Sau khi nuôi thành thục trứng chó, tại các thời điểm 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ sau nuôi, tinh trùng thu từ mào tinh hoàn chó được thêm vào vi giọt nuôi trứng với mật độ tinh trùng cuối cùng là 106 tinh trùng / ml. Sau 8-10 giờ đồng nuôi cấy với tinh trùng, trứng được chuyển sang môi trường mới, tiếp tục nuôi trong cùng điều kiện 38,50C, 5% CO2, bão hòa hơi nước. Kết quả tạo thành phôi và phát triển phôi được ghi nhận trong bảng 3. Bảng 4: Kết quả thụ tinh, tạo phôi Giờ nuôi trứng Số trứng thụ tinh
Tiền nhân Phôi Thụ tinh
n X ± SD n X ± SD n X ± SD 48 138 21 14,68 ± 4,04 2 1,09 ± 2,01 23 15,77a ± 4,66 60 129 26 19,95 ± 7,64 3 2,44 ± 5,43 29 22,39b ± 11,2 72 105 21 20,1 ± 6,92 3 2,26 ± 3,14 24 22,27b ± 6,16 a, b. c : Chỉ sự khác biệt theo cột với P < 0,5
*: Bao gồm tỉ lệ hình thành tiền nhân và tỉ lệ tạo phôi
Biểu đồ 3: Tỉ lệ thụ tinh
Sau 9 lần thí nghiệm lặp lại, kết quả tạo thành phôi như sau:
Ở lô thụ tinh sau 48 giờ nuôi, có 2 lần thí nghiệm lặp lại thu nhận được phôi. Mỗi lần lặp lại thu nhận được 1 phôi giai đoạn 2 tế bào. Hai phôi này đều không
Tỉ lệ thụ tinh 0 5 10 15 20 25
tiền nhân phôi thụ tinh
(%
)
48 giờ60 giờ 60 giờ 72 giờ
phát triển đến giai đoạn tiếp theo. Trung bình tỉ lệ trứng đạt giai đoạn tiền nhân thu được là 14,8% và tỉ lệ trứng thụ tinh là 15,77%.
Ở lô thụ tinh sau 60 giờ nuôi, thu nhận được tổng số 3 phôi từ 2 lần thí nghiệm lặp lại. Trong đó có 2 phôi giai đoạn 4 tế bào và 1 phôi giai đoạn 2 tế bào. Không có phôi nào phát triển tới giai đoạn tiếp theo. Tỉ lệ trứng đạt giai đoạn tiền nhân là 19,95%; tỉ lệ thụ tinh là 22,39%.
Ở lô thụ tinh sau 72 giờ nuôi, thu nhận được 2 phôi giai đoạn 2 tế bào và 1 phôi giai đoạn 4 tế bào từ 3 lô thí nghiệm. Không có phôi nào phát triển tới giai đoạn tiếp theo. Tỉ lệ trứng đạt giai đoạn tiền nhân là 20,1%; tỉ lệ trứng thụ tinh là 22,27%.
Các kết quả trên cho thấy trứng thụ tinh sau 60 giờ và 72 giờ nuôi thành thục cho hiệu quả thụ tinh cao hơn ở cả phương diện trứng đạt giai đoạn tiền nhân và phôi. Do đó, kết quả thụ tinh cũng cao hơn. Tuy nhiên, không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê giữa các lô 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ ở các chỉ tiêu.
b a
c Hình 16: Phôi chó thu nhận in vitro. (a) Phôi 4 tế bào; (b) phôi 2 tế bào; (c) phôi 2, 4 tế bào (lô thụ tinh với trứng tại thời điểm 60 giờ) (X-20)
Kết quả thụ tinh với trứng chó nuôi trưởng thành in vitro trong đề tài này cao hơn nghiên cứu của các tác giả như Hatoya và cs (2006) đạt tỉ lệ hình thành tiền nhân là 8% [16]; và thấp hơn một số tác giả: Saikhun và cs (2008) đạt tỉ lệ tạo thành phôi 2 tế bào là 33,6%, tỉ lệ tạo thành phôi 8-16 tế bào là 4,1% [43]; Cui và cs (2006) đạt tỉ lệ hình thành tiền nhân đực ở lô trứng nuôi thành thục 48 giờ là 32%; ở lô trứng nuôi 72 giờ là 28% [10].
Cùng với tỉ lệ trứng sống / thoái hóa; tỉ lệ trứng thành thục, kết quả thụ tinh cho thấy trứng sau nuôi 48 giờ chưa thực sự sẵn sàng cho thụ tinh tạo phôi in vitro còn trứng được nuôi tới 72 giờ trong điều kiện in vitro có tỉ lệ trứng có nhân đạt metaphase II cao nhất nhưng tỉ lệ trứng thoái hóa cao nên cũng ảnh hưởng tới kết quả tạo phôi và sức sống của phôi. Trứng được nuôi tới thời điểm 60 giờ đã thể hiện được những ưu thế hơn ở các thời điểm khác về các tiêu chí tỉ lệ trứng thoái hóa không cao, tỉ lệ trứng tiến hành giảm phân tương đương các thời điểm khác, tỉ lệ thụ tinh cao tương đương kết quả của trứng nuôi ở 72 giờ; thêm vào đó trong các phôi hình thành, đã có phôi phát triển tới phôi 4 tế bào.