khảo sát tình hình nhiễm các tuýp hpv (human papillomavirus) ở phụ nữ tp.hcm bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Mở đầu Ung thư cổ tử cung là bệnh lý phổ biến, đứng hàng thứ ba trong số các ung thư ở phụ nữ trên thế giới và là một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu của giới nữ , nhất là ở nhữ

SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM CÁC TÝP HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS)

Ở PHỤ NỮ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI : TS.BS Vũ Thị Nhung BV Hùng Vương

CƠ QUAN PHỐI HỢP CHÍNH : 1.Đại học Khoa học tự nhiên-ĐHQG-HCM, Khoa Sinh học, bộ môn Vi sinh-sinh học phân tử

2.Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, Khoa Y, bộ môn Vi sinh

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI : Sở Khoa Học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội Đồng nghiệm thu đề tài ngày

15/9/2006)

Năm 2006

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa……… ………… i

Mục lục……… ii

Danh mục các chữ viết tắt……… iii

Bảng đối chiếu Việt –Anh……… iv

Danh mục các bảng ……… v

Danh mục các hình ……… vi

MỞ ĐẦU ……… ………… 1

CHƯƠNG I : Tổng quan tài liệu……… ……… 3

A) NHỮNG ĐẶC ĐIỂM CỦA HPV ……… 3

1 Cấu tạo……… 3

2 Bộ gene HPV……… 4

3 Dịch tễ học của HPV……… 8

4 Các týp HPV ……… 9

5 Cơ chế sinh bệnh ……… 12

6 Những yếu tố nguy cơ nhiễm HPV ……… 16

B) XÉT NGHIỆM TẦM SOÁT HPV……… 16

CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… ……… 21

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ……… 39

CHƯƠNG IV : BÀN LUẬN ……… 50

KẾT LUẬN……… ……… 58

ĐỀ NGHỊ ……… 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 60

PHỤ LỤC ……… 65

iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ASCUS Atypical squamous cells of undetermined significance CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia

CIN1 grade 1 Cervical Intraepithelial Neoplasia

CIN2 grade 2 Cervical Intraepithelial Neoplasia

CIN3 grade 3 Cervical Intraepithelial Neoplasia

CNV Công nhân viên

CTC Cổ tử cung

DCTC Dụng cụ tử cung

GPB Giải phẫu bệnh

HPV Human papilloma virus

HSIL High grade of squamous intraepithelial lesion

LSIL Low grade of squamous intraepithelial lesion

ORF Open reading frame

PCR Polymerase Chain Reaction

TP HCM Thành phố Hồ Chí Minh

URR Upstream Regulatory Region

BẢNG ĐỐI CHIẾU VIỆT - ANH

ASCUS Tế bào gai không điển hình không rõ ý nghĩa CIN Dị sản

CIN1 Dị sản nhẹ

CIN2 Dị sản vừa

CIN3 Dị sản nặng

HSIL Tổn thương trong thượng mô gai mức độ cao IARC Cơ quan nghiên cứu Ung thư Thế giới

LSIL Tổn thương trong thượng mô gai mức độ thấp Pap Phết tế bào âm đạo – cổ tử cung

WHO Tổ chức Y tế Thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

3.2 Phân bố theo các đặc điểm khác của đối tượng nghiên cứu 39 3.3 Phân bố theo các đặc điểm khác của đối tượng nghiên cứùu 40 3.4 Tình trạng bệnh Phụ khoa của đối tượng nghiên cứu 40

3.7 Kết quả PCR tầm soát và định týp HPV 42

3.9 So sánh Kết quả Giải phẫu bệnh cổ tử cung và kết quả

3.10 Liên quan giữa GPB và độ nguy cơ của các nhóm HPV 45 3.11 So sánh Kết quả tế bào cổ tử cung và kết quả theo PCR 45 3.12 Liên quan giữa tình trạng kinh tế và HPV 46

3.14 Liên quan giữa nhóm tuổi và Các tổn thương 47

tiền ung thư Cổ tử cung

DANH MỤC CÁC HÌNH

4 Sự tiến triển của tổn thương cổ tử cung do HPV 11

7 Quy trình tầm soát tổn thương tiền ung thư cổ tử cung 19

Mở đầu

Ung thư cổ tử cung là bệnh lý phổ biến, đứng hàng thứ ba trong số các ung thư

ở phụ nữ trên thế giới và là một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu của giới nữ , nhất là ở những nước đang phát triển mặc dù thực tế thì đây là bệnh có thể phòng ngừa được[12] Mỗi ngày có khoảng 1400 phụ nữ được chẩn đoán mắc bệnh Ung thư cổ tử cung, 750 người chết vì bệnh này [5] Như vậy, hàng năm có 500.000 trường hợp mắc mới và có khoảng 270.000 người tử vong vì ung thư cổ tử cung [5] .Đặc biệt là khoảng 50% các trường hợp ung thư cổ tử cung xảy ra ở Châu Á Theo IARC thì tỷ lệ và tử suất ung thư cổ tử cung ở các nước đang phát triểàn tăng cao vì những nơi đó không có chương trình tầm soát ung thư cổ tử cung[30]

Tại Việt Nam , theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2.000 thì tỷ lệ ung thư cổ tử cung vào khoảng 16-24/100.000 Tại TP Hồ Chí Minh, đây là bệnh có tỷ lệ mắc cao nhất ở người phụ nữ (tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi là 28,6/100.000 dân)[37ø] Trong thập niên 70, Human papillomavirus (HPV) được mô tả như là một trong những tác nhân gây biến đổi tế bào cổ tử cung (dị sản cổ tử cung), tiền đề của ung thư cổ tử cung[12].Người ta cho là nguy cơ do HPV chiếm khoảng 82% ở các nước đang phát triển[38] Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định sự liên quan mật thiết giữa HPV và ung thư cổ tử cung Ngoài ra nó còn có vai trò trong ung thư vùng hậu môn, âm hộ, âm đạo và dương vật cũng như một số ung thư vùng hầu họng Người ta phân biệt các týp có nguy cơ thấp ít khi làm tiến triển đến ung thư và các týp nguy cơ cao thường gây ung thư Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu dịch tễ học mang tính đại diện được tiến hành trên đề tài này

Như vậy , việc tìm hiểu về tình trạng nhiễm các genotýp HPV ở phụ nữ là vấn đề rất đáng quan tâm vì nhờ đó có thể góp phần tiên lượng khả năng diễn tiến bệnh khi

chưa tiến đến ung thư để các Bác sĩ lâm sàng có thể có thái độ xử trí thích hợp , có lợi cho ngươi bệnh Đó là lý do chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Khảo sát tình hình nhiễm các týp HPV (Human Papilloma Virus) ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh bằng kỹ thuật sinh học phân tử”

Mục tiêu nghiên cứu :

• Mục tiêu tổng quát :

Nghiên cứu dịch tễ học các genotýp HPV ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh độ tuổi 18-69

• Mục tiêu chuyên biệt :

1.Xác định tỉ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh độ tuổi 18-69 2.Xác định tỉ lệ nhiễm các týp HPV nguy cơ cao

3.Xác định mối tương quan giữa hình ảnh tế bào học, mô bệnh học với các týp

HPV

4 Đánh giá xét nghiệm PCR chẩn đoán và định týp HPV

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

A) NHỮNG ĐẶC ĐIỂM CỦA HPV (HUMAN PAPILLOMA VIRUS)

HPV có cấu trúc capsid không vỏ, đối xứng xoắn ốc Virion có đường kính 52-55nm, vỏ gồm 72 đơn vị capsomer Mỗi đơn vị là một pentamer của protein cấu trúc L1 kết hợp với một protein L2 (protein này có thành phần kháng nguyên được sử dụng trong phản ứng miễn dịch đặc hiệu) Riboxom có hệ số lắng là 21S Tiểu phần lớn có một vòng xoắn cuộn có thể chuyển đổi thành tiểu phần nhỏ trong quá trình sao chép Ngoài ra, một tiểu phần thứ 3 có hệ số lắng là 14S sẽ xuất hiện chịu trách nhiệm sao chép lại DNA tế bào chủ khi bao trong Virion Khi đó, capsid chứa DNA tế bào chủ được gọi là Virion giả hay Pseudovirion[14]

Hình 1: Cấu trúc, hình dạng HPV

2 Bộ gen HPV

2.1 Cấu trúc bộ gen của HPV

Đó là một DNA mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại ở dạng siêu xoắn hình vòng, chứa khoảng 7800-8000 cặp base, có 10 khung đọc mở ORF [22] Sự sao chép, phiên mã xảy ra trên một mạch và theo một chiều duy nhất

Bộ gen được phân làm 3 vùng [22]:

• Vùng điều hoà URR (Upstream Regulatory Region) hay cũng còn gọi là vùng điều hoà dài LCR (Long Control Region): chiếm 10% chiều dài bộ gen, chứa khoảng 800-1000 cặp base tùy từng týp Đây cũng là vùng biến động nhất trong bộ gen HPV Trình tự vùng URR bao gồm:

o Trình tự tăng cường: là nơi gắn của các nhân tố phiên mã

(AP-1, NF(AP-1, oct (AP-1, TEF(AP-1, TEF2, YY1 …)

o Promoter (gen khởi động) cho sự phiên mã tổng hợp RNA (được gọi là P97 ở HPV16, và P105 ở HPV18) Promoter này bao gồm một hộp TATA và vùng khởi đầu phiên mã

o Điểm khởi đầu sao chép ORI

Protein capsid (L1)

Acid nucleic (DNA)

Hình 2: Cấu trúc bộ gen của HPV

• Vùng gen sớm: gồm 6 gen, ký hiệu là E1, E2, E4, E5, E6, E7 và các khung đọc mở ORF

• Vùng gen muộn: gồm 2 gen, ký hiệu là L1, L2

2.2 Chức năng các vùng gen và protein của chúng [ 10,14 ,19,44]

2.2.1 Gen E1:

Là một trong 2 vùng bảo tồn nhất ở HPV (cùng với vùng L1) Chức năng chính của E1 là mã hóa cho protein gắn đặc hiệu vào DNA E1 có hoạt động tháo xoắn không phụ thuộc ATP, rất cần thiết cho sự sao chép của virus

2.2.2 Gen E2:

Đây là gen mã hóa chủ yếu cho các nhân tố phiên mã của tế bào Bên cạnh đó, E2 còn tương tác với E1, giúp E1 dễ dàng gắn với điểm khởi đầu sao chép và có thể bắt đầu sao chép tăng cường hơn Các thí nghiệm cho thấy rằng ở nồng độ

Phá vỡ chu trình tế bào Điều khiển sự sao

chép và biểu hiện gen của virus

Protein capsid

Sự sao chép của virus

Phóng thích HPV Protein tín hiệu màng Sự biểu hiện gen

thấp, E2 tăng cường sự phiên mã, nhưng ở nồng độ cao, nó lại ức chế sự phiên mã Sự chèn DNA virus vào bộ gen của vật chủ thường làm gián đoạn gen E2 làm ảnh hưởng tới khả năng ức chế sự biểu hiện protein E6, E7

2.2.5 Gen E6:

Gen này mã hóa protein E6, cực kỳ quan trọng trong vai trò gây ung thư, nhất là ở những týp được xếp vào nhóm nguy cơ cao gây ung thư Protein E6 gồm 151 acid amin hình thành 4 cấu trúc Cys-X-X-Cys gắn với kẽm điều hòa Ba chức năng chủ yếu của E6 cũng là những chức năng rất nguy hiểm đối với tế bào chủ:

1 Liên kết hoặc không liên kết với protein E7 đều có khả năng kích thích tế bào chủ phân bào mạnh mẽ vã sự phân chia này là mãi mãi, tức tế bào chủ sẽ là những tế bào bất tử hóa

2 Gắn kết với protein p53, một protein ức chế khối u của tế bào chủ, làm tăng sự phân giải của p53 bởi hệ thống phân giải protein ubiquitin của tế bào và làm giảm khả năng ức chế khối u của protein này

3 Liên kết với gen ras trong quá trình bất tử hoá tế bào cơ bản của chuột và kích thích sự phát triển của tế bào NIH 3T3, đồng thời hoạt hoá promoter E2 của Adenovirus

2.2.6 Gen E7:

Tuy nhỏ hơn E6, protein E7 được mã hóa từ gen này chỉ gồm 98 acid amin và hình thành 2 cấu trúc gắn kẽm, nhưng E7 cũng có vai trò không kém phần quan trọng trong việc gây ung thư ở tế bào chủ Trước hết là sự tương đồng ở cấu trúc gắn kẽm với E6, đều là cấu trúc Cys-X-X-Cys, góp phần liên kết chặt chẽ với E6 hơn, hỗ trợ nhau tác động lên sự bất tử hoá tế bào chủ

Nếu như E6 cản trở quá trình tự sửa sai của tế bào chủ thông qua liên kết với p53 hì E7 thực hiện vai trò này thông qua kiên kết với pRB, cũng là một gen ức chế khối u Ái lực liên kết này cao gấp 10 lần ở những týp thuộc nhóm nguy cơ cao so với nhóm nguy cơ thấp Điều này làm giải phóng số lượng lớn nhân tố phiên mã E2F tự do, kích thích quá trình phiên mã, kéo dài tuổi thọ tế bào

yếu và không gắn với DNA Vùng L2 mã hóa protein vỏ capsid phụ, có trọng lượng

phân tử 49-60 kDa, lại được phosphoryl hóa cao và có khả năng gắn DNA

Hiện nay, xét nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction) và lai DNA là

những phương pháp ít tốn công nhất và có thể dùng thường qui trong phòng xét

nghiệm để tìm HPV HPV gồm hơn 100 týp, Vị trí xâm nhập và khu trú đầu tiên là

vùng thượng bì (tầng trên của lớp biểu mô), chủ yếu ở những biểu mô sừng hoá hay

những biểu mô gai vì HPV có tính hướng rất cao với tế bào biểu mô da và niêm mạc,

nhất là ở những vùng niêm mạc ẩm ướt, nhầy[44].chúng có thể gây những tổn thương u

nhú dạng mụn cóc thường lành tính ở thanh quản, da tay, chân, niêm mạc miệng, bộ

phận sinh dục Tuy nhiên, có một số týp thường kết hợp với ung thư Nhiễm HPV là

một trong những bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến nhất Có trên 30 týp

lây truyền từ người sang người qua quan hệ tình dục Người ta chia HPV ra làm 2

nhóm : nhóm nguy cơ cao và nhóm nguy cơ thấp Những nhóm nguy cơ cao thường có

mối liên hệ với bệnh ung thư cổ tử cung

3 Dịch tễ học của HPV Hầu hết các trường hợp nhiễm HPV không có triệu chứng Đó là lý do tại

sao số trường hợp mắc bệnh không được ghi nhận Ngoài ra, những xét nghiệm tầm

soát HPV cũng mới được thực hiện nên những báo cáo về các trường hợp bệnh mới

mắc thường thấp hơn thực tế Vì vậy, dự đoán về số ca mới hàng năm vào khoảng

900.0000 người Theo thống kê có được thì có vào khoảng 269 triệu phụ nữ trên thế

giới nhiễm HPV.Tình trạng viêm nhiễm này dẫn đến 440.000 người bị ung thư cổ tử

cung hàng năm (Châu Aâu có 23.000 – 35.000 ở Châu Mỹ Latin và 18.000 người ở

Bắc Mỹ) [26]

Số phụ nữ cóù nguy cơ nhiễm HPV khoảng 2 tỷ người Đỉnh tuổi nhiễm HPV

thay đổi tùy địa phương Thí dụ như ở Phần Lan, nhiễm HPV thường xảy ra trong độ

tuổi 20 –29 tuổi Nghiên cứu trên 10.758 phụ nữ tuổi từ 20-29 của Susanne K Kjaer ở

Copenhagen tỷ lệ nhiễm HPV là 14% [26] cũng như một nghiên cứu khác của Anna R.Giuliano ở vùng biên giới Hoa Kỳ- Mexico cho tỷ lệ nhiễm HPV là 14,4% trong nhóm 2319 phụ nữ từ 15-79 tuổi [1] Có nghiên cứu cho thấy nguy cơ nhiễm HPV là 79% Phụ nữ Tỷ lệ này cũng tương đương trong nam giới Cách truyền bệnh chủ yếu qua quan hệ tình dục[26]

4 Các týp HPV

HPV là một trong những virus có nhiều týp nhất Đã có gần 120 týp được biết đến, trong đó 20-30% là những týp chưa được phân loại vì bộ gen chỉ mới được giải trình tự một phần

Sự định týp [22] HPV không dựa vào huyết thanh như sự định týp ở những loại virus khác (virus gây viêm gan, HIV …) mà dựa trên sự tương đồng DNA Khi một týp HPV có ít nhất 10% gen vùng E6, E7, L1 khác với các týp đã biết trước đó thì sẽ được xem là một týp mới Ngoài ra, người ta còn phân loại đến mức týp phụ và những dạng dễ thay đổi Được xếp vào týp phụ khi bộ gen của chúng khác nhau 2-10% trong cùng 1 týp đã biết Nếu sự khác nhau chiếm 1-2% nằm trong vùng mã hóa, hoặc 5% trong vùng không mã hóa thì được xem là dạng dễ thay đổi Mỗi týp có một sự thích nghi cao với một loại biểu mô nhất định Ví dụ như týp 1, 2, 3, 10, 27 … thường gây bệnh ở da, còn týp 16, 11, 18 … lại chủ yếu tấn công cơ quan sinh dục người Điều này phụ thuộc vào cách tác động khác nhau của những vùng gen khác nhau ở mỗi týp đối với protein bao phủ tế bào chủ tại những vị trí khác nhau trên cơ thể [19,44] Người ta xác định có đến hơn 38 týp HPV xâm nhiễm tế bào biểu mô gai ở vùng cơ quan sinh dục người Trong đó, phổ biến nhất là các týp 6, 11, 16, 18, 42, 43,

44, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56 .[22]

Tùy thuộc vào khả năng dẫn đến ung thư (tạo khối u ác tính) người ta chia các týp HPV làm 2 nhóm:

• Nhóm “nguy cơ thấp” (low-risk): những týp HPV thuộc nhóm này chỉ gây những mụn cóc hoặc khối u lành tính Bộ gen của chúng tồn tại độc lập với tế bào chủ Các týp HPV trong nhóm nguy cơ thấp thường gặp là :

L1 : 6, 42,43,81

L2 : 11, 61,70,71

• Nhóm “nguy cơ cao” (high-risk): bao gồm những týp có khả năng gắn xen DNA của chúng vào bộ gen của người, gây ra những rối loạn hình thành các khối u ác tính Mối liên quan giữa HPV và ung thư cổ tử cung được nói đến lần đầu tiên vào những năm 70 Những yếu tố nguy cơ chính là týp HPV (16, 18, 31, 45), lớùn tuổi và mức độ tổn thương cổ tử cung

Các týp HPV trong nhóm nguy cơ cao là :

Mặc dù có sự khác biệt về tần suất nhiễm các týp HPV giữa các vùng địa lý nhưng týp 16,18 thường gây ung thư ở hầu hết các nơi trên thế giới [ 21,27]

Hầu hết những trường hợp nhiễm HPV là tạm thời Nếu bệnh nhân có sức đề kháng mạnh thì có thể khỏi bệnh Do cơ chế nào chưa rõ , có khoảng 5-10% phụ nữ nhiễm HPV nhóm nguy cơ cao sẽ còn tồn tại tình trạng nhiễm HPV này Những bệnh nhân ấy có khả năng tiến triển sang các tổn thương tiền ung thư cổ tử cung , nếu

không điều trị sẽ tiến đến ung thư Kết quả của chương trình tầm soát ung thư cổ tử cung ở British Colombia cho thấy sự thoái triển của tổn thương CIN còn tuỳ thuộc vào tuổi của bệnh nhân Phụ nữ dưới 32 tuổi thì tỷ lệ thoái triển là 84%, trong khi đó đối với người trên 32 tuổi thì tỷ lệ này là 40% [23] Theo nghiên cứu của Rozendaal L (1996), bệnh nhân có phết tế bào cổ tử cung với HPV týp nguy cơ cao (+) sẽ có nguy

cơ tiến triển sang CIN3 gấp 116 lần so với nhóm có phết tế bào không bị nhiễm HPV týp nguy cơ cao[26] Gần đây, các nhà khoa học đã tìm thấy sự hiện diện của HPV trong 93-100% các trường hợp carcinom tế bào gai ở cổ tử cung Một số týp gây nên những u nhú quanh bộ phận sinh dục, hậu môn thường gọi là bệnh mào gà (condylomata acuminatum) đó là týp 6, 11 thường xuất hiện vài tuần hoặc nhiều tháng tế bào nhân to, nhiều thùy nhiều năm sau khi tiếp xúc Khảo sát vi thể các tổn thương gây ra do HPV cho thấy lớp tế bào bề mặt có hình ảnh nghịch sừng (dyskeratosis), cận sừng (parakeratosis)ù và những tế bào rỗng (koilocyte) có nhân to,

đa nhân, tăng sắc là đặc trưng của tế bào nhiễm HPV[25]

Loại ung thư cổ tử cung thông thường nhất là ung thư tế bào gai và thường do HPV 16,18 Ung thư tế bào tuyến thì ít , chủ yếu có liên quan đến HPV 18 [25]

Sự tiến triển của bệnh

Niêm mạc

bình thường

Nhiễm HPV;

Tế bào rỗng CIN I

Tổn thương thượng mô gai mức

độ thấp (LSILs)

CIN II CIN III

Tổn thương thượng mô gai mức

độ cao (HSILs)

Carcinoma

Tầm soát

Điều trị

Hình 4 : Sự tiến triển của tổn thương cổ tử cung do HPV

5 Cơ chế sinh bệnh

HPV có cấu trúc DNA, sau khi sát nhập vào bộ gen tế bào ký chủ thì vùng gen E6, E7 điều khiển tổng hợp protein E 6, E 7 theo chiều hướng bất thường làm kích hoạt những chất sinh ung thư , bất hoạt những gen ức chế sự tạo khối u mà HPV không giết chết tế bào chủ. Các protein này gắn kết và vô hiệu hóa chức năng của protein điều hòa tăng trưởng tế bào dẫn đến sự phân chia tế bào liên tục một cách bất thường và hậu quả là phát sinh ung thư Vì cần có diễn tiến qua nhiều giai đoạn của cơ chế sinh ung như vậy nên thật ra chỉ có một tỷ lệ thấp phụ nữ nhiễm HPV nguy cơ cao sẽ bị ung thư cổ tử cung

Hình 5 : Chu kỳ sống của HPV

Chu kỳ sống của HPV có thể chia làm 4 giai đoạn:

Giai đoạn xâm nhập:

Chỗ xâm nhiễm đầu tiên của HPV là những tế bào nằm ở những vị trí dễ bị tổn thương, có thể chỉ là những vết thương rất nhỏ gây ra do quan hệ tình dục (bề mặt trong môi nhỏ ở nữ giới, bao quy đầu ở nam giới) Khả năng virus xâm nhập vào những tế bào đáy này là rất cao Sau đó, chính sự làm lành lặn ở chỗ vết trầy xướt này bằng việc kích thích sự phân chia những tế bào đáy sẽ dẫn đến làm tăng nhanh thêm sự sao chép của HPV trong tế bào chủ vì đây là giai đoạn mà HPV chỉ sao chép được khi tế bào chủ sao chép Chính vùng dễ bị tổn thương nhất trong cơ quan sinh dục trở thành nơi phổ biến nhất cho virus phát triển

Giai đoạn tiềm ẩn:

Đây là giai đoạn có sự xâm nhiễm của HPV nhưng các kỹ thuật xét nghiệm tế bào học, hình thái học, soi phóng đại đều cho kết quả tế bào bình thường Chỉ

DNA virus tồn tại trong tế bào dạng episome

Lớp tế bào đáy Thành lập

Papilloma

những xét nghiệm sinh học phân tử có độ nhạy cao như PCR, lai phân tử mới có khả năng phát hiện thấy HPV

Thời kỳ này có thể kéo dài 1-8 tháng, tuỳ tình trạng sức khoẻ mỗi người Trong giai đoạn này, người ta không xác định được là hệ miễn dịch có hoạt động hay không Cũng có ý kiến cho rằng lúc này hệ miễn dịch không hoạt động vì đòi hỏi sự phát triển số lượng virus và những sản phẩm xâm nhiễm đến một giới hạn nào đó mới kích thích được hệ miễn dịch hoạt động Hầu hết những bệnh nhân đều chỉ có những biểu hiện thoáng qua và không xác định được

Giai đoạn nhân bản mạnh:

Nếu như ở giai đoạn trên, HPV chỉ sao chép cùng tế bào chủ thì bước vào giai đoạn này, HPV sẽ là tác nhân kích thích tế bào chủ phân chia mạnh Từ sự hiện diện thấp lượng DNA virus ở những tế bào đáy , sẽ có sự gia tăng mạnh số lượng DNA virus lẫn những sản phẩm xâm nhiễm ở những tế bào biểu mô gần bề mặt nhất (sự tích lũy protein và những dạng virion của chúng…)

Sự xâm nhiễm có hiệu lực 3-8 tháng trước khi hệ miễn dịch bắt đầu hoạt động Chúng phát triển mạnh các mạch máu bao quanh (nhất là ở những týp 6, 11) hình thành mụn nhỏ, dẹt, phẳng hoặc lồi, đến những biểu hiện ban đầu của bệnh condyloma, cận sừng (acanthosis) , bệnh tế bào rỗng (koilocytosis) , loại không điển hình nhân (nuclear atypia) …

Giai đoạn có hoạt độâng của tế bào chủ:

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định sự thành công hay thất bại của hệ miễn dịch khi đối phó với virus.Thời gian này thường từ 3-6 tháng, sau khi đã qua giai đoạn nhân bản mạnh của virus, có thể nhanh hơn hoặc là không bao giờ Nguyên nhân là vì HPV không xuyên xuống màng đáy biểu mô, chúng chỉ xâm nhập vào các tế bào biểu mô lớp trên, mà các tế bào này lại rất kém trong hoạt động trình diện

kháng nguyên Nhờ đó, HPV có nhiều thuận lợi không bị hệ miễn dịch của tế bào chủ nhận diện và tiêu diệt Chúng chỉ việc tồn tại an toàn trong những tế bào biểu mô nguyên vẹn Chỉ khi có những tổn thương tế bào (do cọ xát hay hóa chất điều trị) làm lộ HPV cho hệ miễn dịch nhận diện Khi đó, hệ thống miễn dịch sẽ được hoạt hóa và tấn công các tế bào bị nhiễm, khởi đầu là hoạt động của các đại thực bào (macrophages), bạch cầu đơn nhân (monocytes)… Chúng sẽ giải phóng các cytokine như interferon α, β, γ, interleukine… Interferon có tác dụng làm chậm sự phát triển của virus, làm giảm những sản phẩm xâm nhiễm của chúng Cytokine thì tấn công như là một tác nhân hóa học bằng những phần tử dính kết lên tế bào cạnh mạch máu, kêu gọi bạch cầu đến tiêu diệt vùng bị nhiễm

Kết quả của tất cả những hoạt động này là sự gia tăng cytokine của những tế bào langerhan hay tế bào nhánh (dendritic) Tế bào dendritic hoạt động di chuyển qua mạch lymphô đến vùng hạch lympho, nơi mà chúng thể hiện kháng nguyên HPV lên bề mặt để lympho T nhận diện Khi đó sẽ hình thành các dòng lympho T đặc hiệu HPV, chúng di chuyển theo dòng máu đến vùng bị nhiễm Đầu tiên, chúng sẽ tiếp cận các tế bào nội mô trong những mạch máu bên dưới vùng rối loạn do HPV gây ra thông qua phân tử dính kết trên bề mặt kháng nguyên, từ đó, theo sự khác biệt nồng độ cytokine qua thành mạch máu vào bên trong biểu mô nhiễm HPV Tế bào T đặc hiệu và tế bào giết tự nhiên (natural kill cell) sẽ vào bên trong những mụn cóc, tiêu diệt tế bào bị nhiễm HPV Bạch cầu đơn nhân và đa nhân sẽ tiêu huỷ những mảnh vụn tế bào, bao gồm cả DNA của HPV Sự liên kết những yếu tố này giúp làm giảm kích thước mụn cóc, làm sạch vùng bị nhiễm Tế bào T đặc hiệu sẽ trở thành tế bào nhớ ngăn chặn sự xâm nhiễm trở lại

Sau khoảng 9 tháng, bệnh nhân được chia thành 2 nhóm: hết bệnh hoặc bệnh vẫn tiếp diễn Tuy nhiên ở những bệnh nhân hết bệnh, khả năng hết hoàn toàn HPV

và khả năng HPV quay lại giai đoạn tiềm ẩn là không xác định được, nên vẫn phải tiếp tục theo dõi và hạn chế lây nhiễm Còn ở những bệnh nhân không thuyên giảm thì khả năng chuyển sang ung thư ác tính là cực kỳ cao

6 Những yếu tố nguy cơ nhiễm HPV :

 Hành vi quan hệ tình dục : số bạn tình, bạn tình bị nhiễm HPV, mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục (Chlamydia,Neisseria,Trichomonas, Herpes Simplsex virus)

 Tuổi : dưới 25 tuổi thì tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất

 Tình trạng hệ thống miễn nhiễm của cơ thể : dễ bị nhiễm HPV đối với những người có HIV (+), thai phụ, người được cấy ghép mô, tiểu đường, đang được hoá trị, hút thuốc lá ( do sự tích tụ nhiều chất nicotin trong chất nhầy cổ tử cung và tình trạng miễn dịch ở người hút thuốc kém hơn người không hút thuốc), điều trị Corticoid

B) XÉT NGHIỆM TẦM SOÁT HPV

Ở các phương pháp chẩn đoán lâm sàng, kết quả xác định là dựa trên sự thay đổi bất thường của tế bào khi có virus nhiễm gây ra Còn ở phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng, kết quả xác định dựa trên sự có hay không có DNA của virus trong mẫu bệnh phẩm, bất kỳ mẫu bệnh phẩm đó đang ở giai đoạn phát triển nào của bệnh

Các phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng này được gọi chung là phương pháp

“xét nghiệm HPV” (HPV testing) ra đời từ những năm đầu thập niên 1990 và không ngừng phát triển

Sự ra đời của các phương pháp chẩn đoán đều nhằm mục tiêu có thể phát hiện sự nhiễm HPV ở giai đoạn sớm Điều này giúp bệnh nhân có một hướng điều trị kịp thời cũng như ngăn chặn sự lây nhiễm HPV Nhiều tác giả đã thực hiện các công trình nghiên cứu đánh giá hiệu quả của các phương pháp chẩn đoán trên

Hình 6 :QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH TÝP HPV

Phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987)

Mồi MY11/09 (Bauer & cs, 1992)

Phản ứng có bổ sung DIG-dUTP

Microtitter plate phủ streptavidin Probe gắn biotin

(Van den Brule & cs, 2002)

“PCR-ELISA DIG detection kit” (Roche)

Mồi đặc hiệu týp và MY09 (Van den Brule & cs, 2002)

Mẫu âm tính

Lai định týp

kiểm chứng

Màng lai biodyne C

Probe gắn amino

(Van den Brule & cs, 2002)

Enzyme ankaline phosphatase

Cơ chất NBT/BCIP

Thu nhận và xử lí

mẫu bệnh phẩm Tách chiết DNA

Thực hiện PCR Mồi MY11/09

(Bauer & cs, 1992)Điện di

Mẫu dương tính

Giải trình tự

kiểm chứng

Thực hiện PCR đánh dấu DIG

Thực hiện ELISA định group

Thực hiện PCR định týp

 Tình hình nghiên cứu trên thế giới :

Một số kỹ thuật phân tử như PCR, lai tại chỗ (in situ hybridization) được phát triển gần đây để phát hiện sự hiện diện của DNA HPV trong tế bào cổ tử cung Các kỹ thuật phân tử này còn cho phép xác định được các týp và phân biệt các thương tổn cổ tử cung không liên quan đến HPV Đặc biệt kỹ thuật PCR, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được phát triển với hai hệ thống primer thông dụng là hệ MY09-MY11 (Bauer & cs, 1992) và hệ GP5+-GP6+ (Snijders & cs, 1990) Các hệ primer này được thiết kế dựa trên trình tự gen L1, cho phép phát hiện sự hiện diện của nhiều týp HPV trong bệnh phẩm

Nhằm xác định chính xác các týp HPV hiện diện trong mẫu khảo sát, nhiều công trình sử dụng phối hợp các bộ mồi consensus và mồi đặc hiệu týp trong phản ứng nested PCR (Harwood & cs, 1999[9]) hoặc phối hợp PCR và kỹ thuật cắt bằng enzyme cắt giới hạn (Nelson & cs, 2000[21]) Hybrid Capture Test (Digen Corporation), đã được thương mại hóa ở Hoa Kỳ, là thử nghiệm dựa trên kỹ thuật lai phân tử giữa mẫu dò (probe) với DNA HPV phát hiện bằng kháng thể với phản ứng hóa quang

Nhiều công trình khác định týp bằng cách sử dụng phối hợp PCR với lai phân tử, trong đó sản phẩm PCR consensus được lai với các probe đặc hiệu cho týp được cố định trên giá thể rắn, kiểu lai có tên là reverse blotting (Ylitalo & cs, 1995; Gravitt &

cs, (2000)) [7] Những công trình sau đó so sánh hiệu quả phát hiện và định týp của các phương pháp đã được công bố cho thấy sự kết hợp PCR với reverse blotting có nhiều

ưu điểm nhất (Vernon & cs, 2000 ; Van Den Brule & cs, 2002)[ 29]

Gần đây đã xuất hiện các công trình không những chỉ phát hiện và định týp mà còn định lượng virus có trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Real-time PCR (Hart &

cs, 2001[8]) Kỹ thuật PCR được sử dụng nhiều nhất với các bộ mồi được chọn vùng

gen bảo tồn cao giữa các týp (E1 và L1) (Karlsen & cs 1996[17]; Gravitt & cs 2000 [8]) Để xác định các týp HPV, Harwood & cs 1999[9] dùng phản ứng nested PCR; Nelson

&cs (2000) [21] phối hợp PCR và kỹ thuật cắt bằng enzym giới hạn

Tháng 4/2002 Hiệp hội Soi cổ tử cung và Bệnh học cổ tử cung của Mỹ (American Society for Colposcopy and Cervical Pathology) đã đưa ra hướng dẫn lâm sàng khuyến cáo thử HPV-DNA cho những phụ nữ có kết quả Pap test không xác định Các tác giả Hàn quốc (Lee và Seo 2002) [13] tầm soát ung thư cổ tử cung theo 3 giai đoạn : tầm soát ban đầu, trong quản lý bệnh nhân có tế bào học bất thường ở mức độ thấp, và trong theo dõi sau điều trị những tổn thương tiền ung thư nêu ra thử nghiệm HPV-DNA có độ nhạy cao hơn tế bào học kinh điển bởi vì nó đánh giá chính tình trạng nhiễm HPV Các tác giả Đức (Petry & cs 2003)[18] đưa xét nghiệm HPV-DNA vào tầm soát thường quy ung thư cổ tử cung ở phụ nữ trên 29 tuổi chứng tỏ HPV-DNA có giá trị trong việc tầm soát hay loại trừ tân sản trong biểu mô cổ tử cung (CIN)

Kết quả HPV và PAP

HPV (-) HPV (+) HPV (-) HPV (+) PAP

PAP (-) PAP (- ) ASC-US ASC-US ≥≥≥≥ LSIL

Lập lại Pap & HPV Soi cổ tử cung

3 năm 6-12 tháng 12 tháng

Hình 7 : Quy trình tầm soát tổn thương tiền ung thư cổ tử cung

 Tình hình nghiên cứu trong nước

Các tác giả Việt Nam như Trịnh Quang Diện & Nguyễn Vượng[42], Nguyễn Ngọc Hiếu & Trần Ngọc Kính[34], Nguyễn Bá Đức & cs[33], Nguyễn thị Như Ngọc &

cs[39] … hầu hết chỉ sử dụng phương pháp tế bào học để phát hiện sớm ung thư cổ tử cung hay chẩn đoán nhiễm HPV qua hình ảnh tế bào học Gần đây có thêm một số nghiên cứu với phương pháp sinh học phân tử: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán một số bệnh thường gặp ở Việt Nam” (Hồ Huỳnh Thùy Dương & cs, 2004)[32], “Xây dựng quy trình phát hiện HPV (Human papillomavirus) phục vụ nghiên cứu và chẩn đoán” (Thái Kế Quân & cs, 2004), “Human papillomavirus infection among women in South and North Vietnam” (Pham Thi Hoang Anh & cs, 2003)[43].Một nghiên cứu phối hợp của Nguyễn Trọng Hiếu & Cs với WHO năm 2002 bằng test HPV-DNA, cho thấy tỉ lệ nhiễm HPV ở một quận nội thành ở thành phố Hồ Chí Minh là 10,9% và 2% ở Hà Nội HPV được tìm thấy nhiều nhất ở phụ nữ dưới 25 tuổi ở TP.Hồ Chí Minh (22,3%)[35,36]

Nghiên cứu của Phạm Việt Thanh [ 41] về tỷ lệ nhiễm HPV ơ”ø 408 trường hợp có tổn thương tế bào HSIL và ung thư cổ tử cung là 93,14% trong đó nhiễm nhóm nguy cơ cao là 95% và nhóm nguy cơ thấp là 5%

Nghiên cứu của Vũ Thị Nhung [ 40 ] về tỷ lệ nhiễm HPV ở 50 trường hợp có tổn thương tế bào từ LSIL đến HSIL và ung thư cổ tử cung là 76% Tỷ lệ nhiễm HPV nhóm nguy cơ cao có cao hơn nhóm nguy cơ thấp (52,64% \ 47,36%)

Công ty Nam Khoa sản xuất bộ kit HPV-DNA được sử dụng ở Trung Tâm Chẩn Đoán Y Khoa Hòa Hảo Nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Dung (2004) cho kết

luận khả năng HPV lây nhiễm từ mẹ sang con trong bệnh u nhú thanh quản lúc sanh ngả âm đạo[31]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

A/ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU :

1 Thiết kế nghiên cứu : mô tả cắt ngang

2 Dân số mục tiêu : phụ nữ trong lưá tuổi 18-69 ở các quận 1, 3, 6,8,11,

Tân Bình, Bình Thạnh, Thủ Đức, Hóc Môn, Bình Chánh thuộc Tp HCM

3 Tiêu chuẩn chọn mẫu : Phụ nữ có chồng hoặc đã có quan hệ tình dục

được khám phụ khoa

4 Tiêu chuẩn oại trừ : đan ra huyết âm đạo, đang đặt thuốc ÂĐ, đang

viêm ÂĐ c áp ínhh

5 Cỡ mẫu : Theo một nghiên cứu trước đây tỉ lệ nhiễm HPV ở quận 10 TP.Hồ Chí Minh là #10,9%.Với tỉ lệ dự đoán p=0,109, độ chính xác d=2,3%, độ tin cậy 0,95 tương ứng với z=1,96 Ta tính được cỡ mẫu N như sau:

Chúng tôi dự kiến số mẫu N cho nghiên cứu là 1500

5 Phương pháp chọn mẫu : chọn mẫu ngẫu nhiên theo cụm

Chọn mẫu theo cụm: toàn thành phố chọn 30 cụm với đơn vị chọn mẫu là phường/xã

Số người trong mỗi cụm là 1500/30 = 50 người

Lập danh sách số phụ nữ ở các quận huyện, phường xã theo số liệu thống kê toàn thành năm 1998, mỗi quận huyện được chia thành các khu vực gồm từ 3-5 phường

Các tên phường ở các quận huyện được số hóa theo thứ tự liệt kê nhân khẩu từng phường quận của “Tư liệu số dân thực tế cư trú tại TP.Hồ Chí Minh năm 1998”

Do số liệu thống kê mỗi quận đều có số nhân khẩu nữ không xác định phường nên chúng tôi không tính vào danh sách số phụ nữ chọn mẫu

Cách chọn cụm như sau:

• Khoảng cách chọn mẫu là 2455139/30 = 81837,97

• Chọn ngẫu nhiên số R từ bảng số ngẫu nhiên (với R<81837,97) Chúng tôi chọn được R=8169

• Tương tự như vậy với K= [0,29] chúng tôi chọn ra được 30 cụm

• Sau đó trong mỗi cụm chúng tôi bốc thăm ngẫu nhiên ra 1 phường

• Lập danh sách các phụ nữ trong độ tuổi nghiên cứu ở phường được chọn, dùng bảng số ngẫu nhiên chọn ra danh sách 50 phụ nữ được mời ra khám phụ khoa

DÂN SỐ NỮ CƯ TRÚ THỰC TẾ TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NĂM 1998

Quận

/Huyện

Dân số nữ

Khu vực

Phường/xã Dân số

nữ KV

Số cộng dồn

Cụm được chọn

II 5,6,7,8 38060 252322 1(P.6) III 9,10,11,12 37426 289748

6 132725 I 1,2,3,4 29448 560820

II 5,6,7,8 41326 602146 1(P.11) III 9,10,11,12 41345 643491

II 5,6,7,8 23945 990884 1*(8P.14) III 9,10,11,12 35405 1026289

Thạnh

201113 I 1,2,3,4,5 45043 1403623 1(P.2)

II 6,7,8,9,10 52383 1456006 III 11,12,13,14,15 53508 1509514 1(P.12)

IV 16,17,18,19,20 50179 1559693 1(P.20) Gò Vấp 122967 I 1,2,3,4 39374 1599067

II 5,6,7,8 46579 1645646 1*(TBP.15) III 9,10,11,12 37014 1682660

Tân Bình 252354 I 1,2,3,4,5 49569 1732229 1(P.9)

II 6,7,8,9,10 60492 1792721 III 11,12,13,14,15 66839 1859560 1(P.14)

IV 16,17,18,19,20 75454 1935014 1(P.10) Thủ Đức 87585 I 1,2,3,4 33258 1968272 1(P.2)

III 9,10,11,12 23159 2022599 Hốc Môn 96723 I 1,2,3,4 36945 2059544 1(X.XTT)

II 6,7,8,9,10 39943 2198035 III 11,12,13,14,15 36688 2234723

IV 16,17,18,19,20 26910 226713 Nhà Bè 31825 I 1,2,3,4 20758 2282471

Chú thích các ký hiệu phường:

Quận/Huyện Ký hiệu phường Tên tắt Tên phường

Thủ Đức 1 LC Linh Chiểu

6 Thời gian thực hiện : Từ tháng 3/2005 – Tháng 6/2006

8 Thu thập bệnh phẩm và kỹ thuật xét nghiệm :

7.1 Mẫu bệnh phẩm : Phết dịch cổ tử cung để tầm soát HPV và làm Pap’s smear hoặc mẫu mô sinh thiết cổ tử cung nếu nghi ngờ có bất thường

7.2 Vật liệu :

7.2.1 Oligonucleotide:

Chúng tôi sử dụng các oligonucleotide (primer, probe) có trình tự đã công bố (Van den Brule & cs, 2002) do công ty Integrated DNA Technologies (IDT – Mỹ) tổng hợp được trình bày trong bảng 1

Bảng 1 : Trình tự các primer và probe sử dụng trong đề tài

MY11 5'-GCM CAG RGW CAT AAY AAT GG-3'

MY09 5'-CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3'

GP5+ 5'-TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC-3'

GP6+ 5'-GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C-3'

HPV6 5'-ATC CGT AAC TAC ATC TTC CAC ATA CAC CAA-3'

HPV11 5'-ATC TGT GTC TAA ATC TGC TAC ATA CAC TAA-3'

HPV42 5'-CTG CAA CAT CTG GTG ATA CAT ATA CAG CTG-3'

HPV43 5'-TCT ACT GAC CCT ACT GTG CCC AGT ACA TAT-3'

HPV61 5'-TAC TGC TAC ATC CCC CCC TGT ATC TGA ATA-3'

HPV70 5'-CTG CCT GCA CCG AAA CGG CCA TAC CTG CTG-3'

HPV71 5’-GTG CTA CCA AAA CTG TTG AGT CTA CAT ATA-3'

HPV81 5,- GCA CAG CTA CAT CTG CTG CTG CAG AAT ACA-3'

HPV16 5'-GTC ATT ATG TGC TGC CAT ATC TAC TTC AGA-3'

HPV18 5'-TGC TTC TAC ACA GTC TCC TGT ACC TGG GCA-3'

HPV31 5'-TGT TTG TGC TGC AAT TGC AAA CAG TGA TAC-3'

HPV33 5'-TTT ATG CAC ACA AGT AAC TAG TGA CAG TAC-3'

HPV35 5'-GTC TGT GTG TTC TGC TGT GTC TTC TAG TGA-3'

HPV39 5'-TCT ACC TCT ATA GAG TCT TCC ATA CCT TCT-3'

HPV45 5'-ACA CAA AAT CCT GTG CCA AGT ACA T-3'

HPV51 5'-AGC ACT GCC ACT GCT GCG GTT TCC CCA ACA-3'

HPV52 5'-TGC TGA GGT TAA AAA GGA AAG CAC ATA TAA-3'

HPV53 5’- GTC TAT GTC TAC ATA TAA TTC AAA GCA AAT-3'

HPV56 5'-GTA CTG CTA CAG AAC AGT TAA GTA AAT ATG-3'

HPV58 5'-ATT ATG CAC TGA AGT AAC TAA GGA AGG TAC-3'

HPV59 5'-TCT ACT ACT KCT TCT ATT CCT AAT GTA TAC-3'

HPV66 5'-TAT TAA TGC AGC TAA AAG CAC ATT AAC TAA-3'

HPV68 5'-TCT ACT ACT ACT GAA TCA GCT GTA CCA AT-3'

HPV82 5’-GCA CTG CTG CTA CTC CAT CAG TTG CAC AGA-3'

bHPV 5'-GAR GAR TWT GAT YTA CAR TTT RTD TTT CAR YTR TG-3' CHR4f 5'-GCT TAA GAG CTG GAT AGA GG-3'

CHR4r 5'-TTT ATG GGA CGG AGA AAC C-3'

(M = A hay C, R = A hay G, W = T hay A, Y = T hay C, K = G hay T)

7.2.2 Các plasmid HPV:

Các plasmid HPV từ những nguồn sau :

• HPV52 – TS Wayne Lancaster (Center for Molecular Medicine and Gentics – Wayne State University School of Medicine - Mỹ)

• HPV31, 35, 43, 44, 56 – TS Attila Loerincz (Digen Corporation - Mỹ)

• HPV58, 59, 61 – TS T Matsukura (National Institute of Health - Nhật Bản)

• HPV33, 34, 39, 42, 66, 68 – TS Gerard Orth (Institut Pasteur - Pháp)

• HPV6, 11, 16, 18 – TS E-M de Villiers (German Cancer Research Center- Đức)

7.2.3 Vật liệu hóa chất dùng cho thu nhận mẫu bệnh phẩm:

Tăm bông vô trùng

Guanidinium thiocyanate (Roche Diagnostics)

See DNA (Amersham Biosciences)

Một số hoá chất thông dụng khác: Phenol, tris HCl, ethanol, triton X-100 (Merck)

7.2.4 Hóa chất tách chiết DNA:

Trizol, phenol, chloroform, isopropanol, ethanol, tris-HCl, EDTA (Merck)

7.2.5 Hóa chất thực hiện phản ứng PCR:

Chúng tôi sử dụng chế phẩm PCR master mix (Biorad), thành phần cho 1 phản ứng PCR với thể tích cuối cùng là 50 µl bao gồm: 2 đơn vị Taq polymerase, 10

mM Tris HCl pH 8.0, 60mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 µM dNTP, chất ổn định (BSA không chứa RNase/DNase)

7.2.6 Hoá chất cho điện di Agarose, ethidium bromide, tris-HCl, EDTA, acetide acid, glycerol, xylen cyanol ff (Merck) Thang DNA 100 cặp base (Promega):

7.2.7 Hóa chất cho phản ứng PCR đánh dấu với digoxigenin:

Các thành phần của phản ứng PCR (Biorad), DIG-dUTP (Roche)

7.2.8 Hóa chất dùng cho phản ứng lai ELISA:

Sử dụng bộ kit “PCR-ELISA DIG detection kit” (Roche) gồm các thành phần như sau: Dung dịch biến tính, dung dịch lai, dung dịch rửa, anti DIG-POD, ABTS

7.2.9 Hóa chất cho lai phân tử:

Màng lai Biodyn C (Pall coporation), NaCl, NaH2PO4, EDTA, NaHCO3, SDS, NaOH, MgCl2, EDAC (Merck), AntiDIG-Alkaline phosphatase, NBT/BCIP (Roche)

7.2.10 Các phần mềm tin học sử dụng trong kiểm tra trình tự nucleotide: Sử dụng các phần mềm ClustalW để so sánh sự tương đồng của hai trình tự nucleotide, Blast để tìm kiếm các trình tự tương đồng đã được công bố trên Genbank và Annhyb 4.9 beta để khảo sát mức độ tương đồng giữa trình tự nucleotide sử dụng với một trình tự DNA bộ gen

7.3 Dụng cụ – Thiết bị

• Máy luân nhiệt (MJ Research, Biorad)

• Tủ -20oC và tủ -4oC (Sanaky)

• Bộ điện di nằm (Hoefer)

• Bàn đèn tử ngoại (Hoefer)

• Máy vortex (Heidolp Reax 2000)

• Ly tâm eppendorf lạnh (Hermle)

• Bồn ủ nhiệt khô (Fisher Scientific)

• Máy lắc (Ika Labortechnik)

• Máy chụp hình kỹ thuật số (Olympus) và bộ lọc tia UV (Kodak)

• Tủ ấm ổn nhiệt (Heraeus)

• Máy rửa và máy đọc microtiter plate (Biorad)

• Các dụng cụ dùng cho lai phân tử

• Một số dụng cụ thông dụng : Pipetman 8 kênh loại 200 µl (Biohit), pipetman 10

µl, 200 µl và 1000 µl (Biohit), tip 10 µl, 200 µl và 1000 µl có phin lọc (Greiner), eppendorf 1,5 ml (Biopure - Eppendorf)

7.4 Phương pháp

7.4.1 Thu nhận và bảo quản bệnh phẩm:

Mẫu sử dụng là dịch phết cổ tử cung Tăm bông sau khi thu nhận mẫu được hòa trong dung dịch TE 1X trong eppendorf, giữ lạnh, chuyển nhanh về phòng thí nghiệm Vortex để các tế bào virus rời khỏi đầu tăm bông và hoà vào dung dịch Bảo quản ở -20oC đến khi tiến hành tách chiết DNA Nếu cần lưu trữ mẫu lâu hơn, nên đông lạnh ở -70oC để đảm bảo chất lượng mẫu

7.4.2 Tách chiết nucleic acid:

7.4.2.1 Nguyên tắc Tiến hành tách chiết DNA bằng phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987) Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dùng các tác nhân biến tính mạnh để phá vỡ màng tế bào và loại bỏ các thành phần không mong muốn (protein, màng tế bào…) DNA sẽ được tủa bởi isopropanol ở điều kiện lạnh và thu lại qua các lần ly tâm Cặn DNA được huyền phù trong TE 1X và bảo quản ở -20oC

7.4.2.2 Một số dung dịch cho tách chiết DNA Trizol pH 8,0: Trizol, phenol, guanidium thiocyanate, Natri citrate

TE 1X: Tris-HCl, EDTA

7.4.2.3 Tiến hành

• Cho 100µl dịch bệnh phẩm vào eppendorf cùng với 900µl dung dịch trizol pH8 và 200µl dung dịch chloroform Vortex để trộn đều hỗn hợp Để yên 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

• Hút 600µl dung dịch lớp trên (tránh hút phải dung dịch lớp dưới) cho vào một eppendorf mới có 600µl dung dịch isopropanol Để yên 60 phút ở -

7.4.3 Phương pháp kiểm tra primer – probe:

7.4.3.1 Phần mềm sử dụng Phần mềm Clustal X phiên bản 1.81

Phần mềm Annhyb phiên bản 4.913 của công ty Olivier Friard

Công cụ Blast (www.ncbi.nih.gov)

7.4.3.2 Phương pháp kiểm tra primer - probe

• Lấy các trình tự gen của HPV từ trang web: www.ncbi.nih.gov

• Dùng ClustalX để tìm các vùng trình tự tương đồng giữa các týp HPV

• Dùng Annhyb để kiểm tra sự bắt cặp của primer – probe với trình tự DNA đích và kiểm tra các chỉ tiêu của primer – probe (cấu trúc kẹp tóc, sự bắt cặp của các primer – probe với nhau…)

7.4.4 Phương pháp PCR:

7.4.4.1 Nguyên tắc Từ mẫu DNA tách chiết ở trên, ta cung cấp các thành phần còn lại cho phản ứng PCR, enzyme Taq polymerase sẽ tổng hợp mạch mới trên trình tự đích Primer sử dụng là cặp primer MY11/MY09 đặc hiệu cho HPV

7.4.4.2 Thành phần phản ứng PCR Một phản ứng PCR V=25µl gồm: 2,5µl Taq buffer, 2,5mM MgCl2, 0,5µl dNTP, 0,1µl Taq DNA polymerase, 0,5µl mỗi primer (MY09/MY11), 8,65µl nước cất

2 lần

7.4.4.3 Tiến hành Đối với mỗi mẫu, thực hiện như sau: 20µl mix PCR pha ở trên + 5µl dịch DNA tách chiết, cho vào eppendprf 0,2ml Đặt chương trình cho máy luân nhiệt hoạt động: 1 chu kỳ: 95oC – 5 phút, 40 chu kỳ: 94oC – 30 giây, 40oC – 30 giây, 72oC – 30 giây, 1 chu kỳ: 72oC – 6 phút

7.4.5 Điện di trên gel agarose:

7.4.5.1 Nguyên tắc Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Sự phát hiện được quan sát bằng mắt thường dưới đèn UV nhờ sự phát màu của ethidium bromide gắn xen trong DNA

7.4.6 Phương pháp PCR đánh dấu DIG:

Trong thành phần phản ứng có bổ sung thêm DIG-dUTP theo tỉ lệ dUTP/dATP = 1/3 Các thành phần khác cũng như chương trình PCR tương tự với phản ứng PCR thông thường đã trình bày ở trên

7.4.7 Phương pháp PCR–ELISA:

7.4.7.1 Nguyên tắc Phương pháp PCR–ELISA dựa trên kỹ thuật lai trong pha lỏng sử dụng probe đặc hiệu để bắt cặp với sản phẩm PCR đánh dấu bằng digoxigenin, sau đó phức hợp lai được phát hiện bằng enzyme phân hủy cơ chất tạo màu

7.4.7.2 Cách pha một số hoá chất Chúng tôi sử dụng bộ kit “PCR-ELISA DIG detection kit” (Roche) với các dung dịch ở dạng “sẵn sàng sử dụng” (Ready to use)

7.4.7.3 Tiến hành Chuẩn bị plate có mẫu dò:

• Pha mẫu dò đánh dấu biotin trong dung dịch lai với nồng độ thích hợp

• Cho 200µl dung dịch lai có mẫu dò biotin ở trên vào các giếng trên plate phủ sẵn streptavidin (Roche)

• Lắc ủ ở 37oC trong 1 giờ Rửa với dung dịch rửa

• Bảo quản trong tối ở 4oC

Thực hiện ELISA:

• Những mẫu dương tính sau khi thực hiện xong PCR-DIG được lấy ra khỏi máy luân nhiệt Cho vào eppendorf 1,5ml có 25µl sản phẩm PCR-DIG 25µl dung dịch biến tính Trộn đều, để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng

• Thêm dung dịch lai cho đủ 900µl, trộn đều Cho 200µl dung dịch này vào các giếng trên plate Mỗi mẫu chia đều 4 giếng, tương ứng với 4 group Lắc ủ plate 1h ở 40oC

• Rửa 3 lần bằng 250µl dung dịch rửa Sau đó, thêm 200µl dung dịch antiDIG-POD vào mỗi giếng Lắc ủ plate 30 phút ở 37oC

• Rửa 3 lần bằng 250µl dung dịch rửa Thêm 200µl dung dịch ATBS vào mỗi giếng Lắc plate 20 -30 phút trong tối ở 37oC