C: Mẫu chứng âm.
2. Hĩa chất tách chiết RNA, gel agarose, dung dịch nạp mẫu bảo quản ở 4oC 3 Dung dịch TAE 5X giữ ở nhiệt độ phịng
3. Dung dịch TAE 5X giữ ở nhiệt độ phịng
Bảo quản trong các điều kiện nêu trên, kit HCV định tính cĩ thể sử dụng trong vịng 6 tháng.
QUY TRÌNH THỰC HIỆN
Thu mẫu – xử lý – bảo quản mẫu
1. Lấy 3ml máu từ bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng. 2. Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vịng/phút trong 15 phút. 2. Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vịng/phút trong 15 phút.
3. Thu khoảng 0,5 ml huyết thanh chuyển vào một eppendorf 1,5 ml sạch.
4. Giữ eppendorf huyết thanh trong ngăn đá tủ lạnh cho đến khi tiến hành xét nghiệm. nghiệm.
Tách chiết RNA
1. Chuẩn bị các eppendorf 1,5 ml đánh số tương ứng với số mẫu. Bật bồn ủ nhiệt khơ ở 600C. khơ ở 600C.
2. Cho vào mỗi eppendorf 900 µl dung dịch 1. 3. Cho 100 µl huyết thanh vào mỗi ống.* 3. Cho 100 µl huyết thanh vào mỗi ống.*
Vortex mạnh eppendorf trên máy vortex ít nhất 5 giây cho tan hồn tồn protein biến tính.
Để yên 10 phút.
4. Cho 200 µl dung dịch 2. Lắc trộn thật kỹ. Lắc trộn thật kỹ.
5. Ly tâm 13.000 vịng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phịng.
6. Chuẩn bị các eppendorf 1,5 ml mới, đánh số tương ứng với số mẫu. 7. Chuyển 600 µl dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới.** 7. Chuyển 600 µl dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới.**
8. Thêm 600 µl dung dịch 3 (dung dịch 3 cần được trộn đều trước khi sử dụng). 9. Vortex nhẹ để trộn đều. 9. Vortex nhẹ để trộn đều.
Để yên 10 phút.
10. Ly tâm 13.000 vịng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phịng. 11. Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn.*** 11. Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn.***
12. Thêm 900 µl dung dịch 4.
13. Ly tâm 13.000 vịng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phịng. 14. Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn. 14. Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn.
15. Làm khơ cặn trong 10 phút ở 60°C trong bồn ủ nhiệt khơ. 16. Hịa cặn trong 50 µl dung dịch 5. 16. Hịa cặn trong 50 µl dung dịch 5.
Nếu khơng tiến hành phản ứng PCR ngay trong ngày, bảo quản RNA tách chiết ở - 20°C trong vịng 6 tháng.
Lưu ý :
¿ Huyết thanh phải được bảo quản ở -20oC từ khi thu đến khi thực hiện phản ứng.
¿¿ Chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch hơi đục (protein biến tính) ở giữa
hai pha nước và chloroform
¿¿¿ Tránh chạm đến phần cặn cĩ màu xanh
Phiên mã ngược (RT)