ứng dụng chỉ thị sinh học phân tử trong nghiên cứu bệnh lý cây trồng

Sự phát hiện ra enzym giới hạn (Smith & Wilcox, 1970) và phương pháp PCR (Mullis & Faloona, 1987) là cơ sở cho các phương pháp chỉ thị phân tử như RFLP (Botstein et al. 1980 ), microsatellites (Weber & May và Litt & Luty, 198

TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH LÝ CÂY TRỒNG

Ở Việt Nam đã bước đầu ứng dụng thành công các chỉ thị này vào nghiêncứu gen, nghiên cứu tính đa hình trong sinh giới, tìm chỉ thị liên quan tới mội sốtính trạng …(3,4)

Bệnh ở thực vật do nhiều nguyên nhân Có thể do côn trùng (sâu xanh, bọ

xít…), nấm (fuccinia arachidis gây bệnh gỉ sắt ở lạc, cà chua), vi khuẩn(Xanthomonas oryze gây bệnh bạc lá lúa) hoặc virut (bệnh xoan lùn ở bông)…

Tuy nhiên, trong cùng một loài thường có những giống mang gen kháng cácbệnh trên Chúng chủ yếu là các giống hoang dại, hoặc một số giống địaphương Đây thực sự là nguồn nguyên liệu quý để các nhà chọn giống dùng đểlai tạo ra các giống mang gen kháng Bằng phương pháp chỉ thị phân tử người taxác định các chỉ thị ADN liên quan tới gen kháng các bệnh đó Chỉ thị này có thểliên kết chặt với gen kháng hoặc có thể chính là gen đó (tuỳ theo từng phươngpháp cụ thể) Nhờ có sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) giúp các nhà chọngiống tiết kiệm thời gian chi phí trong quá trình chọn tạo (5) Chính vì những hữuích và tiện dụng của chỉ thị phân tử trên chúng tôi quyết định thực hiện đề tài“Xác định chỉ thị phân tử liên quan đến bệnh rỉ sắt và héo xanh vi khuẩn ở cây lạc

bằng một số kỹ thuật sinh học phân tử” mong muốn tìm hiểu các chỉ thị phân tử

để chẩn đoán bệnh giúp đẩy nhanh quá trình chọn giống

2 Tổng quan lài liệu

2.1 Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)2.1.1 Nguyên lý

Về nguyên lý, kỹ thuật RFLP dựa trên thực tế của sự biến dị và tái tổ hợp tựnhiên trong bộ gen ADN là nguyên nhân vài vị trí enzyme cắt giới hạn bị mất,được tạo ra hay được sắp xếp lại(6) Điều này dẩn đến khi sợi ADN bị cắt thànhnhiều đoạn nhỏ bởi các enzym hạn chế thì giữa các giống/loài sẽ có những phânđoạn khác nhau về kích thước hay chiều dài

2.1.2 Phương pháp

RFLP của ADN nhân là trình tự ADN có vị trí giới hạn ở 2 đầu và một trình tựđích ở giữa và không thể nhận biết bằng mắt thường được (do kích thước ADNquá lớn) Người ta phải dùng mẩu dò có gắn phóng xạ hay huỳnh quang để nhậnbiết các phân đoạn cắt hạn chế Khi mẩu dò liên kết với ADN đích theo nguyêntác bổ sung, người ta có thể xác định được những phân đoạn cắt hạn chế riêngbiệt từ một hỗn hợp các phân đoạn của ADN nhân trong chế phẩm xử lý cắt hạnchế RFLP sản xuất ra một loạt băng khi lai Southern được thực hiện với sự kếthợp đặc biệt của enzym hạn chế và trình tự mẩu dò Để thực hiện tốt kỹ thuậtnày cần phải có một loạt các đoạn ADN mẫu dò Tập hợp các mẫu dò đó đượcgọi là thư viện (7,8)

Kỹ thuật RFLP có thể được mô tả như sau: cắt ADN bằng một enzym giới hạnnào đó Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose để phân giải chúng theo trọnglượng phân tử Sau đó tiến hành lai, để lai, các mảnh ADN trong bản gel phảiđược biến tính thành sợi đơn và được chuyển lên một loại màng đặc biệt gọi làmàng lai (màng celuloze hoặc màng nilon) và ở đó chỉ có ADN được giữ lại Bêncạnh đó việc đánh dấu mẫu dò cũng được tiến hành ngay sau đó nhằm phát hiệnADN trên màng lai và nó cũng được sử dụng để lai với ADN trên màng Theonguyên tắc bổ sung, đoạn mẫu dò đã được đánh dấu sẽ tìm gặp và lai với đoạnADN tương đồng với nó, chúng liên kết với nhau theo bằng liên kết hydro Từ đó,chúng ta có thể phát hiện được các đoạn RFLP.

2.1.3 Ứng dụng của RFLP

RFLPs có thể sử dụng theo nhiều mục đích khác nhau RFLPs có thể sửdụng trong nghiên cứu quan hệ huyết thống, tội phạm bằng cách xác định nguồnADN mẫu.RFLPs có thể sử dụng để xác định tình trạng bệnh trong một cá thể.RFLPs có thể sử dụng để đo tỷ lệ tái tổ hợp để lập bản đồ di truyền với khoảngcách giữa các vị trí RFLP đo bằng centiMorgans.

Gen đánh dấu thông qua RFLP là phương tiện giúp cho việc tuyển chọn các tínhtrạng sâu bệnh Người ta xác định được kiểu đồng hợp tử hay dị hợp tử ở từnglocut và kỹ thuật này có thể áp dụng trong trường hợp phân tích đa gen Kỹ thuậtRFLP đã ứng dụng ở lúa mì với các gen ARN ribosom để nghiên cứu bệnh đạoôn trên lúa (Zhihong và cs, 1990) Kỹ thuật này còn áp dụng cho nhiều loại câytrồng như cà chua (bematzky và cs, 1986), rau diếp (lADNy và cs, 1987), khoaitây (Gebarat và cs, 1989) v.v.

Hiện nay, ở Việt Nam RFLP đã được ứng dụng trong nghiên cứu genKappa casein và õ-actoglobulin ở bò đực giống hướng sữa (10) Sử dụng RAPD

và RFLP định vị gen kháng rầy nâu ở lúa Indica (11) Lập bản đồ xác định vị trígen ảnh hưởng đến tính kháng mặn của lúa (Oryza sativa L)(12)…

Chỉ thị RFLP có vài trò trong nhiều khía cạnh của sinh học phân tử, đặc biệt tronglĩnh vực lập bản đồ phân tử Tuy nhiên, việc thực hiện phương pháp này mấtnhiều thời gian, công sức trong thiết kế mẩu dò Chi phí đắt, cho nên những chỉthị tiện ích hơn lần lượt ra đời.

2.2 Chỉ thị RAPD (Random Aplified Polymorphic ADN)2.2.1 Nguyên lý

Kỹ thuật RAPD là loại chỉ thị dựa trên nguyên tắc PCR sử dụng các đoạnmồi ngẫu nhiên Mồi thường gồm khoảng 10 nucleotide được sắp xếp theo mộttrình tự ngẫu nhiên nào đó, vì vậy xác suất bắt cặp một đoạn nucleotide tronggenome có 10 gốc bổ trợ sẽ vào khoảng 1/410

 1/1010 = 1/1.000.000 Có nghĩacứ khoảng 1 triệu gốc nucleotide sẽ có 1 vị trí gồm 10 gốc bổ trợ cho 10 gốc củamồi RAPD với trình tự xác định nào đó Do kỹ thuật này chỉ sử dụng một loại mồiđồng nhất cho cả hai đầu của đoạn ADN cần nhân bản, ngoài ra 2 đoạn mồi nàyphải được kết cặp trên hai sợi đơn khác nhau của chuỗi ADN và phải đi theo

chiều vào nhau, nên xác suất trên phải nhỏ đi nhiều Trên thực tế xác bắt cặpcủa các mồi còn nhỏ hơn nhiều lần nữa, bởi trong điều kiện PCR thông thườngchỉ tổng hợp được một đoạn ADN không dài quá năm nghìn nucleotide Đối vớiADN thực vật, các mồi RAPD thường cho sản phẩm PCR từ một vài băng đếnvài chục băng có chiều dài từ 100-5000 nucleotide Tuỳ vào các đối tượng thựcvật khác nhau mà

Tính đa hình trong kỹ thuật RAPD là do sự thay đổi base tại vị trí bắt mồihoặc do thay đổi nhiểm sắc thể trong vùng được nhân (xen đoạn, mất đoạn,hoặc đảo đoạn) đẩn đến thây đổi kích thước hoặc cản trở sự nhân bản của ADNđích Tính đa hình thướng được chỉ ra bởi sự có mặt hay vắng mặt của sảnphẩm được nhân bản từ một locut đơn (9)

3 Sản phẩm được điện di trên gel agarose

Kết quả phản ứng RAPD là sẽ xuất hiện rất nhiều phân đoạn ADN với các kíchthước khác nhau ở các locut khác nhau trên nhiễm sắc thể Số lượng các phânđoạn ADN được nhân bản phụ thuộc vào độ dài và cấu trúc của đoạn mồi Đốivới hầu hết các thực vật thì đoạn mồi có kích thước trung bình 9-10 nucleotide sẽnhân bản được từ 2-10 đoạn ADN.

2.2.3 Ứng dụng

Kỹ thuật RAPD có khả năng phát hiện được những thay đổi những thayđổi nhỏ trong hệ gen của các cá thể thân thuộc hơn hẳn so với kỹ thuật Isozym,kỹ thuật RFLP (Foolad et al, 1993) khi nghiên cứu về các dòng khoai tây đượcnuôi cấy thấy rằng: 63% trong tổng số 313 mồi phát hiện thấy đoạn ADN đa hìnhnhờ phương pháp RAPD trong khi RFLP là 16% và Isozym là 0 % Do sự phát

hiện tính đa hình dễ dàng nên kỹ thuật này được sử dụng cho việc nghiên cứutính thuần của giống.

Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây cho thấy kỹ thuật RAPD là một phươngpháp rất hiệu quả trong việc phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu ditruyền loài, lập bản đồ di truyền Kỹ thuật RAPD cũng được sử dụng để nhậnbiết và phân loại các giống cây khác nhau, sự đa hình di truyền trong các kiểugen lúa nước và lúa nương, sự đa hình di truyền giữa lúa Indica và Japonica,xác định sự đa hình của các cây tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo, tế bào huyềnphù và tế bào trần

Ưu điểm của kỹ thuật RAPD đánh giá toàn bộ hệ gen của sinh vật, đem lạitính đa hình cao Phương pháp tiến hành đơn giản, ít tốn kém Tuy nhiên, RAPDcũng có những nhược điểm do mồi không đặc hiệu nên có rất nhiều băng khóphân tích, dẩn đến khi phân tích kết quả rất dể sai lầm do cách đánh giá kháchquan của từng người Nhưng vì nó dể tiến hành nên phương pháp này hiện nayrất được ứng dụng ở những nước có điều kiện như nước ta Hiện nay, phươngpháp RAPD được ứng dụng trong nước ta trong nhiều lĩnh vực: như đánh giátính đa hình ở lúa, đậu tương, lạc chè, cà phê, bông, vải, nhạn… định vị genkháng rầy nâu ở lúa (4)

2.2 Phương pháp SSR (Simple Sequence Repeats)2.3.1 Nguyên lý

SSR hay còn gọi là Microsatellites, nó thường là những đoạn ADN ngắn cótrình tự lặp lại của hai đến sáu nucleotide như CACACACA, và chúng có khuynhhướng chiếm các vùng ADN không mang mã (vùng dị nhiễm sắc như: tâm độnghoặc đầu mút của nhiễm sắc thể), một vài đơn vị SSR (như CA) có thể được lặplại bốn lần, một số đơn vị khác lại được lặp lại từ hai đến ba mươi lần.

Vùng Microsatellites thường là những vùng siêu biến, nó không chỉ khácnhau giữa các loài mà còn giữa các cá thể có quan hệ gần gũi Đó chính là cơ sởtạo ra tính đa hình của phương pháp SSR Tính đa hình SSR thường biểu lộ tínhtrội (13)

Cách thông thường nhất để dò Microsatellites là thiết kế các mồi PCR nónằm duy nhất trong một locus trên genome, do vậy một cặp mồi PCR có thể đặctrưng cho từng cá thể trong loài, việc tạo ra các sản phẩm PCR có kích thướckhác nhau đó cũng chính là các Microsatellites có kích thước khác nhau.

2.3.2 Phương pháp

Phương pháp SSR dựa trên nguyên tắc PCR với mồi đặc hiệu khoảng 20nucleotide, với nhiệt độ bắt mồi 60 - 65oC, cho sản phẩm đặc hiệu có kích thước100-300 bp, Sản phẩm được điện di trên gel Acrylamide

2.3.3 Ứng dụng

Giá trị SSRs là nó sinh ra tính đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, baophủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR.Những chuỗi đa hình đơn giản này SSLPs đã được ứng dụng trong việc lập bảnđồ cả ở hai đối tượng động vật và thực vật, ở người Microsetellite được gọi làthế hẹ thứ hai của các chỉ thị phân tử, ở thực vật tần số và số lượngmicrosetellite đã được xác định trên các cây nhiệt đới như: bắp cải, đậu tương,lúa mì và 34 giống cây trồng khác Những kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra rằngở thực vật sự lặp lại (AT)n nhiều hơn ở động vật Trong khi ở những loài độngvật thì lại giàu microsetellite (GT)n Những nghiên cứu trên lúa ( Wu ADNtanksley, 1993), Ngô (Senio ADN Heun, 1993) và Arabidopsis (Bell ADN Ecker,1994) cũng cho kết quả tương tự Tuy nhiên chỉ thị này cũng có nhược điểm cơbản như quá trình thiết kế mồi rất tốn kém SSR thường được dùng để lập bảnđồ những vùng khó tính (vùng dị nhiểm sắc)

Ở Việt Nam kỹ thuật SSRs đã được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu tínhthuần của lúa [14], đánh giá quỹ gen của cây lúa [15], lập bản đồ phân tử cácđặc điểm rễ ở lúa cạn [16].

2.3 Phương pháp AFLP ( Amplified Fragment Length Polymophism)

Đây là phương pháp được phát triển bởi Vos và cs (1995) AFLP là mộtphương pháp có nhiều triển vọng trong việc phân tích tính đa dạng di truyền, lậpbản đồ hệ gen và các nghiên cứu khác có liên quan đến hệ gen AFLP khắc phục

được các đặc điểm của phương pháp RFLPs với sự thuận tiện, thích hợp dựatrên PCR.

Phương pháp sinh ra loại chỉ thị này được gọi là nhân bội chọn lọc những mảnhcắt giới hạn (Selective Restriction Fragment Amplification: SRFA) Phương phápnày có nhiều ưu điểm là cho độ đa hình cao, có thể được sử dụng để phân tíchADN từ bất kỳ nguồn gốc nào hay phức tạp đến đâu ( Zabeau M và cộng sự,1993) Do đó, kỹ thuật này có ảnh hưởng rất lớn đối với việc xác định tính đahình ADN.

Chỉ thị AFLP dựa trên cơ sở nhân bội có chọn lọc những mảnh cắt giớihạn từ ADN hệ gen Kỹ thuật này bao gồm các bước sau:

+ Bước 1: ADN hệ gen được cắt bằng hai loại enzym Một enzym cắt hiếm (arare cutter) như Pst I hoặc EcoR I, và một enzym cắt thường (a frequent cutter)như Mse I, Taq I Kết quả là sinh ra những mảnh cắt có một đầu là trình tự cắthiếm và một đầu là trình tự cắt thường Sau đó gắn phần thêm (adapter) vào haiđầu mảnh cắt (Restriction digetion-Ligation) Các adapter AFLP bao gồm haiphần là phần cốt lõi (core sequence) và chuỗi trình tự đặc hiệu của enzym.

Cấu trúc của adapter EcoR I là: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC

CATCTGACGCATGGTTCC-5’Cấu trúc của adapter MseI là

5’-GACGATGAGTCCTGAG

TACTCAGGACTCAT-5’

Vị trí giới hạn trên adapter được loại bỏ bằng cách thay đổi cặp bazo cuối cùng.Vị trí giới hạn của EcoRI là 5’-GAATTC-3’, nhưng C trên adapter được thay bằngG do vậy mà sau khi đã gắn adapter vào mảnh ADN hệ gen thì vị trí này khôngthể bị cắt một lần nữa Nhờ xảo thuật này mà ADN hệ gen có thể được cắt vàgắn đồng thời Nếu cắt ADN hệ gen bằng hai enzym EcoR I và Mse I sẽ có 3loại mảnh cắt gồm: mảnh có hai đầu cắt bởi Mse I, mảnh có hai đầu cắt bởi EcoRI, và mảnh cắt có một đầu là EcoR I và một đầu là Mse I.

+ Bước 2: Nhân bội những mảnh cắt giới hạn sử dụng mối đặc hiệu bổ trợadapter và trình tự giới hạn của enzym Bước này được thực hiện nhằm giảmbớt số lượng quá lớn của các mảnh ADN sau khi cắt và gắn adapter Sự nhânbội chọn lọc đạt được bởi sử dụng những mồi được kéo dài phía điểm cắt giớihạn bằng cách thêm các nucleotide vào vị trí cắt Do vậy mà chỉ có những mảnhADN có trình tự bổ trợ với các bazo thêm vào mới được nhân bội Bước này baogồm hai phản ứng nhân bội ADN mảnh cắt giới hạn Phản ứng thứ nhất được gọilà nhân sơ bộ (Pre-amplification) hay còn gọi là tiền nhân bội Phản ứng thứ haigọi là nhân chọn lọc (Selective PCR).

Các mồi AFLP gồm có 3 phần: chuỗi cốt lõi (CORE), chuỗi đặc hiệu enzym(ENZ) và phần thêm vào các nucleotide chọn lọc (EXT) (Zabeau, M ADN Vos,1993) Điều này được minh hoạ sau đây với 3 nuleotide thêm vào được biểu thịbằng NNN.

CORE ENZ EXTMồi EcoR I: 5’- GACTGCGTACC AATTC NNN-3’Mồi Mse I: 5’- GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3’

Các mồi AFLP cho các enzym cắt hiếm khác cũng tương tự như mồi EcoR I, TaqI hay Mse I, chỉ khác ở chỗ phần đặc hiệu ENZ là tương tự với trình tự cắt củamỗi loại enzym

Sử dụng phương pháp này có thể tạo ra một bộ tập hợp những mảnh cắt gịớihạn nhờ PCR mà không cần biết trình tự của chúng, cho phép nhân đặc hiệu mộtsố lượng lớn những mảnh cắt giới hạn Mỗi bộ gồm tập hợp một số lượng lớnnhững mảnh cắt ADN có thể phân tích đồng thời phụ thuộc vào độ phân giải củahệ thống phát hiện.

+ Bước 3: Điện di các sản phẩm PCR trên gel acrylamide, cho 50- 100 mảnh cắtgiới hạn, việc phát hiện các mảnh cắt này nhờ sử dụng các đồng vị phóng xạhoặc nhuộm bạc Kỹ thuật AFLP cung cấp một lượng vân tay ADN lý tưởng từADN của bất kỳ nguồn gốc nào Đây là một kỹ thuật thiết thực và đáng tin cậy bởisự nghiêm ngặt của điều kiện phản ứng.

Tính đặc hiệu của loại đa hình này còn thể hiện bởi trình tự đặc hiệu và số lượngcủa các nucleotide được thêm vào đầu 3’ của mỗi mồi Theo tính toán cứ thêmmột nucleotide vào mồi AFLP thì số lượng băng ADN nhân bội trong phản ứngPCR lại giảm xuống 4 lần vì trong số các mảnh ADN chỉ có 1 trong 4 nucleotideđược chọn lọc và nhân bội Như vậy khi thêm 2 nucleotide vào đầu của mồi thìsố băng ADN giảm xuông 42 lần, nếu thêm vào 3 nucleotide thì số lượng bănggiảm xuống 43 lần Việc thêm các nucleotide vào 2 đầu của các mồi AFLP dẫnđến kết quả tạo ra những bộ phụ (subset) của bộ vân tay Điều này chỉ ra rằngthêm các nucleotide lựa chọn là con đường chính xác và hiệu quả để lựa chọnmột bộ đặc hiệu những mảnh cắt cho quá trình nhân bội.

So với các kỹ thuật đánh dấu khác như : RAPD, RFLP hay SSR thì AFLP cho sốbăng đa hình cao nhất.Tuy nhiên không phải cho tính đa hình cao là đánh giátính đa hình chính xác nhất Nguyễn Đức Thành đã đánh giá tính đa hình của 12giống lúa nương cho thấy phương pháp AFLP cho số băng đa hình cao nhất,nhưng phương pháp SSR có mức độ phân biệt các giống lúa cao hơn so vớiAFLP Điều này thể hiện ở chổ hầu hết hệ số Jacard giữa các giống lúa tính toántheo đa hình SSR có giá trị thấp hơn hệ số Jacard giữa các giống lúa khi tínhtoán theo đa hình AFLP [3].

Ở Việt Nam, phương pháp AFLP đã tiếp cận và sử dụng thành công như ViệnCông nghệ Sinh học, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Lúa đồng bằng sông cửulong …

Ngoài các phương pháp chỉ thị trên còn có rất nhiều các chỉ thị phân tử khác nhưSTS, CAP, …

Do các ưu nhược điểm của các phương pháp trên mà chúng tôi đã chọn 2phương pháp RAPD và SSR phù hợp với điều kiện thí nghiệm hiện nay củaphòng Chúng tôi đã chọn 2 phương pháp này để tìm chỉ thị liên quan đến bệnhgỉ sắt ở lạc

3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

5: L08 x ICG99051(Kháng rỉ sắt)

3.2. Phương pháp nghiên cứu

a) Phương pháp thu mẫu

Các mẫu lá thu vào các ống effendoft, dữ trong nitơ lỏng và bảo quản ở -840Cb) Phương pháp tách ADN

Tách chiết theo phương pháp của Gawel và cs có cải tiến, trong đó tăng CTABtừ 2% lên 4% Kiểm tra độ sạch và hàm lượng ADN bằng đo quang phổ hấp phụkết hợp với việc điện di trên gel agaroza 0,8%

c) Phản ứng RAPD với mồi ngẫu nhiên:

Thể tích mỗi phản ứng 25l dung dịch, trong đó có 1X đệm PCR, 3mM MgCl2,150M 4dNTP, 300nM đoạn mồi, 0,75 đơn vị Taq polymeraza và 5-10ng ADNkhuôn Chu trình nhiệt là b1: 940C - 3 phút, b2: 940C - 1 phút, b3: 360C - 45 giây,b4: 720C - 10 phút, b5: 72 0C - 20 phút và b6: lưu giữ ở 40C Từ b2 đến b4 lặp lại45 chu kỳ Điện di phân tích sản phẩm RAPD trên gel agaroza 1,4%, nhuộm bảngel bằng Ethidium bromid và chụp ảnh.

d) Phản ứng SSR:

- Thể tích mỗi phản ứng 20l dung dịch, trong đó có 1X đệm PCR, 2-3mM MgCl2,250M 4dNTP, 1pM cặp mồi, 0,06U Taq polymeraza và 5-10ng ADN khuôn Chutrình nhiệt là b1: 940C - 2phút, b2: 940C - 45giây, b3: 57-640C - 45giây, b4: 720C -10 phút, b5: 72 0C - 20 phút và b6: lưu giữ ở 40C Từ b2 đến b4 lặp lại 45 chu kỳ.Điện di kiểm tra sản phẩm SSR trên gel agaroza 2%, nhuộm bản gel bằngEthidium bromid và chụp ảnh.