Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu tính đa hình AND của các dòng vải thiều Thanh Hà

Kü thuËt RAPD

Các kỹ thuật “điểm chỉ ADN” phân tích và so sánh trình tự nucleotit của các đoạn ADN đã giúp cho việc phát hiện các loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và tiến hoá của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật [56]. Các kỹ thuật đợc sử dụng trong phân loại phân tử bao gồm: kỹ thuật isozym (đồng enzym), các kỹ thuật phân tích đoạn ADN nh phơng pháp đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), các kỹ thuật trên cơ sở của phản ứng PCR nh ADN tiểu vệ tinh (Simple Sequence Repeats - SSR), đa hình các đoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình chiều dài các đoạn ADN nhân bản (Amplified Fragment Length Polymorphism - AFLP), kỹ thuật điểm chỉ ADN đa locus, lai ADN, phân tích trình tự ADN. Nhợc điểm của kỹ thuật SSR là tốn kém về tiền của, công sức trong việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình (để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một số lợng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa đoạn lặp lại) [9].

Hiện nay, kỹ thuật RAPD đợc sử dụng trong nhận biết, phân loại và phân tích đa hình di truyền của các loài khác nhau nh phân tích sự đa dạng ADN giữa các giống Saccharum [35], xác định và phân loại các kiểu di truyền của các giống đậu Hà Lan [59], phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài Orobanche [55], phân tích các biến đổi di truyền trong loài cỏ ba lá trắng ở Bắc Mü [34]. Orozco và cộng sự (1994) đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát mối quan hệ di truyền và tiến hoá của các giống cà phê đợc lai tạo từ các loài bố, mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục đích tạo con lai có đặc điểm quý. Từ bản đồ liên kết gen có thể sẽ xác định đợc kiểu gen của cây bố mẹ và định vị đợc các gen điều khiển các tính trạng nh phẩm chất quả, kích thớc quả, sức sống của cây, tính kháng bệnh và khả năng chịu đựng các điều kiện môi trờng khác nhau mà không cần trồng thế hệ F1 để theo dâi [26].

Nguyễn Văn Thiết và cộng sự (1999) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các giống nhãn trồng ở Việt Nam và tìm ra 19 marker ADN đặc hiệu cho từng giống nhằm phục vụ nhu cầu chọn giống, xác định và đánh giá chất lợng giống [3], [11], [12]. Khi nghiên cứu mối quan hệ giữa cây vải cổ thụ ở huyện Kim Bôi, Hoà Bình với cây vải tổ ở huyện Thanh Hà, Hải Dơng và giống vải chua bằng kỹ thuật RAPD, Nguyễn Văn Thiết và cộng sự cho rằng, về mặt di truyền cây vải cổ thụ này thuộc giống vải thiều và có quan hệ rất gần gũi với cây vải tổ ở thôn.

Nguyên liệu và phơng pháp

Phơng pháp nghiên cứu

1 Vải thiều Thanh Hà (TH) TH1 Ông Nguyễn Văn Lợi, thôn Lơng Lại, xã Phợng Hoàng, TH 2 Vải thiều TH TH2 Ông Hoàng Văn Quế, thôn Hoàng Lại, xã Phợng Hoàng, TH 3 Vải thiều TH TH3 Ông Hoàng Văn Quế, thôn Hoàng Lại, xã Phợng Hoàng, TH 4 Vải thiều TH TH4 Ông Nguyễn Chí Thanh, thôn Ngoại Đàm, xã Phợng Hoàng, TH 5 Vải thiều TH TH5 Ông Nguyễn Công Phơng, thôn Ngoại Đàm, xã Phợng Hoàng, TH 6 Vải thiều TH TH6 Bà Nguyễn Thị Đào, thôn Ngoại Đàm, xã Phợng Hoàng, TH 7 Vải thiều TH TH7 Ông Nguyễn Đức Quế, thôn Ngoại Đàm, xã Phợng Hoàng, TH 8 Vải thiều TH TH8 Ông Đào Văn Hoành, xóm 6, Thanh Khê, TH. Lặp lại thí nghiệm 3 lần và thực hiện song song với mẫu đối chứng gồm 1 ml H2O + 2 ml dung dịch A. Lặp lại thí nghiệm 3 lần và thực hiện song song với mẫu đối chứng gồm 1 ml H2O + 2 ml dung dịch B.

Để hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 20 phút sau đó đo trên máy quang phổ ở bớc sóng 310 nm. B3: Bổ sung 1,5 ml đệm rửa vào ống eppendorf chứa bột nghiền lá vải, votex tạo thành dịch đồng nhất. Trong trờng hợp này phải xác định chất lợng của ADN tổng số bằng phơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%.

Bản gel đợc lấy ra khỏi khay điện di và đa vào dung dịch EtBr 0,5μg/ml trong thời gian khoảng 15 phút trên máy lắc nhẹ. Chúng tôi tiến hành sàng lọc trên 80 đoạn mồi ngẫu nhiên do phòng Công nghệ tế bào thực vật cung cấp. Kết quả chọn đợc 26 đoạn mồi ngẫu nhiên cho tính đa hình để phân tích hệ gen của 45 dòng vải nghiên cứu.

Phản ứng PCR đợc thực hiện trên máy PCR System 9700 với thể tích 20 μl (trong ống eppendorf dung tích 500 μl) trong đó chứa các thành phần và nồng độ của các chất tham gia phản ứng đợc trình bày trong bảng 3. Nhập số liệu vào máy tính và xử lý số liệu bằng phần mềm NTSYS Version 2.0 để tạo các biểu đồ hình cây thể hiện mối tơng quan di truyền giữa các dòng vải nghiên cứu. Trong đó Sij: hệ số giống nhau giữa hai cá thể i và j a: số phân đoạn ADN xuất hiện ở cá thể i và j.

So sánh hệ số tơng quan kiểu hình theo 3 phơng pháp: SM, Dice, Jaccard và 4 phơng pháp phân nhóm UPGMA (Phân tích các nhóm phân tử không cùng trọng lợng), WPGMA (Phân tích các nhóm phân tử có cùng trọng lợng), liên kết hoàn toàn, liên kết đơn lẻ. Hàm lợng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content = PIC) của mỗi mồi xác định theo công thức PIC = 1 - ∑Pij2, trong đó Pij là tần số allen thứ j của kiểu gen i đ-. Để khẳng định kết quả phân nhóm theo sơ đồ hình cây, chúng tôi biểu diễn kết quả theo phơng pháp so sánh đa chiều (MDS = Multidimensional Scaling, Kruskal & Wish, 1978) và biểu đồ phân tích theo toạ độ chính (PCA = Principal Co-ordinate Analysis, Hauser & Crovello, 1982) [19], [74].