Chơng 3 Kết quả và thảo luận
3.2.1.Cải tiến quy trình tách ADN tổng số
Việc tách chiết axit nucleic thực vật để sử dụng trong phân tích sinh học
phân tử (PCR, RFLP, AFLP, RAPD, Southern blot ) là một trong những b… ớc
quan trọng và mất nhiều thời gian. Mức độ tinh sạch và hàm lợng của ADN thu đợc sẽ ảnh hởng trực tiếp tới sự thành công của các bớc tiếp theo.
Mặc dù đã có một số qui trình về tách chiết ADN từ lá vải của Dellaporta và cộng sự (1983), Draper và Scott (1988), Rogers và Bendich (1988), Nguyễn Văn Thiết và cộng sự (1997) nhng vì dịch chiết từ lá vải có chứa nhiều polysaccharide và các hợp chất polyphenol [32], [46]. Do đó, việc tạo ra một l- ợng lớn ADN hệ gen vải tinh sạch và có hàm lợng cao vẫn là một việc rất khó khăn [10], [24], [29], [53] [57].
Một phơng pháp tách chiết đợc gọi là tối u phải thu đợc ADN tinh sạch, có hàm lợng cao và nguyên vẹn. Phơng pháp đó cũng phải nhanh, ít tốn kém và nếu có thể phải tránh đợc việc sử dụng các hóa độc hại [27], [63].
Bớc đầu tiên trong quy trình tách chiết ADN từ vật liệu thực vật là phá vỡ thành tế bào để giải phóng các thành phần nội bào. Bớc này phải tiến hành nhanh để giảm đến mức tối thiểu lợng ADN bị đứt gãy cơ học trong quá trình tách chiết.
Có thể dùng enzym, các hóa chất làm tan hoặc các phơng pháp mạnh hơn nh nghiền bằng máy hoặc cối. Thông thờng, ta tiến hành nghiền mẫu trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn. Sau đó, phân huỷ màng tế bào để giải phóng ADN vào
trong đệm chiết. Bớc này thờng đợc thực hiện bằng cách sử dụng các chất tẩy nh là sodium dodecyl sulphate (SDS) hoặc cetyl tri-methylamonium bromide (CTAB). ADN giải phóng ra phải đợc bảo vệ khỏi nuclease nội bào. Do vậy EDTA thờng có mặt trong đệm chiết để tạo phức chất với các ion magie (một co- factor không thể thiếu của các enzym nuclease) [22], [25].
Dịch chiết ADN từ thực vật nói chung có chứa một lợng lớn ARN, protein, polysaccharide, tanin và các sắc tố, chúng có thể gây trở ngại cho ADN đợc chiết và khó tách ra [49], [51]. Hầu hết các loại protein sẽ đợc loại bỏ khỏi dịch chiết bằng cách biến tính và kết tủa khỏi dịch chiết bằng chloroform hoặc phenol. Còn các ARN thì có thể đợc loại bỏ khi ủ dịch chiết với RNAse ở nhiệt
độ 37oC. Chỉ riêng polysaccharide và các hợp chất polyphenol là rất khó loại
khỏi dịch chiết [23]. Polysaccharide gây ức chế hoạt tính của một vài enzym
(Taq polymerase) [32] và ảnh hởng đến việc xác định hàm lợng của axit nucleic
bằng quang phổ kế. Còn polyphenol (ở dạng oxi hoá) có khả năng liên kết đồng hoá trị với ADN cũng gây ảnh hởng đến quá trình nhân bản [43], [52], [70], [75].
Lúc đầu, khi sử dụng phơng pháp CTAB của Murray và Thompson (1980) để tách chiết ADN hệ gen từ lá vải chúng tôi thu đợc lợng ADN là
335,02 μg/1,0 g lá nguyên liệu. Tuy nhiên, chúng vẫn còn lẫn polysacharide và
các hợp chất polyphenol nh đợc chỉ ra bởi tỷ số đo quang phổ hấp thụ là OD260/
OD280 = 1,52 và OD260/ OD230 = 1,17. Mẫu ADN thu đợc rất nhày và có màu
vàng nhạt. Trên ảnh điện di, sản phẩm tách chiết ADN xuất hiện các băng ADN không nét và trên giếng cũng xuất hiện các vệt sáng.
Sau khi tìm hiểu các tài liệu về tách chiết ADN tổng số thì chúng tôi thấy rằng, NaCl ở các nồng độ lớn hơn 0,5M cùng với CTAB có thể loại bỏ đợc các loại polysacharide [32], [46], [50]. Khoảng nồng độ NaCl dao động từ 0,7M đến 6M [16] và phụ thuộc vào các loài thực vật khác nhau. Theo Fang và cộng
sự (1992), NaCl 1M có khả năng loại bỏ polysaccharide khỏi ADN do nó làm tăng tính tan của polysacharide trong ethanol vì vậy không kết tủa cùng với ADN trong ethanol 80% [29], [40].
Riêng đối với các hợp chất polyphenol thì có thể sử dụng Polyvinyl- pyrolidone (PVP) để loại bỏ. Vì PVP sẽ hình thành các liên kết hidro với các hợp chất polyphenol và có thể đợc loại bỏ bằng cách ly tâm [28], [31], [43].
Do vậy, các thí nghiệm tiếp theo đợc tiến hành với nồng độ NaCl trong đệm tách tăng từ 1,5M đến 2M, bổ sung PVP (Mr 10.000) vào đệm tách và có sử dụng đệm rửa trớc khi tách chiết. Khi đó, độ tinh sạch và chất lợng của ADN đã đợc cải thiện, các băng đợc chỉ ra trên điện di đồ sắc nét hơn. Tuy
nhiên, lợng ADN thu đợc lại giảm xuống còn 240,2 μg/1,0 g lá nguyên liệu
[64].
Tiến hành một số thay đổi khác bao gồm tỷ lệ đệm đối với lợng nguyên liệu, sử dụng 0,5% (v/v) mercaptoethanol, 6% CTAB (w/v), giảm thời gian ủ, rửa bằng ethanol 80%, sử dụng lá vải non... (với mỗi tham biến đợc kiểm tra một lần) đã thiết lập đợc một quy trình tách chiết ADN hệ gen vải (mục 2.2.3.1)
dễ thực hiện, mất ít thời gian và thu đợc khoảng 380 μg ADN/1,0 g lá nguyên
liệu [65].