Trước khi thu nhận tinh hoàn, chó đực được xác định tuổi thông qua đánh giá hình thái răng. Chó được thu nhận tinh hoàn ngay khi vừa được giết (chưa trải qua quá trình làm sạch lông bằng nước nóng). Một đường mổ khoảng 3 cm được rạch sát vị trí bìu và háng của chó đực (hình 12.b). Tinh hoàn được lấy ra khỏi bìu, được rửa sạch bằng nước muối sinh lý ấm (35-380C), được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong thời gian 1 giờ.
Chuẩn bị tinh trùng
Tại phòng thí nghiệm, tinh hoàn được loại bỏ lớp màng bao xung quanh để lộ
phần mào tinh hoàn (hình 13). Một đoạn mào tinh hoàn được tách riêng và được cắt nhỏ trong dung dịch BO ấm 380C, được vortex nhẹ trong 1 phút. Dịch thu nhận sau khi vortex được tiến hành ly tâm thu cặn trước khi chọn lọc tinh trùng khỏe bằng phương pháp bơi lên (swim-up) với dung dịch BO ấm. Sau 30 phút ủ trong điều kiện 38,50C, 5%CO2, bão hòa hơi nước, dung dịch BO phía trên được thu nhận và ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 3 phút. Dịch nổi phía trên của ống ly tâm được loại bỏ, cặn được huyền phù lại với dung dịch BO, được điều chỉnh tới mật độ 107 tinh trùng/ml. 10µl dung dịch này được thêm vào 90 µl vi giọt thụ tinh có sẵn trứng.
Thụ tinh và nuôi phôi
Trứng sau thời gian nuôi cấy được chuyển vào vi giọt thụ tinh. Tinh trùng được thêm vào vi giọt này tới mật độ cuối cùng là 106 tinh trùng/ml. Trứng và tinh trùng
được đồng nuôi cấy trong tủủ CO2 ở điều kiện 38,50C, 5%CO2, bão hòa hơi nước.
a b c
Hình 12: Thu nhận tinh hoàn chó
(a) Xác định tuổi chó; (b) Vị trí vết mổ; (c) Thu nhận tinh hoàn
Hình 13: Quy trình thu nhận tinh trùng từ mào tinh
(a) Tinh hoàn; (b) Mào tinh hoàn (đầu mũi tên); (c) mào tinh hoàn cắt rời; (d) Mào tinh hoàn được cắt nhỏ; (e) Ly tâm dịch tinh trùng
Sau 8-10 giờ nuôi ủ, trứng được chuyển sang môi trường nuôi phôi (cũng là môi trường nuôi chín trứng). Sau 48 giờ, quan sát, ghi nhận kết quả tạo phôi.
2.2.5. Chỉ tiêu đánh giá
- Tỉ lệ thụ tinh của trứng sau các khoảng thời gian nuôi trứng. - Tỉ lệ phôi tạo thành ở các khoảng thời gian nuôi trứng.
2.2.6. Xử lý số liệu
- Số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê oneway anova bằng phần mềm Statgraphics XV.