất hiện ở i và không xuất hiện ở j c: số phân đoạn ADN xuất hiện ở j và không xuất hiện ở i

d: số phân đoạn ADN không xuất hiện ở cá thể i và j

So sánh hệ số tơng quan kiểu hình theo 3 phơng pháp: SM, Dice,Jaccard và 4 phơng pháp phân nhóm UPGMA (Phân tích các nhóm phân tửkhông cùng trọng lợng), WPGMA (Phân tích các nhóm phân tử có cùng trọnglợng), liên kết hoàn toàn, liên kết đơn lẻ Lập biểu đồ hình cây dựa vào giá trịtơng quan kiểu hình (r) cao nhất trong chơng trình NTSYS 2.0 [7], [21] Hàmlợng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content = PIC) của

mỗi mồi xác định theo công thức PIC = 1 - ∑Pij2, trong đó Pij là tần số allenthứ j của kiểu gen i đợc kiểm tra Phạm vi giá trị PIC từ 0 (không đa hình) tới1 (đa hình hoàn toàn) [26], [54], [69].

Để khẳng định kết quả phân nhóm theo sơ đồ hình cây, chúng tôi biểudiễn kết quả theo phơng pháp so sánh đa chiều (MDS = MultidimensionalScaling, Kruskal & Wish, 1978) và biểu đồ phân tích theo toạ độ chính(PCA = Principal Co-ordinate Analysis, Hauser & Crovello, 1982) [19], [74].

Chơng 3 Kết quả và thảo luận

3.1 Kết quả điều Tra diện tích và giống vải thiều Thanh hà3.1.1 Vùng trồng và diện tích trồng vải của huyện Thanh Hà

Để có cơ sở lấy mẫu cũng nh số mẫu đợc thu mang tính đại diện choquần thể vải thiều Thanh Hà, chúng tôi đã tiến hành điều tra diện tích, cơ cấugiống vải của huyện Thanh Hà Diện tích trồng vải của toàn huyện là 6544,05ha với diện tích của từng xã đợc trình bày trong bảng 4.

Bảng 4 Diện tích trồng vải của huyện Thanh Hà

STT Tên xã Diện tích (ha) STT Tên xã Diện tích (ha)

13 Thanh Thủy 343,51 Tổng DT toàn huyện 6544,05

3.1.2 Cơ cấu giống vải của huyện Thanh Hà

Hiện nay cha có số liệu thống kê chính xác, nhng theo Phòng Nôngnghiệp và Phát triển nông thôn của huyện cho biết thì giống vải đợc trồng chủyếu là giống vải thiều Thanh Hà (chiếm khoảng 86% diện tích) Phần diện tíchcòn lại trồng các giống vải khác nh U hồng, U trứng, U thâm, Tầu lai (tậptrung chủ yếu ở các xã Thanh Cờng, Thanh Bính, Thanh Hồng).

Từ các kết quả điều tra trên, chúng tôi thấy rằng diện tích trồng vải đợctrải đều trên toàn huyện Cây vải đợc trồng ở đây có tuổi trung bình khoảng 20năm, những cây cao tuổi chủ yếu tập trung ở Thanh Sơn và các xã lân cận nhThanh Thủy, Phợng Hoàng, Thanh Xuân ở các xã xa vùng Thanh Sơn, cây vảicó tuổi trung bình chỉ khoảng 15 năm Mặt khác, theo điều tra của chúng tôi,vùng cung cấp cây giống của huyện chủ yếu là ở hai xã Thanh Sơn và ThanhThủy còn các xã khác cũng nhân giống nhng không nhiều Dựa trên các cơ sở

đó, chúng tôi tiến hành lấy mẫu tập trung tại Thanh Sơn (11 dòng), số mẫu cònlại đợc thu thập ở các xã lân cận (3 dòng/xã) (bảng 2).

3.2 kết quả Tách ADN tổng số từ lá vải3.2.1 Cải tiến quy trình tách ADN tổng số

Việc tách chiết axit nucleic thực vật để sử dụng trong phân tích sinh họcphân tử (PCR, RFLP, AFLP, RAPD, Southern blot… Diện tích vải trên thế giới năm 1990 là 183.700 ha với sản) là một trong những bớcquan trọng và mất nhiều thời gian Mức độ tinh sạch và hàm lợng của ADN thuđợc sẽ ảnh hởng trực tiếp tới sự thành công của các bớc tiếp theo

Mặc dù đã có một số qui trình về tách chiết ADN từ lá vải củaDellaporta và cộng sự (1983), Draper và Scott (1988), Rogers và Bendich(1988), Nguyễn Văn Thiết và cộng sự (1997) nhng vì dịch chiết từ lá vải cóchứa nhiều polysaccharide và các hợp chất polyphenol [32], [46] Do đó, việctạo ra một lợng lớn ADN hệ gen vải tinh sạch và có hàm lợng cao vẫn là mộtviệc rất khó khăn [10], [24], [29], [53] [57].

Một phơng pháp tách chiết đợc gọi là tối u phải thu đợc ADN tinh sạch,có hàm lợng cao và nguyên vẹn Phơng pháp đó cũng phải nhanh, ít tốn kémvà nếu có thể phải tránh đợc việc sử dụng các hóa độc hại [27], [63].

Bớc đầu tiên trong quy trình tách chiết ADN từ vật liệu thực vật là phávỡ thành tế bào để giải phóng các thành phần nội bào Bớc này phải tiến hànhnhanh để giảm đến mức tối thiểu lợng ADN bị đứt gãy cơ học trong quá trìnhtách chiết

Có thể dùng enzym, các hóa chất làm tan hoặc các phơng pháp mạnhhơn nh nghiền bằng máy hoặc cối Thông thờng, ta tiến hành nghiền mẫutrong nitơ lỏng thành dạng bột mịn Sau đó, phân huỷ màng tế bào để giảiphóng ADN vào trong đệm chiết Bớc này thờng đợc thực hiện bằng cách sửdụng các chất tẩy nh là sodium dodecyl sulphate (SDS) hoặc cetyl tri-methylamonium bromide (CTAB) ADN giải phóng ra phải đợc bảo vệ khỏinuclease nội bào Do vậy EDTA thờng có mặt trong đệm chiết để tạo phức chấtvới các ion magie (một co-factor không thể thiếu của các enzym nuclease) [22],[25].

Dịch chiết ADN từ thực vật nói chung có chứa một lợng lớn ARN,protein, polysaccharide, tanin và các sắc tố, chúng có thể gây trở ngại choADN đợc chiết và khó tách ra [49], [51] Hầu hết các loại protein sẽ đợc loạibỏ khỏi dịch chiết bằng cách biến tính và kết tủa khỏi dịch chiết bằng

chloroform hoặc phenol Còn các ARN thì có thể đợc loại bỏ khi ủ dịch chiếtvới RNAse ở nhiệt độ 37oC Chỉ riêng polysaccharide và các hợp chấtpolyphenol là rất khó loại khỏi dịch chiết [23] Polysaccharide gây ức chế hoạt

tính của một vài enzym (Taq polymerase) [32] và ảnh hởng đến việc xác định

hàm lợng của axit nucleic bằng quang phổ kế Còn polyphenol (ở dạng oxihoá) có khả năng liên kết đồng hoá trị với ADN cũng gây ảnh hởng đến quátrình nhân bản [43], [52], [70], [75].

Lúc đầu, khi sử dụng phơng pháp CTAB của Murray và Thompson(1980) để tách chiết ADN hệ gen từ lá vải chúng tôi thu đợc lợng ADN là

335,02 μg/1,0 g lá nguyên liệu Tuy nhiên, chúng vẫn còn lẫn polysacharidevà các hợp chất polyphenol nh đợc chỉ ra bởi tỷ số đo quang phổ hấp thụ làOD260/OD280 = 1,52 và OD260/ OD230 = 1,17 Mẫu ADN thu đợc rất nhày và cómàu vàng nhạt Trên ảnh điện di, sản phẩm tách chiết ADN xuất hiện cácbăng ADN không nét và trên giếng cũng xuất hiện các vệt sáng.

Sau khi tìm hiểu các tài liệu về tách chiết ADN tổng số thì chúng tôithấy rằng, NaCl ở các nồng độ lớn hơn 0,5M cùng với CTAB có thể loại bỏ đ-ợc các loại polysacharide [32], [46], [50] Khoảng nồng độ NaCl dao động từ0,7M đến 6M [16] và phụ thuộc vào các loài thực vật khác nhau Theo Fangvà cộng sự (1992), NaCl 1M có khả năng loại bỏ polysaccharide khỏi ADN donó làm tăng tính tan của polysacharide trong ethanol vì vậy không kết tủacùng với ADN trong ethanol 80% [29], [40].

Riêng đối với các hợp chất polyphenol thì có thể sử dụng pyrolidone (PVP) để loại bỏ Vì PVP sẽ hình thành các liên kết hidro với cáchợp chất polyphenol và có thể đợc loại bỏ bằng cách ly tâm [28], [31], [43]

Polyvinyl-Do vậy, các thí nghiệm tiếp theo đợc tiến hành với nồng độ NaCl trongđệm tách tăng từ 1,5M đến 2M, bổ sung PVP (Mr 10.000) vào đệm tách vàcó sử dụng đệm rửa trớc khi tách chiết Khi đó, độ tinh sạch và chất l ợng củaADN đã đợc cải thiện, các băng đợc chỉ ra trên điện di đồ sắc nét hơn Tuy

nhiên, lợng ADN thu đợc lại giảm xuống còn 240,2 μg/1,0 g lá nguyên liệu[64]

Tiến hành một số thay đổi khác bao gồm tỷ lệ đệm đối với lợng nguyênliệu, sử dụng 0,5% (v/v) mercaptoethanol, 6% CTAB (w/v), giảm thời gian ủ,rửa bằng ethanol 80%, sử dụng lá vải non (với mỗi tham biến đợc kiểm tra

một lần) đã thiết lập đợc một quy trình tách chiết ADN hệ gen vải (mục

2.2.3.1) dễ thực hiện, mất ít thời gian và thu đợc khoảng 380 μg ADN/1,0 g lánguyên liệu [65].

3.2.2 Kết quả tách chiết ADN tổng số

Các mẫu ADN đợc đo quang phổ hấp thụ ở dải bớc sóng từ 200 - 800nm Kết quả cho thấy, các mẫu ADN đều có một đỉnh hấp thụ cực đại ở bớcsóng 260 nm Điều này chứng tỏ, ADN tách chiết là sạch, không bị lẫn tạp cácchất khác (hình 2).

Hàm lợng ADN thu đợc từ 1,0 g lá nguyên liệu tơng đối cao (380 g).Khi tính toán tỷ số OD260/OD230 và OD260/OD280 (bảng 5) thì thấy rằng tỷ lệOD260/OD280 vào khoảng 1,9 và OD260/ OD230 vào khoảng 1,85 Khoảng biếnđộng này đều nằm trong giới hạn cho phép (1,8 - 2,0) Điều này, một lần nữakhẳng định các mẫu ADN tách chiết đợc đều sạch.

Ngoài phơng pháp đo quang phổ hấp thụ, chúng tôi còn sử dụng phơngpháp điện di trên gel agarose 0,8% Kết quả điện di trên hình 3 cho thấy, cácmẫu ADN tách chiết từ lá vải cho một băng duy nhất, sắc nét, có phân tử lợngcao, ở gần giếng và không có sự đứt gãy của các phân tử ADN.

Hình 3 Điện di kiểm tra ADN tổng sốHình 2 Phổ hấp thụ của ADN tách chiết

λ TH

1 TH2 TH3 VT19 UH24 HB35

Chú thích: cột 1: ADN () nồng độ 200 ng, cột 2: vải thiều Thanh Hà TH1, cột 3: vải thiều Thanh Hà TH2,cột 4: vải thiều Thanh Hà TH3, cột 5: cây vải thiều Thanh Hà tổ VT19, cột 6: cây vải U hồng UH24, cột 7: câyvải cổ thụ Hoà Bình HB35.

Nh vậy, với quy trình đợc thiết lập trên có thể thu đợc ADN hệ gen của vảicó hàm lợng và độ tinh sạch đạt tiêu chuẩn để tiến hành phản ứng RAPD.

3.3 đánh giá tính đa hình ADN của các dòng vải thiều Thanh Hà 3.3.1 Phân tích tính đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD

Bảng 5 Độ sạch và hàm lợng ADN của 45 mẫu lá vải

Hàm lợng (ngADN/1,0 l)

Chúng tôi tiến hành sàng lọc đối với 80 mồi ngẫu nhiên do PhòngCNTBTV cung cấp Kết quả chọn đợc 26 mồi dùng để đánh giá tính đa hìnhADN của quần thể vải nghiên cứu Tên và trình tự nucleotit của các mồi đợctrình bày trong bảng 6.

Bảng 6 Tên và trình tự nucleotit của các mồi dùng trong nghiên cứu

STTTên mồiTrình tự nucleotitSTTTênmồi

Trình tự nucleotit

5 CTGCTGGGAC 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 AGACGTCCAC 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 CTGAGACGGA 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 TGGGCGTCAA 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 CCAGCAGCTT 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 CCCGTTGCCT 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 ACCCCCCACT 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 AACCGACGGG 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 GGCGGACTGT 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 TACCACCCCG 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 CCAGACCCTG 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 CAATCGCCGT 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 TAGGCGAACG 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

C-08C-12C-19 GrN-38H-06H-18H-20O-10P-16P-17Q-14Q-16V-10

5 TGGACCGGTG 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 TGTCATCCCC 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 GTTGCCAGCC 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 TGGCGCTGGT 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 ACGCATCGTG 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 GAATCGGCCA 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 GGGAGACATC 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 TCAGAGCGCC 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 CCAAGCTGCC 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 TGACCCGCCT 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 GGACGCTTCA 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 AGTGCAGCCA 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

5 GGACCTGCTG 3’CTGCTGGGAC 3’’CTGCTGGGAC 3’

3.3.1.1 Số phân đoạn và tần số xuất hiện các phân đoạn

Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau đợc điện di trên gel agarose đểphân tích tính đa hình ADN của các dòng vải nghiên cứu Trong thí nghiệmnày có 1170 phản ứng PCR đợc thực hiện Kết quả điện di cho thấy số phânđoạn ADN nhận đợc ở mỗi phản ứng là rất khác nhau, dao động từ 3 đến 17phân đoạn Xét về tổng số các phân đoạn đối với tất cả các mồi, dòng TH12 vàTH15 cho ít phân đoạn nhất (192 phân đoạn) còn dòng cho nhiều phân đoạnnhất là UT25 (228 phân đoạn) Nhìn chung mồi cho nhiều phân đoạn nhất làRA-40 (673 phân đoạn) còn mồi cho ít phân đoạn RAPD nhất là P-16 (141phân đoạn).

Tổng cộng đối với 26 mồi ngẫu nhiên, chúng tôi đã thu đợc 9149 phânđoạn ADN từ quần thể vải nghiên cứu (bảng 7).

Bảng 7 Tổng số phân đoạn ADN xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD với 26 mồiMồi

C 0 8

C 12

H 18

V 10 Cây

Ngoài kết quả phân tích trên, chúng tôi còn tiến hành xác định mức độđa hình bằng cách so sánh giữa số phân đoạn đơn hình và đa hình thu đợc từcác mồi Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của cácphân đoạn ADN khi so sánh giữa các dòng với nhau (bảng 8).

Kết quả ở bảng 8 cho thấy, với 26 mồi ngẫu nhiên chúng tôi đã thu đợc350 phân đoạn ADN (trong đó 245 phân đoạn mang tính đa hình, chiếm70%) Số lợng các phân đoạn ADN nhân bản với mỗi mồi dao động từ 7 phânđoạn (mồi O-10) đến 24 phân đoạn (mồi RA-45) với kích thớc từ 0,25Kb đến3Kb trong phạm vi quan sát Số các phân đoạn đa hình của mỗi mồi từ 3 phânđoạn (mồi H-08) đến 23 phân đoạn (mồi RA-142) và 24 phân đoạn (mồi RA-45), trung bình là 9,4 phân đoạn/1mồi đợc tạo ra Riêng đối với quần thể vảithiều Thanh Hà, chúng tôi nhận đợc toàn bộ 247 phân đoạn, trong đó có 163phân đoạn đơn hình và 84 phân đoạn đa hình Số phân đoạn đa hình chiếm34%.

Ghi chú Mồi: Tổng số phân đoạn ADN xuất hiện đối với mỗi mồi của 45 dòng vảI nghiên cứu; Cây: Tổng số phân đoạn ADN xuất hiện đối với mỗi dòng vảI của toàn bộ 26 mồi.

Bảng 8 Các phân đoạn (PĐ) ADN đợc nhân bản ngẫu nhiên

Các phân đoạn ADN mang tính đa hình đợc phân bố cụ thể nh sau: Có62 phân đoạn chỉ xuất hiện ở 1 trong 45 dòng vải khi tiến hành phản ứngRAPD với các mồi khác nhau (tần suất là 0,02) Ví dụ đối với mồi P-16 chỉ códòng UT25 (cột 27) là xuất hiện phân đoạn ADN có kích thớc 1,7Kb Có 39phân đoạn ADN xuất hiện ở 2 trong 45 dòng vải khi tiến hành phản ứngRAPD với các mồi khác nhau (tần suất là 0,04) Và 105 phân đoạn ADN có ởtất cả 45 dòng (phân đoạn đơn hình)… Diện tích vải trên thế giới năm 1990 là 183.700 ha với sản Số liệu cụ thể đợc thể hiện ở hình 4.

Từ đồ thị trên cho thấy, sản phẩm RAPD với các mồi trên có tính đahình, hầu hết các phân đoạn có tần suất  0,07 và  0,93 Tức là, khi chúng taphân tích tại cùng một vị trí trên ảnh điện di đồ thì thấy các phân đoạn hoặc là

STTTên mồiSố PĐ ADNKích thớcSố PĐ đơn hình Số PĐ đa hình% số PĐ đa hình

10,02 0,04 0,07 0,09 0,11 0,13 0,16 0,18 0,20 0,24 0,33 0,36 0,47 0,49 0,53 0,56 0,62 0,67 0,73 0,76 0,78 0,82 0,87 0,89 0,91 0,93 0,96 0,98 1,00357911 13 15 17 19 21 23 25 27 29 Tần suất

120100806040200

chỉ xuất hiện ở một số ít dòng (≤ 3 dòng) hoặc là xuất hiện ở nhiều dòng (≥ 42dòng) Kết quả này đợc biểu thị trên hình 4 với 129 phân đoạn xuất hiện ở 1 -3 dòng và 181 phân đoạn xuất hiện ở trên 42 dòng Trong khi đó chỉ có 39phân đoạn xuất hiện ở 4 đến 41 dòng.

Tính đa hình của các mồi RAPD còn đợc đánh giá thông qua giá trị PIC(Polymorphism Information Content) Giá trị PIC càng lớn thì tính đa hìnhcàng cao và ngợc lại Bảng 9 cho thấy, giá trị PIC dao động từ 0,25 (mồi C-12)đến 0,71 (mồi UBC-346) Trong đó, 8/26 cặp mồi RAPD (P-16, RA-142, RA-31, UBC-346, C-19, RA-45, RA-46, H-20) cho tính đa hình cao, với giá trịPIC  0,5.

Trong tổng số 350 phân đoạn ADN, chúng tôi nhận đợc 5 phân đoạn chỉcó mặt ở các dòng vải thiều Thanh Hà mà không có mặt ở các dòng vải làmđối chứng Do vậy, các phân đoạn này có thể coi nh là chỉ thị RAPD đặc trngđể phân biệt giống vải thiều Thanh Hà với các giống làm đối chứng trong thínghiệm Các chỉ thị đợc phân bố cụ thể nh sau, 1 phân đoạn tại vị trí khoảng0,75Kb trên ảnh điện di đồ sản phẩm RAPD đối với mồi RA-142, 1 phân đoạntại vị trí 0,8Kb đối với mồi RA-40, 1 phân đoạn tại vị trí 0,5Kb đối với mồi

Bảng 9 Hàm lợng thông tin tính đa hình (PIC) của các cây vải nghiên cứu

OPB-10, 1 phân đoạn tại vị trí 1,75Kb đối với mồi Q-14 và 1 phân đoạn tại vịtrí 1,24Kb đối với mồi RA-46.

3.3.1.2 Phân tích sự đa hình ADN của sản phẩm RAPD trên điện di đồ

Chúng tôi chỉ tiến hành phân tích sản phẩm RAPD của quần thể vảinghiên cứu với các mồi thể hiện tơng đối rõ tính đa hình khi điện di trên gelagarose 2%

3.3.1.2.1 Sản phẩm RAPD với mồi OPG-05

Khi điện di sản phẩm RAPD của quần thể vải nghiên cứu với mồiOPG-05 chúng tôi thu đợc tổng số 18 phân đoạn, trong đó có 13 phân đoạn đahình Chiều dài ớc tính của phân đoạn ngắn nhất là 0,25Kb, của phân đoạn dàinhất là 2,0Kb Số lợng phân đoạn ADN xuất hiện của mỗi dòng vải nghiêncứu là khác nhau, dao động từ 9 phân đoạn (HB35) đến 16 phân đoạn (UT25)(hình 5, bảng 10).

Tính đa hình đợc thể hiện tơng đối rõ với mồi OPG-05 Chẳng hạn,chỉ có dòng TH12 (cột 12) là xuất hiện phân đoạn ADN đợc nhân bản tại vị trí1,4Kb ở dòng UH24 (cột 24), UT25 (cột 25), TL26 (cột 26) xuất hiện phânđoạn ADN có chiều dài ớc tính là 0,8Kb Trong khi đó, tại vị trí 1,25Kb dòngTH12 (cột 12), TH15 (cột 15), TH19 (cột 19), TH20 (cột 20), TH32 (cột 32),TH35 (cột 35), TH36 (cột 36), TH40 (cột 40) không xuất hiện phân đoạnADN nh các dòng khác Các kết quả phân tích trên cho phép nhận xét quần

thể vải nghiên cứu đã có sự sai khác trong ADN hệ gen

3.3.1.2.3 Sản phẩm RAPD với mồi RA-45

Kết quả điện di sản phẩm RAPD của các dòng vải nghiên cứu với mồiRA-45 đợc trình bày trong hình 6 và bảng 11 Trong tổng số 24 phân đoạnADN đợc nhân bản, có 22 phân đoạn đa hình (chiếm 91,7%) Kích thớc cácphân đoạn có chiều dài ớc tính từ 0,25Kb đến 2,4Kb Dòng có nhiều phânđoạn ADN đợc nhân bản nhất là UH24 (với 13 phân đoạn) còn dòng có ítphân đoạn ADN đợc nhân bản là TH2, TH4, TH12 (với 8 phân đoạn)