Báo cáo khoa học : Thử nghiệm tạo phôi chó nhà (canis domesticus) bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm T ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hàng nghìn năm trước, chó đã được con người nuôi dưỡng như là vật nuôi. Chó đã trở thành “người bạn thân nhất” của con người [47]. Chúng đã từng giúp cho con người trong công việc săn bắn, trang trại, trông nhà, hỗ trợ một số công tác về an ninh, phòng chống tội phạm và giúp dẫn đường cho người mù… Ngoài ra, chó còn là mô hình trong các nghiên cứu về sinh lý, về bệnh học ở người. Có hơn 370 bệnh về rối loạn di truyền ở chó và nhiều trong số đó giống với các rối loạn ở người. Vì thế, các nghiên cứu về chó là rất cần thiết nhằm phục vụ cho lợi ích của con người. Hiện nay, trên thế giới, nhu cầu về nhân bản hay mở rộng nguồn gen của những con chó có đặc tính đặc biệt đang phục vụ trong những lĩnh vực chuyên sâu khác nhau đang ngày càng nhiều nên những nghiên cứu về sinh sản ở chó càng trở nên cần thiết. Tuy nhiên, các nghiên cứu về chó ở các nước phương Tây và Mỹ lại bị hạn chế bởi các luật bảo vệ động vật và tổ chức bảo vệ động vật. Điểm bất lợi của các nước có ngành khoa học phát triển này lại là lợi thế của Việt Nam khi phong tục Việt Nam coi thịt chó là một loại thực phẩm. Chính vì thế, nguồn mẫu vật và mô hình chó cho các nghiên cứu về sinh sản trong điều kiện in vitro khá dồi dào và không bị cản trở. Tuy nhiên, các nghiên cứu về nuôi thành thục trứng, thụ tinh và nuôi phôi chó in vitro ở Việt Nam chưa đạt được các kết quả có ý nghĩa. Hiện chỉ có nhóm tác giả Quách Tuyết Anh và Trần Thị Dân Năm 2005 đã báo cáo nuôi thành thục được trứng chó với tỉ lệ 0,75% ngoài ra không còn công bố nào có kết quả cao hơn. Trên thế giới, nuôi thành thục trứng chó đã được công bố từ năm 1976 [28] nhưng ứng dụng công nghệ sinh học sinh sản trên đối tượng chó thì mới phát triển khoảng 10 năm trở lại đây [36] và kết quả còn nhiều hạn chế. Hiện nay, các kết quả của những nghiên cứu nuôi trưởng thành trứng in vitro trên thế giới còn thấp so với các loài khác. Tỷ lệ nuôi chín trứng chó chỉ đạt khoảng 20% ngoại trừ nghiên cứu gần đây của tác giả Songsasen và Wildt đã báo cáo nuôi chín trứng thu nhận từ những nang trứng có kích thước > 2 mm đạt tỷ lệ 79,5% [14], [46]. Và do đó, tỷ lệ phôi hình thành từ nguồn trứng nuôi trưởng thành in vitro này cũng rất hạn chế [14]. Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm T ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương 2 Ở Việt Nam, hiện nay chưa có quy trình nào hiệu quả cho việc nuôi thành thục trứng chó và tạo phôi chó in vitro. Những hạn chế này có thể do những đặc điểm khác biệt trong sinh lý sinh sản ở chó so với các loài động vật có vú khác. Thứ nhất là chu kỳ sinh dục của chó kéo dài khoảng 3 – 10 tháng tùy giống trong khi bò, người, heo là 20 – 28 ngày. Thứ hai là sự kiện chảy máu âm đạo ở giai đoạn tiền động dục. Sự chảy máu này không giống ở người là do bong tróc lớp niêm mạc dạ con khi không thụ tinh, ở chó sự chảy máu này là để bong lớp tế bào ngoài giúp tử cung sẵn sàng cho phôi làm tổ. Thứ ba là quá trình chín của trứng chó. Ở các loài động vật có vú khác, trứng tiến hành giảm phân trong nang trứng ở giai đoạn nang tiền rụng. Khi rụng trứng ở giai đoạn Metaphase II và sẵn sàng cho thụ tinh. Tuy nhiên, ở chó không xảy ra như vậy, khi rụng, trứng ở giai đoạn túi mầm (germinal versicle –GV) và quá trình giảm phân hoàn thành sau khoảng 48 giờ trong ống dẫn trứng [36]. Tuy nhiên, chỉ có sự kiện thứ nhất và thứ ba là có ảnh hưởng nhiều tới những nghiên cứu về sinh sản của chó in vitro. Do đó, việc tiến hành nghiên cứu về nuôi thành thục và tạo phôi chó in vitro ở Việt Nam là rất thiết thực. Các nghiên cứu này không chỉ có tiềm năng phát triển cao mà còn ẩn chứa nhiều thách thức và khó khăn. Những nghiên cứu về tạo phôi chó in vitro cần thiết được phát triển trên nền những nghiên cứu về sinh lý sinh sản ở chó. 1.1. Chu kỳ động dục ở chó Chó là loài động vật đa rụng trứng, động dục một lần một năm và không theo mùa [36]. Mỗi chu kỳ động dục kéo dài vài tháng; ngoài ra, biểu hiện về thời gian động dục ở mỗi con và mỗi giống rất khác nhau, đôi lúc những biểu hiện cũng khác nhau. Chu kỳ sinh dục bình thường của chó cái có thể phân chia thành 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn có hành vi, sinh lý và kiểu nội tiết riêng biệt. 1.1.1. Kỳ không động dục Kỳ không động dục ở chó kéo dài 2-10 tháng [47]. Tuyến sinh dục của chó ở kỳ này không có hoạt động rõ rệt. Chúng không hấp dẫn hoặc không chấp nhận cho chó đực giao phối. Âm hộ nhỏ và không phồng lên. Phân tích tế bào học ống sinh dục của chó cái cho thấy các tế bào nhỏ chiếm đa số và một phần nhỏ các tế bào Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm T ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương 3 bạch cầu và các vi khuẩn. Nội soi âm đạo thấy các nếp gấp phẳng, mỏng và đỏ. Sinh lý của chó trong giai đoạn này vẫn chưa được hiểu rõ nhưng chắc chắn là có sự giảm chức năng thể vàng và giảm tiết prolactin. Ở kỳ này, kết quả đo nồng độ estrogen được báo cáo rất khác nhau nhưng đều cho rằng hàm lượng đạt mức độ cao hơn mức trung bình một tháng trước kỳ tiền động dục rồi tăng lên nhanh chóng [30]. Trong khi đó, nồng độ của Luteinizing hormone (LH) trong huyết thanh đạt ở mức thấp, dưới 1 ng/ml, chỉ bằng 2-20% so với nồng độ đỉnh. Ở giai đoạn đầu của kỳ không động dục, follicle stimulating hormone (FSH) luôn ở nồng độ căn bản (khoảng 20 ng/ml) và tăng lên vào giữa và cuối của kỳ (>30ng/ml) [8], [29]. Chó cái trong giai đoạn không động dục không thấy có sự hoạt động chức năng của buồng trứng. 1.1.2. Kỳ tiền động dục Trong suốt kỳ tiền động dục, chó cái bắt đầu hấp dẫn con đực nhưng vẫn không chấp nhận giao phối. Có sự bong lớp màng niêm mạc giả ở tử cung khiến chảy máu âm đạo, và âm đạo mở rộng ở mức trung bình. Phân tích tế bào của âm đạo cho thấy có sự thay đổi phát triển từ những tế bào nhỏ cận gốc thành các tế bào trung gian nhỏ và lớn, tế bào trung gian và cuối cùng là tế bào biểu mô bề mặt phản ánh tác dụng của nồng độ estrogen. Nếp gấp âm đạo của chó biểu hiện sự sung phù, có màu hồng và tròn. Khi chuyển dần từ kỳ không động dục sang kỳ động dục, nồng độ estrogen tăng từ mức độ trung bình (26 pg/ml) cho tới đỉnh (50-100 pg/ml) rồi giảm xuống nhanh chóng sau đó [6], [9]. Trong kỳ tiền động dục, LH đạt đỉnh (4-40ng/ml) khoảng 1-3 ngày sau đỉnh của estrogen [6]. Ngược lại, progesterone lại tăng chậm. Progesterone tăng từ mức căn bản (0,2-0,4 ng/ml) tới trước đỉnh LH thì đạt 0,6-0,8 ng/ml và sau đỉnh thì đạt 3,2-5,4 ng/ml [7]. Vào giai đoạn sớm của kỳ tiền động dục, nang trứng trội có kích thước khoảng 2-3 mm. Các nang này phát triển tới kích thước khoảng 9-12 mm trước khi vào cuối kỳ tiền động dục [7]. Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm T ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương 4 1.1.3. Kỳ động dục Trong suốt kỳ động dục, chó có biểu hiện chấp nhận hoặc thụ động trong giao phối và có thể bị chảy máu. Sự chảy máu âm đạo này là do sự bong màng niêm mạc giả ở tử cung chó. Giai đoạn này, âm hộ chó phồng hết cỡ. Các tế bào bề mặt âm đạo chiếm đa phần. Các nếp gấp âm đạo trở nên cuộn nhiều hơn. Nồng độ estrogen giảm rõ rệt sau đỉnh LH trong khi progesterone tăng dần (khoảng từ 4-10 ng/ml ở thời điểm rụng trứng) đánh dấu pha thể vàng của buồng trứng. Kỳ động dục kéo dài 3 ngày tới 3 tuần và thường là 9 ngày. Hành vi động dục của chó có thể có trước hoặc sau đỉnh LH. Nó kéo dài (khác nhau ở mỗi cá thể) và có thể không cùng lúc với thời kỳ có thể thụ tinh. Trứng tiền trưởng thành rụng ở thời điểm 2 ngày sau đỉnh LH và thành thục khoảng 2-3 ngày sau. Thời gian tồn tại của trứng sau thành thục là 2-3 ngày [6], [8], [29]. 1.1.4. Kỳ đình dục Trong kỳ đình dục, những con chó bình thường trở nên khó tính cùng với giảm các biểu hiện lôi cuốn con đực. Sự chảy máu âm đạo giảm và âm hộ cũng giảm phồng từ từ. Nồng độ estrogen ở mức thấp còn nồng độ progesterone tăng dần tới đỉnh là 15-80 ng/ml và duy trì ở mức cao trước khi giảm dần ở cuối kỳ đình dục (khoảng 30-50 ngày) ở cả cá thể mang thai và không mang thai [6]. Nội mạc tử cung và cơ tử cung phát triển dưới ảnh hưởng của sự tăng nồng độ progesterone. Kỳ đình dục thường kéo dài 2-3 tháng ở những con chó mang thai. Cá thể sẽ đẻ khoảng 64-66 ngày sau đỉnh LH. Nồng độ prolactin tăng ngược lại với sự giảm progesterone ở giai đoạn cuối của kỳ đình dục hoặc mang thai. Progesterone đạt mức độ cao nhất trong giai đoạn mang thai. Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm T ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương 5 Hình 1: Hình ảnh tế bào học ống sinh sản chó trong chu kỳ động dục Giai đoạn đầu kỳ tiền động dục có sự tập trung của bạch cầu trung tính, tế bào cận gốc, tế bào biểu mô bề mặt, hồng cầu, và chất nhầy Giai đoạn cuối kỳ tiền động dục, hồng cầu, tế bào biểu mô, và sự vắng mặt của các bạch cầu trung tính Giai đoạn động dục đặc trưng bởi các tế bào biểu mô được keratin hóa, phần lớn không có nhân và tế bào có góc cạnh Giai đoạn đình dục đặc trưng bởi sự giảm sút các tế bào biểu mô, sự tăng các tế bào trung gian, và sự hiện diện của bạch cầu trung tính. Nguồn: http://www.vet.uga.edu/vpp/clerk/beimborn. Tế bào gốc (basal cell): là những tế bào trẻ nhất của tế bào biểu mô âm đạo Tế bào cận gốc (parabasal cell): là những tế bào nhỏ nhất trong các tế bào biểu mô âm đạo Tế bào trung gian (intermediate cell) có kích thước rất khác nhau nhưng thường lớn hơn 2 lần tế bào cận gốc Tế bào biểu mô (superficial cell): là những tế bào già nhất trong các tế bào biểu mô âm đạo Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm T ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương 6 1.2. Sự thành thục của trứng chó in vivo 1.2.1. Các giai đoạn phát triển của trứng chó Ở giai đoạn nang sơ cấp, các trứng chứa một nhân, bao quanh bởi ty thể, mạng lưới nội chất trơn và thể Golgi. Vào giai đoạn phát triển sớm, liên kết giữa trứng và nang chưa hoàn thiện đầy đủ [53] [54]. Màng trong suốt của trứng trong nang sơ cấp bắt đầu hình thành và trở nên rõ ràng cùng với sự tăng trưởng tế bào. Một nghiên cứu về vi cấu trúc gần đây đã chứng minh rằng màng trong suốt ở trứng chó được hình thành bởi mạng lưới các sợi fibrin và các lỗ với nhiều kích thước [51]. Độ dày của màng trong suốt của trứng phát triển đầy đủ khoảng 10 µm. Ty thể hiện diện ngày càng nhiều trong suốt thời kỳ phát triển của trứng, thể hiện sự gia tăng các hoạt động trao đổi chất trong trứng [53], [54]. Tế bào chất của trứng giai đoạn nang sơ cấp bao gồm các hạt và sợi hoặc các phiến lưới nội chất. Thể Golgi cũng tăng về số lượng. Các hạt lipid đầu tiên xuất hiện trong noãn sơ cấp của nang đang phát triển và gia tăng trong suốt quá trình sinh trứng [53], [54]. Thành thục Rụng trứng Thời kỳ thụ thai Sự sừng hóa âm đạo Kỳ tiền động dục Kỳ động dục Kỳ đình dục Chu kỳ động dục với ngày bắt đầu kỳ động dục là ngày thứ nhất H ình 2 : Diễn tiến hormone trong chu kỳ động dục chó ( Ngu ồn: yourownvet.com ) Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm T ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương 7 Trong giai đoạn sớm của nang trội, nhân chiếm gần hết thể tích của noãn bào, bao xung quanh là các ty thể, và số lượng các hạt lipid tiếp tục tăng. Các vùng tế bào chất của trứng tiếp giáp với các tế bào hạt có sự hiện diện với số lượng lớn các thể Golgi và vài ty thể. Trong suốt quá trình phát triển, trứng vẫn tiếp tục gia tăng kích thước cùng với đó là sự gia tăng của các hạt lipid khiến cho trứng có màu đen [12], [54]. Cho tới nay, người ta vẫn chưa biết hạt lipid hiện diện trong trứng chó với số lượng lớn như thế có ảnh hưởng như thế nào đến sự trưởng thành và phát triển trứng ở loài này. Trong sinh lý bình thường, trứng chó được giải phóng khỏi nang trứng ở giai đoạn prophase I của quá trình phân chia giảm phân [14] lúc này trứng vẫn còn sự hiện diện của túi mầm (germinal vesicle) ở trong tế bào chất. Túi mầm được tạo thành từ màng nhân và một nhân chứa vật chất di truyền. Trứng có sự thay đổi quan trọng về hình thái nhân trong suốt quá trình thành thục bao gồm sự phiên mã của mRNA và tổng hợp protein ở mức cao. Ở tế bào chất, sự hình thành của các bào quan, điển hình là ti thể và ribosome và sự hình thành nên màng trong suốt (zona pellucida) và hạt vỏ cho phép quá trình giảm phân tới giai đoạn metaphase II, thể hiện ở sự giải xoắn của các nhiễm sắc thể và xuất hiện của thể cực thứ nhất. Sự rụng trứng xảy ra 2 ngày trước kỳ động dục và ở hầu hết các con chó cái là khoảng ngày thứ 3 sau khi có biểu hiện chấp nhận giao phối [22], [55]. Trứng được giải phóng khỏi nang tiền rụng (có đường kính khoảng 4-13 mm) ở giai đoạn túi mầm có đường kính khoảng 118-135 µm. Quá trình vỡ túi mầm ở trứng chó diễn ra khoảng 48 giờ trong ống dẫn trứng [22], [55]. Trứng đạt giai đoạn thành thục về nhân khoảng 48-72 giờ sau rụng trứng. Theo kết quả báo cáo của Reynaud và cs (2005), khi quan sát trứng từ 17 đến 138 giờ sau rụng trứng cho thấy trứng đầu tiên đạt giai đoạn metaphase II vào 54 giờ sau rụng [36]. Các trứng thành thục in vivo cũng cho thấy có sự giãn nở của lớp tế bào hạt tuy nhiên lớp trong cùng bao quanh sát trứng còn tồn tại quanh trứng tới tận giai đoạn phôi nang [22]. Trứng chó được thụ tinh di chuyển trong ống dẫn trứng khoảng 9-10 ngày sau đó mới tiến vào tử cung [22], [55]. Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm T ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương 8 1.2.2. Đặc điểm môi trường phát triển của trứng chó in vivo Môi trường nang trứng Trong buồng trứng của tất cả các loài động vật có vú, nang trứng là một đơn vị cấu trúc và chức năng. Nang trứng chứa giữ trứng phát triển và thành thục. Trong nang trứng đang tăng trưởng, trứng chó phát triển và gia tăng về kích thước [12]. Trứng nhỏ với một lớp tế bào hạt tiền thân hình thành trong nang nguyên sơ (primordial) (đường kính 25 µm); trong nang tiền xoang (pre-antral follicle), trứng hiện diện cùng với sự bao quanh của lớp đơn tế bào hạt và ở cuối nang tiền xoang (advanced preantral follicles) (đường kính khoảng 211,4 ± 1,5 µm) trứng lớn lên (đường kính khoảng 115 ± 14 µm), có sự tập trung các hạt lipid với số lượng lớn. Đây cũng là đặc trưng của trứng chó tiền rụng với nhiều lớp tế bào hạt bao quanh. Ở giai đoạn sớm của nang trưởng thành (đường kính khoảng 360,5 ± 18 µm) có sự hình thành những xoang [12] và kích thước nang trưởng thành giai đoạn tiền rụng đạt khoảng từ 2-3 tới 8-10 mm [8]. Do vây, trong suốt giai đoạn phát triển này, đường kính của trứng tăng từ khoảng gần 20 µm đến 120 µm và trở nên tương đối hoàn thiện. H ình 3 : Các giai đoạn phát triển nang buồng trứng. (a): Nang nguyên sơ (b): Nang sơ cấp (c): Nang thứ cấp (d): Nang tiền trội (e) Nang trội (f): Nang đa noãn (Nguồn: Blackmore và cs 2004) Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm T ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương 9 Đa số các nang chỉ gồm 1 trứng mặc dù nang đa rụng trứng đã được quan sát ở chó cũng như nhiều loài động vật có vú khác. Tuy nhiên, phần trăm nang đa rụng ở chó gặp nhiều hơn: 14% ở những con chó 1-2 tuổi và 5% ở những con 7-11 tuổi [52]. Sự hiện diện của nang đa rụng không được coi như một hiện tượng bệnh lý mà nó là một hiện tượng tự nhiên bắt nguồn từ sự hiện diện với mật độ cao các mảng nang sơ cấp trong tủy của buồng trứng chó non. Số phận của các nang rụng nhiều lần vẫn chưa được biết rõ. Chúng có thể hoặc rụng hoặc trải qua sự thoái lui (atresia) như ở đa số các nang rụng một lần [1]. Có 2 kiểu thoái hóa được quan sát ở buồng trứng chó: thoái hóa kiểu A, kiểu này chiếm đa số ở nang tiền xoang, đặc trưng bởi sự hoại tử của trứng và màng trong suốt. Trái lại, sự thoái hóa kiểu B, là sự hoại tử của tế bào hạt. Quá trình thoái hóa kiểu B dẫn tới kết quả là nang tăng trưởng giả bởi sự phát triển giả hình thành cấu trúc giống nang tăng trưởng [49]. Môi trường ống dẫn trứng Sự thành thục ngoài nang trứng và thời gian sống kéo dài trong ống dẫn trứng là nét đặc biệt của trứng chó. Ống dẫn trứng của chó giúp trứng tồn tại trong thời gian dài bao gồm sự thành thục hoàn toàn, sự thụ tinh và sự phát triển tới giai đoạn phôi nang. Do vậy, tổng thời gian trứng chó trong ống dẫn trứng khoảng 8,5 tới 9 ngày, nhiều hơn 3-4 ngày so với các loài khác [22]. Bởi thế, hình thái của ống dẫn trứng phải thích hợp cho sự tồn tại dài ngày của giao tử trong cơ quan này. Trong thực tế, lòng trong của ống dẫn trứng động vật có vú được hình thành bởi tổ hợp hệ thống những nếp gấp niêm mạc nhầy đan dọc vào nhau. Những nếp gấp dọc được sắp thành hàng bởi một lớp biểu mô hình trụ đơn giản. Hình thái và đặc tính sinh học của mô này được điều khiển bởi hormone buồng trứng [56]. Trong suốt chu kỳ động dục của chó, các tế bào biểu mô xếp hàng bao gồm các tế bào có lông nhung đã biệt hóa hoàn toàn và các tế bào tiết, chúng chiếm tới 40-50% các tế bào biểu mô. Do vậy, ở chó, trứng được đặt trong môi trường các chất tiết và chất nhầy của ống dẫn trứng trong một thời gian dài, và có thể những chất này có vai trò chủ chốt trong sự kiện toàn của trứng. Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm T ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương 10 Sự tương tác với tinh trùng trong ống dẫn trứng Trong cơ thể, trứng chó rụng duy trì khả năng thụ tinh ít nhất 4 ngày [55]. Sự giao phối có thể xảy ra trước 2-3 ngày đến 1 tuần sau khi rụng trứng. Tinh trùng có thể thực sự hiện diện quanh tổ hợp trứng-tế bào ổ trước cả khi trứng thành thục. Chúng vẫn có thể còn sống sau khi giao phối 11 ngày trong ống dẫn trứng của con cái [11]. Thời gian tinh trùng tập trung quanh trứng chó không chắc chắn vì chênh lệch giữa thời điểm rụng trứng, thụ tinh và thành thục của trứng. Trong một nghiên cứu in vivo đã báo cáo có sự hiện diện của tinh trùng trong trứng ở giai đoạn túi mầm, mặc dù không có sự thay đổi trong những đầu tinh trùng được quan sát cho tới sau khi trứng bài xuất thể cực thứ 2. Trong khi sự tập trung của tinh trùng ở trứng tiền thành thục có thể xảy ra, hiện nay vẫn không có bằng chứng về phôi phát triển sau đó của những trứng được báo cáo này. Mặt khác, ở loài cáo xanh sự phát triển của tiền nhân đực đã được quan sát ở trứng giai đoạn túi mầm thu nhận từ những con đã giao phối [13]. 1.3. Những cố gắng nuôi thành thục trứng chó in vitro Theo các báo cáo hiện nay, tỷ lệ IVM trên trứng chó chỉ đạt khoảng 20% và do đó tỉ lệ phát triển thành phôi cũng thấp trong các thử nghiệm IVF [21]. Trong thập kỷ gần đây, các nhà khoa học đang cố gắng tìm hiểu sự thành thục và thụ tinh in vitro ở trứng chó. Đó là một thách thức vô cùng hấp dẫn đối với các nhà khoa học. Đa số ý kiến cho rằng sự phân chia giảm phân của trứng chó in vitro là kết quả ảnh hưởng một cách gián tiếp bởi gonadotropin, hormone nhóm steroid, nhân tố tăng trưởng và protein bổ sung trong môi trường nuôi cấy. Ngược lại, một số tác giả khác lại cho rằng sự trưởng thành nhân của trứng có thể xảy ra in vitro không phụ thuộc vào nguồn protein bổ sung trong môi trường. Do đó, nhiều thử nghiệm đã được tiến hành nhằm mô phỏng các đặc tính sinh hóa cũng như sinh lý môi trường nang trứng hay ống dẫn trứng. 1.3.1. Thử nghiệm mô phỏng điều kiện in vivo Nuôi cấy nang trứng Sự duy trì cấu trúc ba chiều của nang trứng cho phép bảo tồn chức năng và hình thái của đơn vị chứa và nuôi dưỡng trứng phát triển và thành thục một cách toàn vẹn. Bolamba và cs (1998) ước lượng sự trưởng thành nhân của trứng chó thông [...]... Hương Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm 2.1.5 Chỉ tiêu đánh giá - Khả năng sống của trứng theo thời gian nuôi ủ - Tỉ lệ trưởng thành nhân của trứng sau các khoảng thời gian nuôi ủ 2.1.6 Xử lý số liệu - Số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê oneway anova bằng phần mềm Statgraphics XV Nội dung nghiên cứu 26 Ngô Thị Mai Hương Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh. .. về phòng thí nghiệm trong thời gian 1 giờ Nội dung nghiên cứu 27 Ngô Thị Mai Hương Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm b a c Hình 1 2: Thu nhận tinh hoàn chó (a) Xác định tuổi chó; (b) Vị trí vết mổ; (c) Thu nhận tinh hoàn Chuẩn bị tinh trùng Tại phòng thí nghiệm, tinh hoàn được loại bỏ lớp màng bao xung quanh để lộ phần mào tinh hoàn (hình 13) Một đoạn mào tinh hoàn được... tỉ lệ thụ tinh 30%, một nửa trong số đó là thụ tinh đa tinh trùng Các tác giả này cũng cho biết tỷ lệ thụ tinh của Tổng quan tài liệu 19 Ngô Thị Mai Hương Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm trứng thu nhận từ chó giai đoạn động dục là 42,5%, giai đoạn không động dục là 34,3% và giai đoạn hoàng thể hóa là 18,6% Tổng số các phôi phát triển sau giai đoạn 8 tế bào trong. .. thí nghiệm Nội dung nghiên cứu 23 Ngô Thị Mai Hương Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm Nuôi thành thục trứng Thí nghiệm nuôi thành thục trứng trong đề tài được mô phỏng theo các diễn tiến sinh lý sinh sản của chó Như đã đề cập trong phần tổng quan tài liệu, quá trình thành thục của trứng chó không diễn ra trong điều kiện nồng độ hormone cao như các loài khác Trứng chó. .. - Tỉ lệ thụ tinh của trứng sau các khoảng thời gian nuôi trứng - Tỉ lệ phôi tạo thành ở các khoảng thời gian nuôi trứng 2.2.6 Xử lý số liệu - Số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê oneway anova bằng phần mềm Statgraphics XV Nội dung nghiên cứu 29 Ngô Thị Mai Hương Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm PHẦN 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN KẾT QUẢ 1: Nuôi thành thục trứng chó in vitro... quả tạo phôi chó in vitro Do những kết quả hạn chế trong nuôi thành thục trứng chó in vitro nên kết quả thụ tinh, và nuôi phôi chó cũng rất hạn chế Mahi và Yanagimachi (1976) là nhóm đầu tiên báo cáo về thử nghiệm thụ tinh ống nghiệm ở loài này và thu được khoảng 20-30% trứng thụ tinh được đánh giá thông qua sự hiện diện của tiền nhân đực trong các noãn bào [28] Songsasen và cs (2002) đã thụ tinh trong. .. thành thục trứng chó trên cho thấy khi tăng thời gian nuôi cấy trứng chó thu nhận từ buồng trứng giai đoạn không động dục đã làm tăng tỉ lệ trứng chó phát triển tới giai đoạn MII song không làm tăng tỉ lệ trứng chó tiến tới giảm phân Kết quả - Thảo luận 34 Ngô Thị Mai Hương Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm a b c d e g h i k Hình 1 5: Trứng chó sau nuôi thành thục và... Ngô Thị Mai Hương Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm PHẦN 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU NỘI DUNG 1: Nuôi thành thục trứng chó in vitro 2.1.1 Nguyên liệu Buồng trứng chó giống nội đang ở độ tuổi sinh sản (1,5 – 4,5 tuổi) Buồng trứng được thu nhận tại lò mổ của gia đình anh Hải, số nhà 15/8 Bùi Thị Xuân, P3, Q Tân Bình, Tp.HCM Hình 6: Chó giống nội 2.1.2 Môi trường – Hóa chất... nuôi cấy với các tế bào ống dẫn trứng thu nhận từ phần loa của ống dẫn trứng chó ở giai đoạn động dục có ảnh hưởng tốt tới tỉ lệ trưởng thành của trứng, đạt 16,7% sau 48 giờ và 23,2% sau 72 giờ nuôi [2] Việc đồng nuôi cấy trứng chó trên lớp đơn tế bào ống dẫn trứng là một thử Tổng quan tài liệu 11 Ngô Thị Mai Hương Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm nghiệm nhằm gia tăng... thành thục với sự xuất hiện của thể cực thứ nhất; (d) trứng ở giai đoạn túi mầm; (e) trứng ở giai đoạn vỡ túi mầm; (g) trứng ở giai đoạn metaphase I; (h) trứng ở giai đoạn anaphase I; (i) trứng ở giai đoạn metaphase II; (k) trứng thoái hóa nhân (X-20) Kết quả - Thảo luận 35 Ngô Thị Mai Hương Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm KẾT QUẢ 2: 3.2.1 Kết quả thụ tinh, tạo phôi chó . nhất trong giai đoạn mang thai. Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm T ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương 5 Hình 1: Hình ảnh tế bào học ống sinh sản chó trong. Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm T ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương 10 Sự tương tác với tinh trùng trong ống dẫn trứng Trong cơ thể, trứng chó rụng. già nhất trong các tế bào biểu mô âm đạo Thử nghiệm tạo phôi chó nhà bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm T ổng quan tài liệu Ngô Thị Mai Hương 6 1.2. Sự thành thục của trứng chó in vivo