36 Vải thiềuTH TH Ông Nguyễn Đức Cảnh, thôn Thúy Lâm, xã Thanh Sơn, TH 37 Vải thiều THTH37Ông Nguyễn Văn Điều, thôn Thúy Lâm, xã Thanh Sơn, TH
2.2.3.2.Xác định hàm lợng và độ tinh sạch của ADN
Việc xác định hàm lợng và độ tinh sạch của ADN có thể đợc thực hiện bằng cách đo độ hấp thụ tia UV ở các bớc sóng 230, 260, 280 nm trên máy đo quang phổ. Khi đó ADN có đỉnh hấp thụ cực đại ở bớc sóng 260 nm. Từ giá trị
OD260 ta sẽ tính đợc hàm lợng của ADN thu đợc (chẳng hạn số đo trên máy là
1,0 thì hàm lợng ADN sẽ vào khoảng 50 mg/1 ml mẫu). Độ tinh sạch của ADN
có thể đợc xác định bằng tỷ số OD260/OD280 và OD260/ OD230. Các tỷ số này lần
lợt chỉ ra sự có mặt của các tạp chất là protein, các hợp chất polyphenol và
carbonhydrate. Một mẫu ADN đợc coi là tinh sạch nếu tỷ số OD260/OD280 và OD260/
OD230 đạt 1,8 - 2.
Các bớc đo đợc tiến hành nh sau:
- Chỉnh cân bằng máy: dùng nớc cất 2 lần khử ion, vô trùng để làm chuẩn.
- Kiểm tra máy: đo một mẫu ADN có nồng độ chuẩn đã biết trớc (ADN
của thực khuẩn thể λ).
- Đo mẫu ở bớc sóng λ = 260 nm và λ = 280 nm.
Mẫu đợc pha loãng 200 lần theo công thức: lấy 995 μl nớc cất + 5
μl ADN mẫu, lắc đều cho vào cuvet, đặt vào máy đo.
- Sau mỗi lần đo phải rửa sạch cuvet bằng nớc cất. - In kết quả đo đợc.
Từ đó, ta tính đợc hàm lợng và độ sạch của ADN theo công thức:
* Hàm lợng ADN: E = 50 x HSPL x OD260
* Độ sạch của ADN: OD260/OD280 và OD260/ OD230
Trong đó E : Hàm lợng ADN (ng/μl),
50 : Hằng số,
HSPL: Hệ số pha loãng,
OD260: chỉ số đo đợc ở bớc sóng 260 nm,
OD280: chỉ số đo đợc ở bớc sóng 280 nm.
2.2.3.2.2. Phơng pháp xác định chất lợng của ADN
Đôi khi, ADN tách chiết đợc có độ tinh sạch không cao cho nên việc xác định hàm lợng ADN bằng cách đo độ hấp thụ tia UV trên máy máy đo quang phổ có thể có sai sót do ảnh hởng của ARN và các tạp chất không phải axit nucleic. Trong trờng hợp này phải xác định chất lợng của ADN tổng số bằng phơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%.
- Hóa chất: + Agarose
+ Dung dịch TAE 1X (Tris bazơ 48,8 g/l : axit axetic 10,2 ml/l : EDTA 0,5M 20 ml/l pH 8,0)
+ Ethidium Bromide (EtBr) 0.5 μg/ml
+ Đệm tra mẫu (Buffers 10X)
- Chuẩn bị gel: Cân 0,8 g agarose hòa tan trong 100 ml dung dịch TAE 1X. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn (nếu trong quá trình đun bị
mất nớc thì bỏ thêm H2O đến thể tích 100 ml). Để nguội đến 500 - 600C, đổ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
dung dịch vào khuôn gel điện di đã cài sẵn răng lợc. Sau 30 - 60 phút, khi gel agarose đã đông cứng, gỡ khay gel cài vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập bản gel agarose khoảng 2 mm, tháo lợc ra khỏi bản gel.
- Tra mẫu: Trộn mẫu theo tỷ lệ (2 μl ADN/1 μl đệm tra mẫu 10X : 7 μl
H2O) và tra vào giếng.
- Điện di: Điện thế dùng để điện di từ 60 - 80 V. ADN chuyển từ cực âm sang cực dơng. Quan sát sự di chuyển bằng mầu của bromophenol để biết lúc nào ngừng điện di.
- Nhuộm ADN: Nhuộm ADN bằng Ethidium Bromide. Bản gel đợc lấy
ra khỏi khay điện di và đa vào dung dịch EtBr 0,5μg/ml trong thời gian
khoảng 15 phút trên máy lắc nhẹ.
- Soi ADN: Soi trên máy UV và chụp ảnh bằng máy Gen - Doc.