hoàn thiện và phát triển các bộ kit sinh học phân tử chẩn đoán các bệnh do hbv (hepatitis), hcv (hepatitis c virus) và hpv (human papillomavirus)

1 SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (đã chỉnh sửa) DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM HOÀN THIỆN VÀ PHÁT TRIỂN CÁC BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH DO HBV (HEPATITIS B VIRUS), HCV (HEPATITIS C VIRUS), HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS) Chủ nhiệm dự án : PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương Cơ quan chủ trì : Công ty TNHH CNSH KHOA THƯƠNG Năm 2008 2 MỤC LỤC Trang TỔNG QUAN 1 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 8 NỘI DUNG – KẾT QUẢ 11 1. Hòan thiện các quy trình 11 1.1. Kit HBV đònh tính 11 1.2. Kit HCV đònh tính 14 1.3. Kit HPV đònh tính 17 1.4. Kit HBV đònh lượng 19 1.5. Kit HCV đònh lượng 29 1.6. Kit HPV phân nhóm 39 2. Triển khai sản xuất thử nghiệm 44 KẾT LUẬN 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Kit HBV đònh tính 48 Phụ lục 2. Kit HCV đònh tính 51 Phụ lục 3. Kit HPV đònh tính 54 Phụ lục 4. Kit HBV đònh lượng 57 Phụ lục 5. Kit HCV đònh lượng 62 Phụ lục 6. Kit HPV phân group 67 Phụ lục 7. Mô tả sản phẩm – Thành phần các kit và Hướng dẫn sử dụng 82 Phụ lục 8. Quy trình sản xuất và kiểm tra chất lượng 120 Phụ lục 9. Phân tích hiệu quả kinh tế 129 3 TỔNG QUAN Theo Tổ chức Y Tế Thế giới (WHO), bệnh truyền nhiễm nói chung và bệnh nhiễm khuẩn nói riêng đang có khuynh hướng gia tăng và là mối đe dọa chung trên phạm vi toàn cầu. Một số bệnh như viêm màng não, dòch tả, sốt vàng, … sau nhiều năm suy giảm đã gia tăng trở lại tại nhiều quốc gia. Nhiều loại bệnh mới nảy sinh với tốc độ nhanh chưa từng có. Bệnh Suy đường hô hấp cấp (SARS) bùng nổ tại nhiều quốc gia châu Á vừa qua là một ví du.ï Trước tình hình đó, nhu cầu về những biện pháp hiệu quả để phòng ngừa, chẩn đoán và điều trò bệnh nhiễm trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết. 1. MỘT SỐ VẤN ĐỀ VỀ CÁC BỆNH NHIỄM : VIÊM GAN SIÊU VI B VÀ C, NHIỄM HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS 1.1. Viêm gan siêu vi B và C Viêm gan siêu vi là các bệnh nhiễm trùng do nhiều loại siêu vi có ái tính với tế bào gan gây ra, dẫn đến viêm và hoại tử tế bào gan. Các bệnh này tuy có triệu chứng tương tự nhau nhưng lại rất khác nhau về nguyên nhân, dòch tễ, lòch sử tự nhiên và tiên lượng. Trong số các siêu vi gây viêm gan tìm thấy được cho đến nay bao gồm siêu vi viêm gan A, B, C, D và E, siêu vi B (HBV) và C (HCV) có ý nghóa quan trọng do sự phân bố đòa dư rộng, tỷ lệ nhiễm cao ở một số vùng trên thế giới và có nguy cơ cao dẫn đến tình trạng nhiễm mạn tính và ung thư. Các chẩn đoán viêm gan siêu vi hiện nay chủ yếu dựa vào biểu hiện lâm sàng, sinh thiết gan, xét nghiệm sinh hoá và phản ứng huyết thanh. Các biện pháp này trong nhiều trường hợp không cho phép xác đònh chính xác tác nhân gây bệnh và nhất là không cho biết về trạng thái tồn tại của các tác nhân này ở bệnh nhân. Viêm gan siêu vi B Bệnh viêm gan siêu vi do HBV có thời gian ủ bệnh biến động trong khoảng 60-110 ngày. Tỉ lệ nhiễm HBV mãn tính ở Bắc Mỹ thấp hơn 2% số người bò nhiễm. Tỉ lệ này cao hơn nhiều ở châu Á, Phi, các đảo Thái Bình Dương và ở người Eskimo. Đây là một vấn nạn y tế lớn - người ta ước chừng có khoảng 300 triệu người mang mầm bệnh mãn tính trên thế giới, và khoảng 3,5 tỷ người sống trong những vùng bệnh lưu hành ở mức độ trung bình hoặc cao. Trên 122 triệu em bé ra đời mỗi năm ở những vùng này và có nguy cơ rất cao trở thành những người mang mầm bệnh ; khoảng 25%-30% những người mang mầm bệnh bò nhiễm trong thời niên thiếu sẽ chết do các bệnh gan mãn tính hay ung thư gan. Khoảng 1 tỷ đến 1 tỷ rưỡi người nhiễm HBV chết mỗi năm. HBV gây ra đến 80% các trường hợp ung thư gan, là tác nhân gây ung thư chỉ đứng thứ hai sau thuốc lá (WHO, 2000). 4 HBV thuộc họ Hepadnaviridae, có vật liệu di truyền là một mạch đôi DNA không hoàn toàn có kích thước khoảng 3,2 kb được bao bởi nucleocapsid có chứa kháng nguyên lõi HBcAg, bên ngoài là kháng nguyên bề mặt HBsAg. Virus hoàn chỉnh là một tiểu thể hình cầu có đường kính 42-47 nm, được gọi là hạt tử Dane. Do triệu chứng lâm sàng của tình trạng nhiễm HBV không phân biệt được với các dạng viêm gan siêu vi khác nên việc phát hiện bệnh chủ yếu dựa trên các chẩn đoán huyết thanh học. Tình trạng nhiễm HBV cấp tính được đặc trưng bởi sự hiện diện của HBsAg và IgM anti-HBc trong huyết thanh. Các phương pháp huyết thanh học cho phép phát hiện các thành phần vừa nêu bao gồm phương pháp khuếch tán miễn dòch, thử nghiệm kết dính hồng cầu và những thử nghiệm có độ nhạy cao hơn như miễn dòch enzyme (EIA) và miễn dòch phóng xạ (RIA) có thể phát hiện đến 0,1 ng/ml HBsAg. Gần đây người ta phát triển các chẩn đoán phân tử có độ nhạy cao hơn như lai phân tử (slot hoặc dot blot) có thể phát hiện DNA HBV đến hàm lượng 5pg/ml (tương ứng 1,5 x 10 6 bản sao/ml). Một thử nghiệm lai trong pha lỏng đã thương mại hoá (Abbott) phát hiện được 1,5 pg/ml DNA HBV còn thử nghiệm bDNA (Chiron) phát hiện 2,5 pg/ml DNA HBV. PCR có độ nhạy còn cao hơn nhiều, có thể phát hiện được 10 -3 pg/ml (tương ứng khoảng 100-1000 bộ gene) [1] Viêm gan siêu vi C Siêu vi viêm gan C (HCV), được xếp vào họ Flaviviridae, có vật liệu di truyền là một RNA mạch đơn (+), kích thước khoảng 9,5 kb. Virus này không thể nuôi cấy được và được xem là nguyên nhân của phần lớn các trường hợp viêm gan "không A không B". Mặc dù HCV không gắn chèn vào bộ gene ký chủ nhưng lại có khả năng tồn tại đặc biệt dai dẳng ở người bò nhiễm. Sự nhiễm HCV dẫn đến tình trạng bệnh mãn tính trong 50-70% trường hợp. Nhiễm cấp tính HCV thường ít có hoặc có triệu chứng nhẹ, khó nhận biết. Chỉ khoảng 10% người nhiễm thải loại hoàn toàn virus, số còn lại chuyển sang tình trạng mãn tính. Trong số sau này, ít nhất 60% phát triển viêm gan mạn. Khoảng 20% bệnh nhân viêm gan mạn sẽ bò xơ gan và một số chết do mất chức năng gan hoặc do ung thư gan. Riêng ở thành phố Hồ Chí Minh, ung thư gan nguyên phát chiếm vò trí thứ ba trong các dạng ung thư và vò trí thứ nhất ở bệnh nhân nam. Một công trình nghiên cứu dòch tễ học sự nhiễm HCV cho thấy tỉ lệ lưu hành HCV ở người bình thường là 1,8%, và cao hơn nhiều ở các nhóm người có nguy cơ, từ 50% ở người nhận truyền máu cho đến 96,2% ở người nghiện [2]. Việc phát hiện HCV trong máu người bò nhiễm vừa có ý nghóa cho chẩn đoán và theo dõi điều trò, vừa có tầm quan trọng đặc biệt trong việc sàng lọc để đảm bảo an toàn truyền máu và các sản phẩm từ máu. Biện pháp chẩn đoán HCV đầu tiên là ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) sử dụng kháng nguyên c100 tạo dòng từ bộ gene HCV (Chiron/Ortho Diagnostic Systems). Một loạt các chẩn đoán sử dụng thêm nhiều kháng nguyên tái tổ hợp khác của HCV ra đời sau đó, với độ nhạy và độ đặc hiệu ngày càng cao như ELISA thế hệ thứ hai, RIBA (Recombinant Immunoblot 5 Assay) thế hệ thứ nhất, thứ hai, thứ ba. Tuy nhiên các phương pháp xét nghiệm miễn dòch này có một số nhược điểm như không phát hiện được sự nhiễm ở giai đoạn sớm hoặc không cho kết quả ở người mà hệ thống miễn dòch không hoạt động (immunosuppressed). Các bộ kit dựa trên kỹ thuật PCR được phát triển cho phép phát hiện trực tiếp HCV ngay trong thời kỳ viremia với độ nhạy cao, đến khoảng 2.000 bản sao/ml huyết thanh. Thế mạnh của kỹ thuật này được kể là : chẩn đoán sớm và chính xác ở người có nguy cơ cao, phát hiện HCV ở người mang không triệu chứng, ở người có hàm lượng ALT cao, ở người có hệ thống miễn dòch không hoạt động, khẳng đònh kết quả ELISA dương tính và theo dõi điều trò. Amplicor HCV (Roche Diagnostic Systems) là một bộ kit dựa trên kỹ thuật PCR đã được thương mại hóa. Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu sử dụng các biện pháp vừa kể. Kỹ thuật bDNA đònh lượng HBV cũng đã được áp dụng tại Trung Tâm Chẩn Đoán Y Khoa Hòa Hảo Tp HCM. 1.2. Human papillomavirus (HPV) Ung thư cổ tử cung là một trong những bệnh thuộc hàng đầu và là nguyên nhân lớn thứ hai gây nên cái chết cho phụ nữ trên toàn thế giới. Hàng năm có 440.000 ca bệnh mới chiếm tỉ lệ 5,8% trong các bệnh ung thư [3]. Ở Việt Nam, ung thư cổ tử cung cũng là bệnh hàng đầu ở phụ nữ miền Nam và thứ tư ở phụ nữ miền Bắc. Theo thống kê về ghi nhận ung thư quần thể ở thành phố Hồ Chí Minh (1998) thì thành phố có thêm 28,6 người trên 100.000 phụ nữ mắc bệnh này mỗi năm. Khoảng từ 90-99,7% trường hợp bệnh ung thư cổ tử cung được phát hiện có dấu hiệu của sự nhiễm một hay nhiều loại HPV (human papillomavirus) gây ung thư. Human Papillomavirus (HPV) là một trong những virus lây truyền qua đường tình dục phổ biến, gây ra nhiều loại bệnh khác nhau ở người như mụn cóc, u nang biểu mô… và liên quan đến nhiều loại ung thư trong đó đáng chú ý nhất là ung thư cổ tử cung ở phụ nữ. Đây là virus nhỏ có đường kính khoảng 55nm với bộ gene DNA vòng mạch kép gồm từ 7.200-8.000 cặp base với khoảng 10 khung đọc mở. Hiện nay hơn 77 kiểu gene (genotype) khác nhau của virus này đã được xác đònh ở người đã được giải trình tự. Người ta chia HPV sinh dục - nhóm các HPV xâm nhiễm chủ yếu bề mặt niêm mạc, thường thấy ở đường sinh dục - thành hai loại dựa trên khả năng gây ung thư. Đó là nhóm "nguy cơ thấp" (low risk), ít có khả năng gây ung thư và nhóm "nguy cơ cao" (high risk), có khả năng gây ung thư cao. Gene HPVE6 và HPVE7 của virus có khả năng gắn xen vào bộ gene, phiên mã tạo ra oncoprotein E6 và E7. Các protein E6 và E7 của các HPV "nguy cơ cao" có khả năng gắn kết cao với các protein p53 (có chức năng tiêu diệt tế bào tổn thương trong giai đoạn G1 của quá trình phân bào) và pRB (có chức năng điều hoà quá trình phân bào). Phức hợp E6/p53 làm mất hoạt tính của p53 khiến cho tế bào không bò tiêu diệt khi bò tổn thương và dẫn đến tình trạng không ổn đònh di truyền của tế bào. Sự gắn kết của E7 và pRB giải phóng tác nhân phiên 6 mã là E2F làm tăng sự phiên mã, hoạt hoá quá trình phân bào. Gene E6 và E7 được tìm thấy trong các tế bào ung thư HPV dương tính [3]. Phương pháp chẩn đoán tế bào học do Papanicolaou phát minh năm 1949, thường được gọi là PAP test (Pap smear), đã làm giảm đáng kể số tử vong do ung thư cổ tử cung và đã trở nên biện pháp phát hiện sớm ung thư cổ tử cung rất thông dụng. Tuy nhiên, biện pháp này không chính xác, dễ cho kết quả âm tính và dương tính giả, và cần được kết hợp với một số kiểm tra khác. Một số kỹ thuật phân tử như PCR, lai tại chỗ (in situ hybridization) được phát triển gần đây để phát hiện sự hiện diện của DNA HPV trong tế bào cổ tử cung. Các kỹ thuật phân tử này còn cho phép xác đònh được các type và phân biệt các thương tổn cổ tử cung không liên quan đến HPV. Phương pháp lai trong pha lỏng đã được phát triển thành các bộ kit (Hybrid Capture Tube (HCT), Hybrid Capture II) (Digene Corporation) và được phép sử dụng trong chẩn đoán giúp xác đònh nhóm HPV "nguy cơ cao" và "nguy cơ thấp". Đặc biệt kỹ thuật PCR, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được phát triển với hai hệ thống primer thông dụng là hệ MY09- MY11 [4] và hệ GP5+-GP6+ [5]. Các hệ primer này được thiết kế dựa trên trình tự gene L1, cho phép phát hiện sự hiện diện của nhiều type HPV trong bệnh phẩm. 1. MỘT SỐ VẤN ĐỀ VỀ CHẨN ĐOÁN BỆNH NHIỄM Cho đến nay, các phương pháp chẩn đoán bệnh nhiễm chủ yếu dựa trên biểu hiện lâm sàng, kết quả soi, cấy vi trùng và các xét nghiệm sinh hoá, miễn dòch cổ điển. Tuy vẫn được sử dụng phổ biến, các biện pháp nêu trên đều có những nhược điểm riêng. Chẩn đoán dựa trên biểu hiện lâm sàng chỉ tiến hành được khi đã xuất hiện triệu chứng, không đặc hiệu cho bệnh, khó cho phép phân biệt một số bệnh nhiễm trùng ở giai đoạn sớm. Kỹ thuật nuôi cấy và đònh danh có độ nhạy thấp, đòi hỏi một lượng vi sinh vật cao trong bệnh phẩm ; khó tiến hành ở một số vi sinh vật nuôi cấy không được hay phát triển rất chậm và khó khăn do đặc tính tự nhiên ; và đặc biệt không có hiệu quả khi bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước đó. Các phương pháp sinh hóa và miễn dòch là những phương pháp phát hiện gián tiếp thông qua đáp ứng của bệnh nhân nên thường khó cho kết quả chính xác ở giai đoạn sớm của bệnh. Các phương pháp này không có độ đặc hiệu cao (trừ phi sử dụng kháng thể đơn dòng trong xét nghiệm miễn dòch, vốn đắt tiền và khó sản xuất). Tóm lại, các biện pháp vừa kể, dù sử dụng riêng lẻ hay kết hợp, thường ít cho kết quả như ý do độ đặc hiệu và độ nhạy không cao, hoặc do thời gian chờ đợi kết quả rất dài ; do đó có ý nghóa hạn chế cho phục vụ điều trò. Các phương pháp sinh học phân tử ngày càng được phát triển để sử dụng như những công cụ chẩn đoán, điều trò, nghiên cứu dòch tễ học và kiểm tra dòch bệnh trong lónh vực bệnh nhiễm. Các ưu điểm chính của chẩn đoán phân tử là : 7 (1) độ đặc hiệu gần như tuyệt đối vì phát hiện trực tiếp vật liệu di truyền của vi sinh vật gây bệnh, (2) độ nhạy rất cao, nhất là đối với kỹ thuật PCR, cho phép phát hiện một lượng vi sinh vật rất nhỏ, (3) thời gian cho kết quả nhanh, (4) có thể được tự động hóa và "kit" hoá. Tuy nhiên, chẩn đoán phân tử cũng bao hàm một số nhược điểm : giá xét nghiệm cao, thiết bò đắt tiền, quy trình chẩn đoán không phải lúc nào cũng được chuẩn hóa, kỹ thuật viên phải được đào tạo kỹ. Mặc dù vậy, trên thế giới ngày càng phát triển xu hướng sử dụng một cách chọn lọc và có kiểm soát các kỹ thuật sinh học phân tử để bổ sung, hỗ trợ cho các chẩn đoán cổ điển. Các bộ kit thương mại hóa dùng để phát hiện các tác nhân gây bệnh được ưa chuộng vì chúng dễ sử dụng, tránh được ngọai nhiễm do khâu chuẩn bò, sử dụng các hóa chất, sinh phẩm và điều kiện kiểm tra đã được chuẩn hóa. Tuy vậy, nhiều tác giả khuyến cáo nên phát triển những phương pháp "tự chế" để đáp ứng với các nhu cầu thực tế nảy sinh và để phù hợp với túi tiền của người bệnh ở các nước đang phát triển. Các chẩn đoán phân tử chủ yếu dựa trên kỹ thuật lai phân tử và PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp dây chuyền). Các test kits sử dụng mẫu dò (lai phân tử) để phát hiện tác nhân gây bệnh được thương mại hóa sớm và hiện vẫn đang được sử dụng rộng rãi, điển hình như hệ thống PACE2 (Gen-Probe) nhằm phát hiện đồng thời Neisseria gonorrhoeae và Chlamydia trachomatis hay hệ thống Hybrid capture (Digene, Murex) để phát hiện HPV (Human Papillomavirus), HSV (Herpes Simplex Virus), CMV (Cytomegalovirus). Các phương pháp vừa kể rất nhanh và đơn giản nhưng có độ nhạy kém, chỉ thật sự có hiệu quả khi số lượng bản sao bộ gene của tác nhân gây bệnh trong bệnh phẩm đạt 10 4 bản sao/ml. Các phương pháp sử dụng mẫu dò có kết hợp khuếch đại tín hiệu như bDNA (branched DNA probe) (Chiron) hay QB replicase (Gene-Trak) được phát triển để cải tiến độ nhạy của phản ứng đến khoảng 500 bản sao bộ gene/ml. Tuy nhiên, các kỹ thuật nhân bản trình tự đích, thông dụng nhất là kỹ thuật PCR, ngày càng chiếm ưu thế do độ nhạy không gì sánh được. Bên cạnh ngày càng nhiều bộ kit PCR được các hãng lớn thương mại hóa là vô số các bộ kit và phương pháp được phát triển ngay tại các phòng thí nghiệm lâm sàng để phục vụ nhu cầu tại chỗ. Trong các bộ kit này, kỹ thuật PCR kết hợp với điện di, lai phân tử, sử dụng enzyme cắt giới hạn, … cho phép phát hiện các tác nhân gây bệnh với hàm lượng rất thấp, thời gian xét nghiệm nhanh và hoàn toàn đặc hiệu. Một vài bộ kit PCR điển hình đã được FDA (Food and Drug Administration) công nhận để đưa vào sử dụng như : các bộ kit phát hiện Chamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, đònh lượng HIV (Roche Diagnostic System). Ý nghóa kinh tế xã hội của việc sử dụng các phương pháp chẩn đoán phân tử cũng được thảo luận nhiều. Bên cạnh việc cải thiện khả năng chẩn đoán, điều trò và phòng ngừa cho người bệnh, lợi ích kinh tế của điều này thể hiện ở việc 8 giảm thiểu các xét nghiệm ít đặc hiệu và ít nhạy hơn, giảm thiểu các quy trình chẩn đoán và điều trò không cần thiết cũng như giúp loại bỏ tình trạng nhiễm trùng bệnh viện. Bên cạnh đó, các chương trình y tế nhằm sàng lọc và kiểm soát tác nhân gây bệnh như HPV, Chlamydia, các tác nhân gây bệnh hiện diện trong máu, … ở mức độ phân tử đối với cá nhân hoặc tập thể những người có nguy cơ cao cũng cũng có ý nghóa kinh tế xã hội quan trọng. Chi phí bỏ ra để đổi lấy lợi ích của chẩn đoán và điều trò sớm ở cá nhân, kiểm soát sự lây lan trong quần thể và các vấn đề khác của y tế cộng đồng là có thể chấp nhận được. Ở nước ngoài, chủ yếu dựa trên các kỹ thuật lai phân tử và PCR, nhiều bộ thử nghiệm (kit) chẩn đoán phân tử đã được thương mại hóa và sử dụng cho chẩn đoán thường quy. Các bộ kit này hầu như được cung cấp cho kỹ thuật viên xét nghiệm dưới dạng “sẵn sàng cho sử dụng” giúp giảm thiểu các khâu chuẩn bò có thể dẫn đến ngoại nhiễm; ngoài ra, các hóa chất, sinh phẩm và quy trình đã được kiểm tra và chuẩn hóa đảm bảo tính ổn đònh và độ tin cậy của xét nghiệm. Ở nước ta và ở Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng, đã có một số nghiên cứu phát triển và thương mại hóa các bộ kit dùng trong chẩn đoán phân tử một số bệnh truyền nhiễm do các siêu vi gây viêm gan (HBV, HCV), Mycobacterium tuberculosis, … , như Công ty Nam Khoa. Số lượng và chất lượng các bộ kit phát triển trong nước cho đến nay chưa đáp ứng hết nhu cầu thực tế. Hiện nay một số bệnh viện và trung tâm y tế lớn cũng đã bắt đầu thử nghiệm các bộ kit này cũng như một số bộ kit nhập như Trung tâm Chẩn đoán Y khoa Hoà Hảo, các phòng xét nghiệm của Bệnh viện Đại học Y Dược, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Hoàn Mỹ, … Vấn đề đặt ra hiện nay đối với các bộ kit nhập là chi phí cho một xét nghiệm rất lớn, ví dụ như một xét nghiệm phát hiện HCV sử dụng hệ thống Amplicor (Roche) có giá là 1,5 triệu đồng cho một mẫu thử. Còn đối với các kit phát triển trong nước vấn đề lớn là mức độ chuẩn hóa thấp, dẫn đến sự không thống nhất lớn giữa các cơ sở xét nghiệm, kết quả không có độ tin cậy cao. Vấn đề về nhân viên kỹ thuật được đào tạo bài bản cũng phải được giải quyết để đảm bảo độ chính xác của phản ứng. Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử – bộ môn Di Truyền – trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQG Tp HCM đã tiến hành nghiên cứu và nghiệm thu các đề tài có liên quan đến dự án bao gồm : 1. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán một số bệnh nhiệt đới (Sốt xuất huyết Dengue, Viêm gan siêu vi B và C, Viêm não Nhật bản, nhiễm HPV (Human Papillomavirus) – đề tài NCKH trọng điểm ĐHQG Tp HCM, nghiệm thu 2004. 2. Xây dựng quy trình phát hiện HPV (Human papillomavirus) phục vụ nghiên cứu và chẩn đoán – đề tài Vườn ươm sáng tạo KHKT trẻ – Sở KH & CN Tp HCM, nghiệm thu 2004. 3. Xây dựng quy trình đònh lượng virus viêm gan B trong máu bệnh nhân bằng kỹ thuật real-time PCR – đề tài NCKH trọng điểm ĐHQG, nghiệm thu 2005 9 4. Xây dựng quy trình đònh lượng virus viêm gan C bằng kỹ thuật real-time RT- PCR phục vụ cho việc nghiên cứu và điều trò bệnh viêm gan siêu vi C – đề tài Sở KH & CN Tp HCM, nghiệm thu 2005. Từ các kết quả nghiệm thu trên, chúng tôi tiếp tục hoàn thiện các kit HBV và HCV đònh tính, HBV và HCV đònh lượng và đưa thử nghiệm tại các cơ sở y tế có quan hệ hợp tác và nhu cầu sử dụng thông qua việc chuyển giao công nghệ cho Công ty TNHH CNSH Khoa Thương. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Tiến hành triển khai các quy trình và các bộ kit dùng cho chẩn đoán phân tử đối với các tác nhân virus bao gồm HCV, HBV, HPV từ các kết quả nghiên cứu cơ bản đạt được và từ các thành tựu đã công bố trên thế giới 10 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 1. HOÀN THIỆN CÁC QUY TRÌNH D Bệnh phẩm Các mẫu huyết thanh nghi nhiễm HCV, HBV do Bệnh viện ĐH Y Dược, DIAG Center và Trung tâm Chẩn Đoán Y Khoa Hòa Hảo (Medic) cung cấp trong thời gian từ tháng 9/2005 đến tháng 4/2006. Các mẫu dòch phết cổ tử cung do Bệnh viện Hùng Vương Tp HCM cung cấp trong thời gian từ tháng 9/2005 đến tháng 4/2006. D Các đơn vò tham gia : - Phòng Xét nghiệm – Bệnh viện ĐH Y Dược Tp HCM (BV ĐH Y Dược) - Phòng PCR – DIAG Center (DIAG Center) - Phòng PCR – BV Hùng Vương Tp HCM (BV Hùng Vương) - Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử – trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên (ĐH KHTN). 1.1. Độ đúng (Accuracy) Đơn vò chòu trách nhiệm là ĐH KHTN. Thiết bò sử dụng : - PCR đònh tính : Techne TC-312 - PCR đònh lượng : iCycler 584BR Độ đúng được đònh nghóa là độ trùng hợp giữa giá trò trung bình của thử nghiệm với giá trò được công nhận là chuẩn. [6] Độ đúng của các quy trình được xác đònh với hai cách tiếp cận : W So sánh kết quả thu được từ các quy trình thử nghiệm với kết quả đã biết trên 10 bệnh phẩm. Cụ thể, kết quả của quy trình phát hiện và đònh lượng HBV cũng như quy trình phát hiện và đònh lượng HCV được so sánh với kết quả bDNA và với hàm lượng DNA HBV và HCV đã biết ; kết quả quy trình phát hiện và phân nhóm HPV thì được so sánh với kết quả giải trình tự. Thao tác viên nhận 10 bệnh phẩm từ trưởng nhóm không kèm thông tin gì về bệnh phẩm. Đối với mỗi bệnh phẩm, thao tác viên tiến hành tách chiết DNA/RNA và đặt 03 phản ứng PCR/RT-PCR độc lập, sử dụng cùng bộ dụng cụ, cùng lô hóa chất và cùng máy PCR. W Sử dụng các huyết thanh có hàm lượng HBV (5.10 5 IU/ml) và HCV (5.10 4 IU/ml) đã biết do WHO cung cấp để kiểm tra độ chính xác của hai quy trình đònh lượng HBV và HCV. Các huyết thanh WHO được sử dụng để kiểm tra độ chính xác của đường cong chuẩn do chúng tôi xây dựng. Các huyết thanh WHO được pha loãng bậc 10 thành ba nồng độ dùng để xây dựng đường cong chuẩn WHO. Đường chuẩn WHO và đường chuẩn từ amplicon do chúng tôi xây dựng được sử dụng để đònh lượng DNA HBV và RNA HCV của 5 bệnh phẩm. Các kết quả từ hai phản ứng đònh lượng được so sánh để rút ra kết luận. [...]... nghiên c u, chúng tôi tổ ch c huấn luyện kỹ thuật thao t c cho c c kỹ thuật viên về tất c c c c ng đoạn c a quy trình trong thời gian 1-2 tuần 2.2 Tổ ch c sản xuất và cung c p kit cho c c c sở y tế tham gia nghiên c u 2.2.1 Đặt hàng 2.2.2 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu 2.2.3 Pha chế c c hỗn hợp tách chiết DNA/RNA, PCR, RT/PCR đònh tính, PCR/RT-PCR đònh lượng 2.2.4 Kiểm tra chất lượng c c kit 2.2.5... lâm sàng X c đònh tỉ lệ người m c bệnh và không m c bệnh th c tế dựa trên tổ hợp nhiều phương pháp và so sánh với kết quả thu đư c với c c kit thử nghiệm Kết quả phát hiện HBV, HCV đư c so sánh với tổ hợp kết quả sinh hóa và miễn dòch; kết quả phát hiện HPV đư c so sánh với kết quả Pap test 2 TRIỂN KHAI SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM 2.1 Chuyển giao kỹ thuật Trư c khi c c kit đư c đưa thử nghiệm tại c c c sở y... 1.260.000 C c bệnh phẩm dương tính với HCV c chứa c c hàm lượng virus đi từ 4.030 đến 6.090.000 bản sao/ml Kết quả trên cho thấy quy trình phát hiện HCV đạt độ chính x c 100% trên c c mẫu c hàm lượng HCV nằm trong ngưỡng trên 1.2.2 Độ lặp lại Kết quả phát hiện HCV với kit HCV đònh tính từ 02 c sở y tế là BV ĐH Y Dư c và DIAG Center đư c trình bày trong bảng 6 Bảng 6 : Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh. .. 0.012223778 C c giá trò độ đúng đối với c hai người thao t c đều cho thấy c sự phù hợp cao giữa hàm lượng HCV x c đònh bằng kit HCV đònh lượng với hàm lượng amplicon HCV hiện diện trong mẫu đối với c hai người thao t c Bên c nh đó, kết quả so sánh vi c sử dụng đường cong chuẩn từ amplicon do chúng tôi xây dựng với đường cong chuẩn xây dựng từ mẫu chuẩn WHO để đònh lượng RNA HCV c trong 5 bệnh phẩm đư c trình... mỗi c sở y tế tham gia nghiên c u, một kỹ thuật viên tiến hành tách chiết DNA/RNA và đặt phản ứng PCR/RT-PCR theo quy trình do ĐH KHTN cung c p 1.3 X c đònh ngưỡng phát hiện đối với hai quy trình đònh lượng HBV và HCV : Đơn vò chòu trách nhiệm : ĐH KHTN Thiết bò sử dụng : iCycler 584BR C c amplicon HBV và HCV dùng để xây dựng đường chuẩn đònh lượng với nồng độ 1014 bản sao/ml đư c pha loãng b c 10... (variability coefficient) gồm biến thiên liên phản ứng và biến thiên nội phản ứng Hệ số biến thiên c ng thấp thì tính lặp lại c ng cao Biến thiên liên phản ứng là độ biến thiên đư c đo đ c thông qua vi c lặp lại phản ứng vào c c thời điểm kh c nhau và ghi nhận sự sai kh c giữa c c thời điểm Biến thiên nội phản ứng là độ biến thiên đư c khảo sát bằng c ch đo đ c sự sai kh c của c c phản ứng diễn ra vào c ng... : C c đơn vò tham gia nghiên c u bao gồm : Quy trình Đơn vò tham gia Phát hiện HBV Đònh lượng HBV 1) BV ĐH Y Dư c Phát hiện HCV 2) DIAG Center Đònh lượng HCV Phát hiện HPV 1) BV ĐH Y Dư c Đònh nhóm HPV 2) BV Hùng Vương Thiết bò sử dụng : - BV ĐH Y Dư c : iCycler 584BR - DIAG Center : iCycler 582BR iQ5 - BV Hùng Vương : Master Cycler 22331(Eppendorf) Độ lặp lại c a quy trình đư c đònh nghóa là m c độ... 0.012223778 C c giá trò độ đúng đối với c hai người thao t c đều < 2%, cho thấy c sự phù hợp cao giữa hàm lượng HBV x c đònh bằng kit HBV đònh lượng với hàm lượng DNA amplicon HBV hiện diện trong mẫu đối với c hai người thao t c Bên c nh đó, kết quả so sánh vi c sử dụng đường cong chuẩn từ amplicon do chúng tôi xây dựng với đường cong chuẩn xây dựng từ mẫu chuẩn WHO để đònh lượng DNA HBV c trong 5 bệnh. .. hiện c a kit Versant HCV RNA Nhìn chung, kết quả phát hiện HCV bằng kit HCV đònh tính phù hợp với kết quả đònh lượng HCV bằng kỹ thuật bDNA 17 1.2.4 Tính ổn đònh c a kit HCV đònh tính theo thời gian bảo quản Tính ổn đònh c a kit HCV đònh tính đư c đánh giá tương tự như đối với kit HBV đònh tính : đ c kết quả dương/âm tính và so sánh c ờng độ tín hiệu quan sát bằng mắt thường giữa c c phản ứng sử dụng... quyết c c vấn đề “hậu mãi” 12 NỘI DUNG - KẾT QUẢ 1 HOÀN THIỆN C C QUY TRÌNH 1.1 Quy trình phát hiện HBV 1.1.1 Độ đúng Kết quả phát hiện HBV với kit HBV đònh tính trên 10 bệnh phẩm lặp lại ba lần c a hai người thao t c đư c trình bày trong bảng 1 Kết quả đầy đủ đư c trình bày trong phụ l c 1 Kết quả đư c tính là dương hay âm tính khi c 03 lần lặp lại cho c ng kết quả C c kết quả dương/âm tính đư c đánh . hành triển khai c c quy trình và c c bộ kit dùng cho chẩn đoán phân tử đối với c c t c nhân virus bao gồm HCV, HBV, HPV từ c c kết quả nghiên c u c bản đạt đư c và từ c c thành tựu đã c ng. KHOA H C VÀ C NG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH BÁO C O TỔNG KẾT (đã chỉnh sửa) DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM HOÀN THIỆN VÀ PHÁT TRIỂN C C BỘ KIT SINH H C PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN C C BỆNH DO HBV. ngoài, chủ yếu dựa trên c c kỹ thuật lai phân tử và PCR, nhiều bộ thử nghiệm (kit) chẩn đoán phân tử đã đư c thương mại hóa và sử dụng cho chẩn đoán thường quy. C c bộ kit này hầu như đư c cung c p