hoàn thiện và phát triển các bộ kit sinh học phân tử chẩn đoán các bệnh do hbv (hepatitis b virus), hcv (hepatitis c virus), hpv (human papillomavirus)

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (đã chỉnh sửa) DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM HOÀN THIỆN VÀ PHÁT TRIỂN CÁC BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH DO HBV (HEPATITIS B VIRUS), HCV (HEPATITIS C VIRUS), HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS) Chủ nhiệm dự án : PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương Cơ quan chủ trì : Công ty TNHH CNSH KHOA THƯƠNG Năm 2008 MỤC LỤC TỔNG QUAN Trang PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH NỘI DUNG – KẾT QUẢ Hòan thiện quy trình 1.1 Kit HBV đònh tính 1.2 Kit HCV đònh tính 1.3 Kit HPV đònh tính 1.4 Kit HBV đònh lượng 1.5 Kit HCV đònh lượng 1.6 Kit HPV phân nhóm Triển khai sản xuất thử nghiệm 11 11 11 14 17 19 29 39 44 KẾT LUẬN 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC Phụ lục Kit HBV đònh tính Phụ lục Kit HCV đònh tính Phụ lục Kit HPV đònh tính Phụ lục Kit HBV đònh lượng Phụ lục Kit HCV đònh lượng Phụ lục Kit HPV phân group Phụ lục Mô tả sản phẩm – Thành phần kit Hướng dẫn sử dụng Phụ lục Quy trình sản xuất kiểm tra chất lượng Phụ lục Phân tích hiệu kinh tế 48 51 54 57 62 67 82 120 129 TỔNG QUAN Theo Tổ chức Y Tế Thế giới (WHO), bệnh truyền nhiễm nói chung bệnh nhiễm khuẩn nói riêng có khuynh hướng gia tăng mối đe dọa chung phạm vi toàn cầu Một số bệnh viêm màng não, dòch tả, sốt vàng, … sau nhiều năm suy giảm gia tăng trở lại nhiều quốc gia Nhiều loại bệnh nảy sinh với tốc độ nhanh chưa có Bệnh Suy đường hô hấp cấp (SARS) bùng nổ nhiều quốc gia châu Á vừa qua ví du.ï Trước tình hình đó, nhu cầu biện pháp hiệu để phòng ngừa, chẩn đoán điều trò bệnh nhiễm trở nên cấp thiết hết MỘT SỐ VẤN ĐỀ VỀ CÁC BỆNH NHIỄM : VIÊM GAN SIÊU VI B VÀ C, NHIỄM HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS 1.1 Viêm gan siêu vi B C Viêm gan siêu vi bệnh nhiễm trùng nhiều loại siêu vi có tính với tế bào gan gây ra, dẫn đến viêm hoại tử tế bào gan Các bệnh có triệu chứng tương tự lại khác nguyên nhân, dòch tễ, lòch sử tự nhiên tiên lượng Trong số siêu vi gây viêm gan tìm thấy bao gồm siêu vi viêm gan A, B, C, D E, siêu vi B (HBV) C (HCV) có ý nghóa quan trọng phân bố đòa dư rộng, tỷ lệ nhiễm cao số vùng giới có nguy cao dẫn đến tình trạng nhiễm mạn tính ung thư Các chẩn đoán viêm gan siêu vi chủ yếu dựa vào biểu lâm sàng, sinh thiết gan, xét nghiệm sinh hoá phản ứng huyết Các biện pháp nhiều trường hợp không cho phép xác đònh xác tác nhân gây bệnh không cho biết trạng thái tồn tác nhân bệnh nhân Viêm gan siêu vi B Bệnh viêm gan siêu vi HBV có thời gian ủ bệnh biến động khoảng 60-110 ngày Tỉ lệ nhiễm HBV mãn tính Bắc Mỹ thấp 2% số người bò nhiễm Tỉ lệ cao nhiều châu Á, Phi, đảo Thái Bình Dương người Eskimo Đây vấn nạn y tế lớn - người ta ước chừng có khoảng 300 triệu người mang mầm bệnh mãn tính giới, khoảng 3,5 tỷ người sống vùng bệnh lưu hành mức độ trung bình cao Trên 122 triệu em bé đời năm vùng có nguy cao trở thành người mang mầm bệnh ; khoảng 25%-30% người mang mầm bệnh bò nhiễm thời niên thiếu chết bệnh gan mãn tính hay ung thư gan Khoảng tỷ đến tỷ rưỡi người nhiễm HBV chết năm HBV gây đến 80% trường hợp ung thư gan, tác nhân gây ung thư đứng thứ hai sau thuốc (WHO, 2000) HBV thuộc họ Hepadnaviridae, có vật liệu di truyền mạch đôi DNA không hoàn toàn có kích thước khoảng 3,2 kb bao nucleocapsid có chứa kháng nguyên lõi HBcAg, bên kháng nguyên bề mặt HBsAg Virus hoàn chỉnh tiểu thể hình cầu có đường kính 42-47 nm, gọi hạt tử Dane Do triệu chứng lâm sàng tình trạng nhiễm HBV không phân biệt với dạng viêm gan siêu vi khác nên việc phát bệnh chủ yếu dựa chẩn đoán huyết học Tình trạng nhiễm HBV cấp tính đặc trưng diện HBsAg IgM anti-HBc huyết Các phương pháp huyết học cho phép phát thành phần vừa nêu bao gồm phương pháp khuếch tán miễn dòch, thử nghiệm kết dính hồng cầu thử nghiệm có độ nhạy cao miễn dòch enzyme (EIA) miễn dòch phóng xạ (RIA) phát đến 0,1 ng/ml HBsAg Gần người ta phát triển chẩn đoán phân tử có độ nhạy cao lai phân tử (slot dot blot) phát DNA HBV đến hàm lượng 5pg/ml (tương ứng 1,5 x 106 sao/ml) Một thử nghiệm lai pha lỏng thương mại hoá (Abbott) phát 1,5 pg/ml DNA HBV thử nghiệm bDNA (Chiron) phát 2,5 pg/ml DNA HBV PCR có độ nhạy cao nhiều, phát 10-3 pg/ml (tương ứng khoảng 100-1000 gene) [1] Vieâm gan sieâu vi C Sieâu vi vieâm gan C (HCV), xếp vào họ Flaviviridae, có vật liệu di truyền RNA mạch đơn (+), kích thước khoảng 9,5 kb Virus nuôi cấy xem nguyên nhân phần lớn trường hợp viêm gan "không A không B" Mặc dù HCV không gắn chèn vào gene ký chủ lại có khả tồn đặc biệt dai dẳng người bò nhiễm Sự nhiễm HCV dẫn đến tình trạng bệnh mãn tính 50-70% trường hợp Nhiễm cấp tính HCV thường có có triệu chứng nhẹ, khó nhận biết Chỉ khoảng 10% người nhiễm thải loại hoàn toàn virus, số lại chuyển sang tình trạng mãn tính Trong số sau này, 60% phát triển viêm gan mạn Khoảng 20% bệnh nhân viêm gan mạn bò xơ gan số chết chức gan ung thư gan Riêng thành phố Hồ Chí Minh, ung thư gan nguyên phát chiếm vò trí thứ ba dạng ung thư vò trí thứ bệnh nhân nam Một công trình nghiên cứu dòch tễ học nhiễm HCV cho thấy tỉ lệ lưu hành HCV người bình thường 1,8%, cao nhiều nhóm người có nguy cơ, từ 50% người nhận truyền máu 96,2% người nghiện [2] Việc phát HCV máu người bò nhiễm vừa có ý nghóa cho chẩn đoán theo dõi điều trò, vừa có tầm quan trọng đặc biệt việc sàng lọc để đảm bảo an toàn truyền máu sản phẩm từ máu Biện pháp chẩn đoán HCV ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) sử dụng kháng nguyên c100 tạo dòng từ gene HCV (Chiron/Ortho Diagnostic Systems) Một loạt chẩn đoán sử dụng thêm nhiều kháng nguyên tái tổ hợp khác HCV đời sau đó, với độ nhạy độ đặc hiệu ngày cao ELISA hệ thứ hai, RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) hệ thứ nhất, thứ hai, thứ ba Tuy nhiên phương pháp xét nghiệm miễn dòch có số nhược điểm không phát nhiễm giai đoạn sớm không cho kết người mà hệ thống miễn dòch không hoạt động (immunosuppressed) Các kit dựa kỹ thuật PCR phát triển cho phép phát trực tiếp HCV thời kỳ viremia với độ nhạy cao, đến khoảng 2.000 sao/ml huyết Thế mạnh kỹ thuật kể : chẩn đoán sớm xác người có nguy cao, phát HCV người mang không triệu chứng, người có hàm lượng ALT cao, người có hệ thống miễn dòch không hoạt động, khẳng đònh kết ELISA dương tính theo dõi điều trò Amplicor HCV (Roche Diagnostic Systems) kit dựa kỹ thuật PCR thương mại hóa Ở Việt Nam, có số công trình nghiên cứu sử dụng biện pháp vừa kể Kỹ thuật bDNA đònh lượng HBV áp dụng Trung Tâm Chẩn Đoán Y Khoa Hòa Hảo Tp HCM 1.2 Human papillomavirus (HPV) Ung thư cổ tử cung bệnh thuộc hàng đầu nguyên nhân lớn thứ hai gây nên chết cho phụ nữ toàn giới Hàng năm có 440.000 ca bệnh chiếm tỉ lệ 5,8% bệnh ung thư [3] Ở Việt Nam, ung thư cổ tử cung bệnh hàng đầu phụ nữ miền Nam thứ tư phụ nữ miền Bắc Theo thống kê ghi nhận ung thư quần thể thành phố Hồ Chí Minh (1998) thành phố có thêm 28,6 người 100.000 phụ nữ mắc bệnh năm Khoảng từ 90-99,7% trường hợp bệnh ung thư cổ tử cung phát có dấu hiệu nhiễm hay nhiều loại HPV (human papillomavirus) gây ung thư Human Papillomavirus (HPV) virus lây truyền qua đường tình dục phổ biến, gây nhiều loại bệnh khác người mụn cóc, u nang biểu mô… liên quan đến nhiều loại ung thư đáng ý ung thư cổ tử cung phụ nữ Đây virus nhỏ có đường kính khoảng 55nm với gene DNA vòng mạch kép gồm từ 7.200-8.000 cặp base với khoảng 10 khung đọc mở Hiện 77 kiểu gene (genotype) khác virus xác đònh người giải trình tự Người ta chia HPV sinh dục - nhóm HPV xâm nhiễm chủ yếu bề mặt niêm mạc, thường thấy đường sinh dục - thành hai loại dựa khả gây ung thư Đó nhóm "nguy thấp" (low risk), có khả gây ung thư nhóm "nguy cao" (high risk), có khả gây ung thư cao Gene HPVE6 HPVE7 virus có khả gắn xen vào gene, phiên mã tạo oncoprotein E6 E7 Các protein E6 E7 HPV "nguy cao" có khả gắn kết cao với protein p53 (có chức tiêu diệt tế bào tổn thương giai đoạn G1 trình phân bào) pRB (có chức điều hoà trình phân bào) Phức hợp E6/p53 làm hoạt tính p53 khiến cho tế bào không bò tiêu diệt bò tổn thương dẫn đến tình trạng không ổn đònh di truyền tế bào Sự gắn kết E7 pRB giải phóng tác nhân phiên mã E2F làm tăng phiên mã, hoạt hoá trình phân bào Gene E6 E7 tìm thấy tế bào ung thư HPV dương tính [3] Phương pháp chẩn đoán tế bào học Papanicolaou phát minh năm 1949, thường gọi PAP test (Pap smear), làm giảm đáng kể số tử vong ung thư cổ tử cung trở nên biện pháp phát sớm ung thư cổ tử cung thông dụng Tuy nhiên, biện pháp không xác, dễ cho kết âm tính dương tính giả, cần kết hợp với số kiểm tra khác Một số kỹ thuật phân tử PCR, lai chỗ (in situ hybridization) phát triển gần để phát diện DNA HPV tế bào cổ tử cung Các kỹ thuật phân tử cho phép xác đònh type phân biệt thương tổn cổ tử cung không liên quan đến HPV Phương pháp lai pha lỏng phát triển thành kit (Hybrid Capture Tube (HCT), Hybrid Capture II) (Digene Corporation) phép sử dụng chẩn đoán giúp xác đònh nhóm HPV "nguy cao" "nguy thấp" Đặc biệt kỹ thuật PCR, với độ nhạy độ đặc hiệu cao, phát triển với hai hệ thống primer thông dụng hệ MY09MY11 [4] hệ GP5+-GP6+ [5] Các hệ primer thiết kế dựa trình tự gene L1, cho phép phát diện nhiều type HPV bệnh phẩm MỘT SỐ VẤN ĐỀ VỀ CHẨN ĐOÁN BỆNH NHIỄM Cho đến nay, phương pháp chẩn đoán bệnh nhiễm chủ yếu dựa biểu lâm sàng, kết soi, cấy vi trùng xét nghiệm sinh hoá, miễn dòch cổ điển Tuy sử dụng phổ biến, biện pháp nêu có nhược điểm riêng Chẩn đoán dựa biểu lâm sàng tiến hành xuất triệu chứng, không đặc hiệu cho bệnh, khó cho phép phân biệt số bệnh nhiễm trùng giai đoạn sớm Kỹ thuật nuôi cấy đònh danh có độ nhạy thấp, đòi hỏi lượng vi sinh vật cao bệnh phẩm ; khó tiến hành số vi sinh vật nuôi cấy không hay phát triển chậm khó khăn đặc tính tự nhiên ; đặc biệt hiệu bệnh nhân sử dụng kháng sinh trước Các phương pháp sinh hóa miễn dòch phương pháp phát gián tiếp thông qua đáp ứng bệnh nhân nên thường khó cho kết xác giai đoạn sớm bệnh Các phương pháp độ đặc hiệu cao (trừ phi sử dụng kháng thể đơn dòng xét nghiệm miễn dòch, vốn đắt tiền khó sản xuất) Tóm lại, biện pháp vừa kể, dù sử dụng riêng lẻ hay kết hợp, thường cho kết ý độ đặc hiệu độ nhạy không cao, thời gian chờ đợi kết dài ; có ý nghóa hạn chế cho phục vụ điều trò Các phương pháp sinh học phân tử ngày phát triển để sử dụng công cụ chẩn đoán, điều trò, nghiên cứu dòch tễ học kiểm tra dòch bệnh lónh vực bệnh nhiễm Các ưu điểm chẩn đoán phân tử : (1) độ đặc hiệu gần tuyệt đối phát trực tiếp vật liệu di truyền vi sinh vật gây bệnh, (2) độ nhạy cao, kỹ thuật PCR, cho phép phát lượng vi sinh vật nhỏ, (3) thời gian cho kết nhanh, (4) tự động hóa "kit" hoá Tuy nhiên, chẩn đoán phân tử bao hàm số nhược điểm : giá xét nghiệm cao, thiết bò đắt tiền, quy trình chẩn đoán lúc chuẩn hóa, kỹ thuật viên phải đào tạo kỹ Mặc dù vậy, giới ngày phát triển xu hướng sử dụng cách chọn lọc có kiểm soát kỹ thuật sinh học phân tử để bổ sung, hỗ trợ cho chẩn đoán cổ điển Các kit thương mại hóa dùng để phát tác nhân gây bệnh ưa chuộng chúng dễ sử dụng, tránh ngọai nhiễm khâu chuẩn bò, sử dụng hóa chất, sinh phẩm điều kiện kiểm tra chuẩn hóa Tuy vậy, nhiều tác giả khuyến cáo nên phát triển phương pháp "tự chế" để đáp ứng với nhu cầu thực tế nảy sinh để phù hợp với túi tiền người bệnh nước phát triển Các chẩn đoán phân tử chủ yếu dựa kỹ thuật lai phân tử PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp dây chuyền) Các test kits sử dụng mẫu dò (lai phân tử) để phát tác nhân gây bệnh thương mại hóa sớm sử dụng rộng rãi, điển hệ thống PACE2 (Gen-Probe) nhằm phát đồng thời Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis hay hệ thống Hybrid capture (Digene, Murex) để phát HPV (Human Papillomavirus), HSV (Herpes Simplex Virus), CMV (Cytomegalovirus) Các phương pháp vừa kể nhanh đơn giản có độ nhạy kém, thật có hiệu số lượng gene tác nhân gây bệnh bệnh phẩm đạt 104 sao/ml Các phương pháp sử dụng mẫu dò có kết hợp khuếch đại tín hiệu bDNA (branched DNA probe) (Chiron) hay QB replicase (Gene-Trak) phát triển để cải tiến độ nhạy phản ứng đến khoảng 500 gene/ml Tuy nhiên, kỹ thuật nhân trình tự đích, thông dụng kỹ thuật PCR, ngày chiếm ưu độ nhạy không sánh Bên cạnh ngày nhiều kit PCR hãng lớn thương mại hóa vô số kit phương pháp phát triển phòng thí nghiệm lâm sàng để phục vụ nhu cầu chỗ Trong kit này, kỹ thuật PCR kết hợp với điện di, lai phân tử, sử dụng enzyme cắt giới hạn, … cho phép phát tác nhân gây bệnh với hàm lượng thấp, thời gian xét nghiệm nhanh hoàn toàn đặc hiệu Một vài kit PCR điển hình FDA (Food and Drug Administration) công nhận để đưa vào sử dụng : kit phát Chamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, đònh lượng HIV (Roche Diagnostic System) Ý nghóa kinh tế xã hội việc sử dụng phương pháp chẩn đoán phân tử thảo luận nhiều Bên cạnh việc cải thiện khả chẩn đoán, điều trò phòng ngừa cho người bệnh, lợi ích kinh tế điều thể việc giảm thiểu xét nghiệm đặc hiệu nhạy hơn, giảm thiểu quy trình chẩn đoán điều trò không cần thiết giúp loại bỏ tình trạng nhiễm trùng bệnh viện Bên cạnh đó, chương trình y tế nhằm sàng lọc kiểm soát tác nhân gây bệnh HPV, Chlamydia, tác nhân gây bệnh diện máu, … mức độ phân tử cá nhân tập thể người có nguy cao cũng có ý nghóa kinh tế xã hội quan trọng Chi phí bỏ để đổi lấy lợi ích chẩn đoán điều trò sớm cá nhân, kiểm soát lây lan quần thể vấn đề khác y tế cộng đồng chấp nhận Ở nước ngoài, chủ yếu dựa kỹ thuật lai phân tử PCR, nhiều thử nghiệm (kit) chẩn đoán phân tử thương mại hóa sử dụng cho chẩn đoán thường quy Các kit cung cấp cho kỹ thuật viên xét nghiệm dạng “sẵn sàng cho sử dụng” giúp giảm thiểu khâu chuẩn bò dẫn đến ngoại nhiễm; ra, hóa chất, sinh phẩm quy trình kiểm tra chuẩn hóa đảm bảo tính ổn đònh độ tin cậy xét nghiệm Ở nước ta Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng, có số nghiên cứu phát triển thương mại hóa kit dùng chẩn đoán phân tử số bệnh truyền nhiễm siêu vi gây viêm gan (HBV, HCV), Mycobacterium tuberculosis, … , Công ty Nam Khoa Số lượng chất lượng kit phát triển nước chưa đáp ứng hết nhu cầu thực tế Hiện số bệnh viện trung tâm y tế lớn bắt đầu thử nghiệm kit số kit nhập Trung tâm Chẩn đoán Y khoa Hoà Hảo, phòng xét nghiệm Bệnh viện Đại học Y Dược, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Hoàn Mỹ, … Vấn đề đặt kit nhập chi phí cho xét nghiệm lớn, ví dụ xét nghiệm phát HCV sử dụng hệ thống Amplicor (Roche) có giá 1,5 triệu đồng cho mẫu thử Còn kit phát triển nước vấn đề lớn mức độ chuẩn hóa thấp, dẫn đến không thống lớn sở xét nghiệm, kết độ tin cậy cao Vấn đề nhân viên kỹ thuật đào tạo phải giải để đảm bảo độ xác phản ứng Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử – môn Di Truyền – trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQG Tp HCM tiến hành nghiên cứu nghiệm thu đề tài có liên quan đến dự án bao gồm : Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử việc chẩn đoán số bệnh nhiệt đới (Sốt xuất huyết Dengue, Viêm gan siêu vi B C, Viêm não Nhật bản, nhiễm HPV (Human Papillomavirus) – đề tài NCKH trọng điểm ĐHQG Tp HCM, nghiệm thu 2004 Xây dựng quy trình phát HPV (Human papillomavirus) phục vụ nghiên cứu chẩn đoán – đề tài Vườn ươm sáng tạo KHKT trẻ – Sở KH & CN Tp HCM, nghiệm thu 2004 Xây dựng quy trình đònh lượng virus viêm gan B máu bệnh nhân kỹ thuật real-time PCR – đề tài NCKH trọng điểm ĐHQG, nghiệm thu 2005 Xây dựng quy trình đònh lượng virus viêm gan C kỹ thuật real-time RTPCR phục vụ cho việc nghiên cứu điều trò bệnh viêm gan siêu vi C – đề tài Sở KH & CN Tp HCM, nghiệm thu 2005 Từ kết nghiệm thu trên, tiếp tục hoàn thiện kit HBV HCV đònh tính, HBV HCV đònh lượng đưa thử nghiệm sở y tế có quan hệ hợp tác nhu cầu sử dụng thông qua việc chuyển giao công nghệ cho Công ty TNHH CNSH Khoa Thương MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Tiến hành triển khai quy trình kit dùng cho chẩn đoán phân tử tác nhân virus bao gồm HCV, HBV, HPV từ kết nghiên cứu đạt từ thành tựu công bố giới PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH HOÀN THIỆN CÁC QUY TRÌNH D Bệnh phẩm Các mẫu huyết nghi nhiễm HCV, HBV Bệnh viện ĐH Y Dược, DIAG Center Trung tâm Chẩn Đoán Y Khoa Hòa Hảo (Medic) cung cấp thời gian từ tháng 9/2005 đến tháng 4/2006 Các mẫu dòch phết cổ tử cung Bệnh viện Hùng Vương Tp HCM cung cấp thời gian từ tháng 9/2005 đến tháng 4/2006 D Các đơn vò tham gia : - Phòng Xét nghiệm – Bệnh viện ĐH Y Dược Tp HCM (BV ĐH Y Dược) - Phòng PCR – DIAG Center (DIAG Center) - Phòng PCR – BV Hùng Vương Tp HCM (BV Hùng Vương) - Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử – trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên (ĐH KHTN) 1.1 Độ (Accuracy) Đơn vò chòu trách nhiệm ĐH KHTN Thiết bò sử dụng : - PCR đònh tính : Techne TC-312 - PCR đònh lượng : iCycler 584BR Độ đònh nghóa độ trùng hợp giá trò trung bình thử nghiệm với giá trò công nhận chuẩn [6] Độ quy trình xác đònh với hai cách tiếp cận : W So sánh kết thu từ quy trình thử nghiệm với kết biết 10 bệnh phẩm Cụ thể, kết quy trình phát đònh lượng HBV quy trình phát đònh lượng HCV so sánh với kết bDNA với hàm lượng DNA HBV HCV biết ; kết quy trình phát phân nhóm HPV so sánh với kết giải trình tự Thao tác viên nhận 10 bệnh phẩm từ trưởng nhóm không kèm thông tin bệnh phẩm Đối với bệnh phẩm, thao tác viên tiến hành tách chiết DNA/RNA đặt 03 phản ứng PCR/RT-PCR độc lập, sử dụng dụng cụ, lô hóa chất máy PCR W Sử dụng huyết có hàm lượng HBV (5.105 IU/ml) HCV (5.104 IU/ml) biết WHO cung cấp để kiểm tra độ xác hai quy trình đònh lượng HBV HCV Các huyết WHO sử dụng để kiểm tra độ xác đường cong chuẩn xây dựng Các huyết WHO pha loãng bậc 10 thành ba nồng độ dùng để xây dựng đường cong chuẩn WHO Đường chuẩn WHO đường chuẩn từ amplicon xây dựng sử dụng để đònh lượng DNA HBV RNA HCV bệnh phẩm Các kết từ hai phản ứng đònh lượng so sánh để rút kết luận 10 Dung dòch TAE 5X giữ nhiệt độ phòng Bảo quản điều kiện nêu trên, kit HBV đònh tính sử dụng vòng tháng QUY TRÌNH THỰC HIỆN Thu mẫu – xử lý – bảo quản mẫu Dùng tăm vô trùng chuyên dụng phụ để thu nhận tế bào cổ tử cung Cho tăm vào ống có chứa dung dòch E, đóng nắp cẩn thận giữ mẫu ngăn đá tủ lạnh tiến hành xét nghiệm Khi tiến hành xét nghiệm, ly tâm ống chứa tăm 13.000 vòng/phút phút Tách chiết DNA Chuẩn bò eppendorf 1,5 ml đánh số tương ứng với số mẫu Bật bồn ủ nhiệt khô 600C Cho vào eppendorf 900 µl dung dòch Cho 100 µl huyết vào ống.* Vortex mạnh eppendorf máy vortex giây cho tan hoàn toàn protein biến tính Để yên 10 phút Cho 200 µl dung dòch Lắc trộn thật kỹ Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Chuẩn bò eppendorf 1,5 ml mới, đánh số tương ứng với số mẫu Chuyển 600 µl dòch sang ống eppendorf 1,5 ml mới.** Thêm 600 µl dung dòch (dung dòch cần trộn trước sử dụng) Vortex nhẹ để trộn Để yên 10 phút 116 10 Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng 11 Cẩn thận đổ bỏ dòch nổi, giữ lại cặn.*** 12 Thêm 900 µl dung dòch 13 Ly tâm 13.000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng 14 Cẩn thận đổ bỏ dòch nổi, giữ lại cặn 15 Làm khô cặn 10 phút 60°C bồn ủ nhiệt khô 16 Hòa cặn 50 µl dung dòch Nếu không tiến hành phản ứng PCR ngày, bảo quản DNA tách chiết 2-8°C vòng 2-3 ngày, -20°C vòng tháng Lưu ý : ¿ Huyết phải bảo quản -20oC từ thu đến thực phản ứng ¿¿ Chỉ thu dòch nổi, tránh chạm vào lớp dung dòch đục (protein biến tính) hai pha nước chloroform ¿¿¿ Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh PCR Thêm 10 µl chứng dương 10 µl mẫu DNA tách chiết vào ống eppendorf 0,2 ml có chứa thành phần phản ứng PCR Thay tip cho mẫu Đặt eppendorf vào máy luân nhiệt Cài đặt chương trình cho máy luân nhiệt sau : HOLD phút 95°C CYCLE (40 chu kỳ) 30 giây 94°C ; 30 giây 50°C ; 30 giây 72°C HOLD phút 72°C Điện di Chuyển mẫu đến khu vực điện di Nạp 10 µl “thang 181 cặp base” 10 µl chứng dương sản phẩm PCR trộn với µl dung dòch nạp mẫu vào gel agarose 117 Sự diện vạch kích thước 181 cặp base mẫu cho phép kết luận mẫu dương tính với HPV Chọn mẫu dương tính cho đònh type Nếu chưa thực đònh type phải bảo quản sản phẩm PCR-RDB dương -20oC Thực RDB Cho 50µl dung dòch A vào eppendorf chứa phần sản phẩm PCR-RDB lại sau điện di mẫu dương tính, trộn đều, để 30 phút nhiệt độ phòng Chú ý: Nếu không trộn đều, thí nghiệm không thành công Cho vào hộp nhỏ RDB chứa màng lai ml dung dòch G tất sản phẩm PCR dung dòch A trên, lắc ủ 42oC Loại hết dung dòch hộp, cho vào 5ml dung dòch F, lắc ủ 10 phút 420 C Lặp lại bước lần Loại hết dung dòch hộp, cho vào 5ml dung dòch F, lắc phút nhiệt độ phòng Lặp lại bước lần Loại hết dung dòch hộp, cho vào 2ml dung dòch E, ủ 45 phút nhiệt độ phòng điều kiện tối Loại hết dung dòch hộp, rửa màng lai với 5ml nước cất, đọc kết Tín hiệu tròn, màu xanh xuất vò trí màng lai mẫu nhiễm type Một mẫu đồng nhiễm nhiều type khác Loại hết dung dòch hộp, để khô giữ màng lai 40C GIỚI HẠN SỬ DỤNG Không sử dụng heparin, xem ức chế phản ứng PCR, để xử lý mẫu máu Độ tin cậy kết phụ thuộc nhiều trình thu mẫu, vận chuyển-bảo quản mẫu trước kkhi tiến hành xét nghiệm 118 CÔNG TY TNHH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHOA THƯƠNG Số: DRD-006-0107 TÀI LIỆU SẢN XUẤT GỐC Ngày ban hành : 15/10/07 Lần ban hành: 01 Trang : 119/130 KIT ĐỊNH LƯNG Tên sản phẩm: Cỡ lô: 500 phản ứng KIT ĐỊNH LƯNG Quy cách đóng gói: Eppendorf 40µl Dạng bào chế: Test thử nghiệm + Thông tin tổng quát: 1.1 Yêu cầu chung: Nguyên liệu phải đạt tiêu chuẩn chất lượng quy đònh Pha chế đóng gói tuân theo hướng dẫn GMP 1.2 Hàm lượng nhãn: Đối với hoá chất tách chiết: falcon chứa loại dung dòch A, B, C,D Đối với hoá chất RT: Eppendorf 0,2ml chứa 1µl Dung dòch R1 ông eppendorf Biopure 1,5m lchứa Dung dòch R2 Đối với hoá chất PCR Eppendorf 0,2ml chứa 40µl dòch phản ứng 1.3 Độ ổn đònh: Hoạt tính bền điều kiện khí hậu Việt Nam 1.4 Hạn dùng: 12 tháng kể từ ngày sản xuất 1.5 Điều kiện bảo quản: theo nhiệt độ yêu cầu sản phẩm, nơi khô ráo, kín, không tiếp xúc ánh sáng trực tiếp Thành phần công thức: 1.1.1 Hoá chất tách chiết : Dung dòch A Dung dòch B Dung dòch C Dung dòch D 1.1.2 Hoá chất RT Dung dòch R1 Dung dòch R2 1.1.3 Hoá chất PCR P2 P3 P4 P7 P5r ống Lô 500 phản ứng 900µl 200µl 600µl 900µl 450ml 100ml 300ml 450ml 1µl 4µl 500µl 4500µl 5µl 1µl 3.5µl 0.2µl 1µl 2500µl 500µl 1750µl 100µl 500µl 119 P6r P1 1µl 28.3µl 500µl 14150µl Nguyên liệu bao bì: 3.1 Nguyên liệu: 3.1.1 Hoá chất tách chiết: Theo tiêu chuẩn công ty Merk 3.1.2 Hoá chất RT: Theo tiêu chuẩn công ty Bio-rad 3.1.3 Hoá chất PCR: Theo tiêu chuẩn công ty Bio-rad 3.2 Bao bì: Falcon 50ml Eppendorf 1,5ml Eppendorf 0,2ml Nhãn, Hộp, Thùng Pha chế đóng gói: 4.1 Pha chế: Bước - Thiết bò: May vortex, máy ly tâm, Micropipett đủ kích cở 10µl, 200µl, 1000µl - Trộn thành phần vào 14150µl chứa sẵn falcon 50ml - Thời gian trộn : phút Bước 2: - Ly tâm nhẹ cho bám nắp Falcon xuống đáy hoàn toàn Kiểm tra lại thể tích có với dụ kiến không cách nhìn vào vạch chia thể tích thân falcon 4.2 Vô eppendorf Bước 2: - Xếp eppendorf 0,2 ml vào khay đựng chuẩn bò hút Bước 3: - Thiết bò: Micropipett 200µl - Hút 40µl vào eppendorf 0,2 ml 4.3 Dán nhãn, vô hộp, đóng thùng: - Vô hộp: hộp chứa 50 phản ứng - Sản lượng lý thuyết: 500 phản ứng Kiểm tra chất lượng: 5.1 Kiểm soát trình: - Sản lượng thực tế qua giai đoạn: pha chế, vô eppendorf, dán nhãn, vô hộp - Thể tích cho vào eppendorf: 40µl - Quy cách đóng gói: 50 phản ứng/hộp 120 5.2 Kiểm nghiệm bán thành phẩm: - Tính chất: bán thành phẩm dạng dung dòch suốt, không màu - Đònh tính: cho kết tín hiệu dương tính phải tương đương kết tiến hành mẫu chuẩn trước âm tính hoàn toàn với mẫu âm tính - Đònh lượng: phải cho kết đònh lượng xác với kết chuẩn biết trước mẫu dương tính (Chu kỳ ngưỡng lô hoá chất phải xác với lô hoá chất cũ) 5.3 Kiểm nghiệm thành phẩm: - Đặc điểm: Dung dòch suốt, màu hồng nhạt - Độ trong: Trong tạp học - Đồng thể tích: 40µl - Đònh tính: cho kết tín hiệu dương tính phải tương đương kết tiến hành mẫu chuẩn trước âm tính hoàn toàn với mẫu âm tính - Đònh lượng: phải cho kết đònh lượng xác với kết chuẩn biết trước mẫu dương tính (Chu kỳ ngưỡng lô hoá chất phải xác với lô hoá chất cũ) KCS Standard HBV định lượng Khoa Thương Mix HBV định lượng lô 04120908 Ngày KCS 18/09/08 Người thực hiện: Tuấn Anh 121 Kết Ct Thang chuẩn: (-) 0.00E+00 N/A E2 1.00E+02 E4 1.00E+04 E6 1.00E+06 E8 1.00E+08 34.86 28.01 21.25 14.23 KCS Standard HBV định lượng Khoa Thương Mix HBV định lượng lô 06240908 Ngày KCS 24/09/08 Người thực hiện: Tuấn Anh 122 Kết Ct Thang chuẩn: (-) 0.00E+00 N/A E2 1.00E+02 35.7 E4 1.00E+04 28.04 E6 1.00E+06 20.18 E8 1.00E+08 14.17 123 Kết Ct mẫu chứng dương DNA gene HBV E5 E4 (-) Kết Ct mẫu chứng dương DNA gene HBV: E4 3.94E+04 26.18 E5 8.29E+05 21.57 Kết luận: Kết KCS “ĐẠT” Mẫu chứng âm có tín hiệu Ct khơng tăng Đường chuẩn có hiệu suất >90%, khoảng cách đường cong đồng Mẫu DNA HBV dương tính có tín hiệu Ct tăng Tín hiệu Ct thể tương ứng với nồng độ biết trước 104 105 Nhân viên KCS Nguyễn Tuấn Anh 124 Kết Ct mẫu chứng dương DNA gene HBV E5 E4 (-) Kết Ct mẫu chứng dương DNA gene HBV: E4 E5 1.49E+04 3.51E+05 27.42 22.71 Kết luận: Kết KCS “ĐẠT” Mẫu chứng âm có tín hiệu Ct khơng tăng Đường chuẩn có hiệu suất >90%, khoảng cách đường cong đồng Mẫu DNA HBV dương tính có tín hiệu Ct tăng Tín hiệu Ct thể tương ứng với nồng độ biết trước 104 105 Nhân viên KCS Nguyễn Tuấn Anh KCS Standard HBV định lượng Khoa Thương Mix HBV định lượng lô 03211008 Ngày KCS 27/10/08 Người thực hiện: Tuấn Anh 125 Kết Ct Thang chuẩn: Std-1 E2 1.00E+02 35.15 Std-2 E4 1.00E+04 27.53 Std-3 E6 1.00E+06 20.78 Std-4 E8 1.00E+08 13.7 126 Kết Ct mẫu chứng dương DNA gene HBV E3 E2 (-) Kết Ct mẫu chứng dương DNA gene HBV: E2 35.54 1.34E+02 E3 32.98 6.73E+02 Kết luận: Kết KCS “ĐẠT” Mẫu chứng âm có tín hiệu Ct khơng tăng Đường chuẩn có hiệu suất >90%, khoảng cách đường cong đồng Mẫu DNA HBV dương tính có tín hiệu Ct tăng Tín hiệu Ct thể tương ứng với nồng độ biết trước 102 103 Nhân viên KCS Nguyễn Tuấn Anh 127 PHỤ LỤC : PHÂN TÍCH HIỆU QUẢ KINH TẾ Ước lượng giá thành/giá bán phản ứng Bảng 9.1PL Kit Chi phí HBV đònh tính Hóa chất : 1.950.000 (50 test/kit) Khấu hao thiết bò, điện nước : 150.000 Nhân công : 500.000 Tổng : 2.600.000 VNĐ HBV đònh lượng Hóa chất : 4.550.000 (100 test/kit) Khấu hao thiết bò, điện nước : 550.000 Nhân công : 1.200.000 Tổng : 6.300.000 VNĐ HCV đònh tính Hóa chất : 6.150.000 (50 test/kit) Khấu hao thiết bò, điện nước : 350.000 Nhân công : 900.000 Tổng : 7.400.000 VNĐ HCV đònh lượng Hóa chất : 6.700.000 (50 test/kit) Khấu hao thiết bò, điện nước : 550.000 Nhân công : 1.500.000 Tổng : 8.750.000 VNĐ HPV đònh tính Hóa chất : 1.700.000 (50 test/kit) Khấu hao thiết bò, điện nước : 150.000 Nhân công : 500.000 Tổng : 2.350.000 VNĐ HPV phân type Hóa chất : 2.250.000 (20 test/kit) Khấu hao thiết bò, điện nước : 150.000 Nhân công : 500.000 Tổng : 2.900.000 VNĐ Giá bán (VNĐ) 3.500.000 9.000.000 9.000.000 10.500.000 3.250.000 3.600.000 So saùnh giaù kit HBV đònh lượng HCV đònh lượng Giá hai sản phẩm HBV đònh lượng HCV đònh lượng từ dự án so với giá hai sản phẩm nhập ngoại có tính trình bày bảng STT 02 05 SẢN PHẨM GIÁ KIT DỰ ÁN (VNĐ) Kit HBV Đònh lượng 90.000/test Kit HCV Đònh lượng 210.000/test 128 GIÁ CỦA ROCHE (VNĐ) 1.300.000 – 1.500.000 ~ 2.000.000 129 130 ... vi kh c nên vi c phát b nh chủ yếu dựa chẩn đoán huyết h c Tình trạng nhiễm HBV c p tính đ c trưng diện HBsAg IgM anti-HBc huyết C c phương pháp huyết h c cho phép phát thành phần vừa nêu bao gồm... tựu c ng b giới PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH HOÀN THIỆN C C QUY TRÌNH D B nh phẩm C c mẫu huyết nghi nhiễm HCV, HBV B nh viện ĐH Y Dư c, DIAG Center Trung tâm Chẩn Đoán Y Khoa Hòa Hảo (Medic) cung c p... nghiên c u dòch tễ h c kiểm tra dòch b nh lónh v c b nh nhiễm C c ưu điểm chẩn đoán phân tử : (1) độ đ c hiệu gần tuyệt đối phát tr c tiếp vật liệu di truyền vi sinh vật gây b nh, (2) độ nhạy cao,