Phân tích đa dạng ADN tập đoàn một số giống cây lấy dầu (lạc, vừng) và đánh giá mức độ thay đổi phân tử của các dòng cây mới chọn tạo được

MỞ ĐẦU 5 CHƯƠNG1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7 1.1. Giới thiệu về cây lạc. 7 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, và phân bố. 7 1.1.3. Tình hình sản xuất lạc. 9 1.1.4. Một số phương pháp chọn tạo giống cây lạc. 11 1

MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 Giới thiệu về cây lạc 7

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, và phân bố 7

1.1.3 Tình hình sản xuất lạc 9

1.1.4 Một số phương pháp chọn tạo giống cây lạc 11

1.2 Giới thiệu về cây vừng 13

1.2.1 Nguồn gốc, Phân loại và phân bố 13

1.2.2 Tình hình sản xuất vừng 14

1.3 ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc phân tích đa hình kiểu gen 15

1.3.1 Phương pháp phân tích RAPD (Random Aplified Polymorphic DNA) 16

1.3.2 Phương pháp phân tích SSR (Simple Sequence Repeats) 22

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 25

3.1.1 Cải tiến quy trình tách ADN tổng số 33

3.1.2 Kết quả tách chiết ADN tổng số 35

3.2 Đánh giá tính đa hình ADN tập đoàn giống lạc/vừng 36

3.2.1 Phân tích tính đa hình ADN lạc bằng phương pháp SSR 36

3.2.2 Phân tích tính đa hình ADN vừng bằng phương pháp RAPD 44

3.3 Xác định mức độ sai khác của các dòng lạc/vừng đột biến bằng phươngpháp phân tử 53

3.3.1 Xác định mức sai khác của các dòng lạc đột biến bằng phương pháp SSR .533.3.2 Xác định mức sai khác của các dòng vừng đột biến bằng phương pháp RAPD 62

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71

1 Kết luận 71

2 Đề nghị 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO: 72

Tài liệu tiếng Việt: 72

Tài liệu tiếng Anh 73

MỞ ĐẦU

Lạc, vừng là những cây lấy dầu quan trọng ở Việt Nam Trong đó cây lạcđược Bộ công nghiệp đề ra mục tiêu quy hoạch phát triển quy mô rộng từ năm 2001đến 2010 Riêng cây vừng mặc dù có hàm lượng dầu rất cao chiếm hơn 50%, nhưngdo năng suất thấp, hay bị rủi ro nên hiện chưa được đầu tư thích đáng [15]

Trong những năn gần đây, hạn hán ngày càng trở nên khắc nghiệt Vì vậy,trồng nhóm cây đậu đỗ sẽ kinh tế hơn so với trồng lúa nước Đặc biệt đối với nhữngvùng đất bạc màu có khó khăn về tưới nước thì trồng vừng được xem như là có hiệuquả kinh tế hơn cả Cho nên, một số tỉnh bị hạn hán không có điều kiện tưới đã vàđang tăng dần diện tích trồng các loại cây này.

Việc cải thiện giống bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo, đột biếnđã làm năng suất tăng đáng kể đối với cây lạc, vừng Chọn tạo giống cổ điển thườngmất rất nhiều thời gian và công sức. Hơn nữa, vệc lựa chọn các giống làm bố mẹthường chỉ dựa vào kiểu hình để đánh giá kiểu gen, vì thế nên hiệu quả tạo giốngchưa cao Với sự hỗ trợ của sinh học phân tử đã giúp đẩy nhanh quá trình chọn tạogiống mà không bị chi phối bởi môi trường Hàng loạt các chỉ thị phân tử dựa trêncác kĩ thuật như: AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD(Radom Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat)… đã đượcnghiên cứu và từng bước áp dụng vào chọn giống cây trồng trong đó có mục đích đểbảo tồn giống và đánh giá đa dạng kiểu gen Chỉ thị phân tử đã khắc phục đượcnhững thiếu sót, hạn chế của phương pháp truyền thống trước đây, đặc biệt là xácđịnh khoảng cách di truyền.Chỉ thị RAPD và SSR hiện đang được áp dụng rất cóhiệu quả ngay ở Việt Nam trong chọn tạo các giống lúa mới kháng rày nâu, đạo ôn(Nguyễn Thị Lang và CS, 2002) Tuy nhiên ở nước ta, việc cải tạo các giống câylạc/vừng bằng ứng dụng các chỉ thị phân tử mới bắt đầu được nghiên cứu

Nhằm bước đầu cung cấp các thông tin di truyền, góp phần lưu giữ, duy trìnguồn gen đa dạng của tập đoàn giống lạc và vừng ở phía Nam, đồng thời làm cơ sởkhoa học cho việc lựa chọn bố mẹ sử dụng trong các tổ hợp lai phù hợp theo mụcđích của người tạo giống, công trình nghiên cứu này là sử dụng hai loại chỉ thị

RAPD và SSR để “ Phân tích đa dạng ADN tập đoàn một số giống cây lấy dầu

(lạc, vừng) và đánh giá mức độ thay đổi phân tử của các dòng cây mới chọn tạođược”.

Chơng 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Giới thiệu về cây lạc

giữa vừng và lạc)2.1.1 Nguồn gốc, phân loại, và phân bố

2.1.1.1 Nguồn gốc

Cây lạc có nguồn gốc Nam Mỹ Năm 1977, E.G.Squier tìm thấynhững quả lạc đợc chôn trong các ngôi mộ của những ngời Inca cổ xa dọcbờ biển phía tây của Nam Mỹ Lạc đợc đựng trong các vại cùng một số thựcphẩm khác Niên đại của các ngôi mộ cổ này có từ năm 1500 – 1200 tr ớccông nguyên [12], [38].

Theo Gregory (1979, 1980) và một số tác giả, lạc có nguồn gốc ởNam Mỹ: phân bố từ đông bắc Braxin đến tây nam Achentina và vùng đấtdốc dãy Andes của Braxin và Peru [12], [45].

2.1.1.2 Phân loại

Lạc là cây họ đậu (Fabaceae), chi Arachis loài Arachis hypogaea.L.

hypogaea có dạng phân cành xen kẽ và loài phụ fastigiata với dạng phân

Tóm lại, từ vùng nguyên sản ở Nam Mỹ, bằng nhiều con đờng – lạcđã đợc đa đi khắp thế giới và nó nhanh chóng thích ứng với các vùng nhiệtđới, á nhiệt đới và các vùng có khí hậu ẩm Đặc biệt lạc đã tìm đợc mảnh đấtphát triển thuận lợi ở châu Phi và vùng nhiệt đới châu á Lạc đợc trồng rộngrãi ở châu Phi rồi từ đây, theo các thuyền buôn nô lệ, lạc lại đợc đa trở lạichâu Mỹ và cả châu Âu Chính sự giao lu chéo rộng rãi này đã hình thànhnên nhiều vùng gen thứ cấp và làm phong phú thêm hệ gen của lạc [12].

Hiện nay, lạc đợc trồng ở hơn 100 nớc trên thế giới, với tổng diện tíchtrên 21 triệu ha Châu á chiếm 63.4% diện tích, sản lợng chiếm 71.7%;châu Mỹ chiếm 31.3% diện tích, sản lợng chiếm 18.6% và Bắc Trung Mỹchiếm 3.7% về diện tích, sản lợng 7.5% (hình 1)

Diện tích Sản lợng

Những nớc sản xuất lạc quan trọng ở châu á là Trung Quốc, ấn Độ ,Thái Lan, Việt Nam và Indonesia Trong đó, ấn Độ có diện tích trồng lớnnhất trên 8 triệu ha

Hình 1: Diện tích, sản lợng trồng lạc của các nớc trên thế giới

ở Việt Nam, tổng diện tích trồng lạc khoảng 270000 ha (số liệu năm2000) và phân bố trên tất cả các vùng sinh thái nông nghiệp của Việt Nam[10].

japan và Gudiyaham Bunch Nh” và “Gudiyaham Bunch” Nh“small” và “Gudiyaham Bunch” Nh vậy, số nhiễm sắc thể đặc trng cho các

giống khác nhau của loài A hypogaea là 2n=4x=40 [37], [18].

2.1.3 Tình hình sản xuất lạc

2.1.3.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới

Lạc là cây lấy dầu và cung cấp thực phẩm quan trọng Nó là cây cungcấp dầu chính thứ 3 của thế giới bên cạnh cây đậu tơng và cây bông (FAOFood Outlok, 1990) [24]

Hiện nay, diện tích đất trồng lạc trên thế giới là 21 triệu ha, đợc trồngtrên 100 nớc và sản lợng đạt 29,14 triệu tấn.

Trong khi năng suất lạc trung bình trên thế giới mới đạt xấp xỉ 1,3 tấn/ha thì ở Trung Quốc thử nghiệm trên diện hẹp đã thu đợc năng suất khoảng12 tấn/ha, cao hơn 9 lần so với năng suất bình quân của thế giới Điều đóchứng tỏ tiềm năng năng suất lạc còn rất lớn để khai thác.

ấn Độ là nớc đứng đầu thế giới về diện tích trồng lạc (6-7 triệu ha) ng năng suất còn thấp (0,8-1,2 tấn/ha) Nói chung, năng suất lạc ở ấn Độkhông đồng đều, có vùng chỉ đạt 0,5 tấn/ha, có vùng lại đạt tới 3 tấn/ha [42].

nh-Trung Quốc là nớc đứng thứ 2 về diện tích trồng lạc Diện tích trồnglạc ở Trung Quốc có xu hớng tăng (năm 1993 tổng diện tích là 3379,0 nghìnha, đến năm 2002 tổng diện tích là 4920,7 nghìn ha) Năng suất lạc ở TrungQuốc khá đồng đều ở các vùng [42] Nhiều năm nay, sản phẩm lạc TrungQuốc là một trong các mặt hàng nông sản xuất khẩu nổi tiếng trên thị trờngquốc tế Trung Quốc cũng là một nớc gặt hái nhiều thành tựu nhất trongphát triển sản xuất lạc, đặc biệt trong thập kỷ 90 vừa qua Vào những năm1960, năng suất lạc Trung Quốc mới chỉ đạt 1,14 tấn/ha; năm 1970 là 1,21tấn/ha; năm1980 là 1,78 tấn/ha; đến năm 1990 là 2,5 tấn/ha Năm 1994năng suất lạc trung bình của Trung Quốc đã đạt 2,69 tấn/ha và năm 2000 đ-a năng suất lạc toàn quốc lên 3,0 tấn/ha Để đạt đợc những thành tựu nhvậy, Trung Quốc đã thực hiện chiến lợc đẩy mạnh nghiên cứu và chuyển

giao tiến bộ kỹ thuật, trong đó kỹ thuật che phủ nilon làm tăng năng suất từ20-50% [42].

Mỹ là nớc có diện tích trồng lạc không lớn (0,59 triệu ha), nhng năngsuất đạt cao nhất thế giới (3,1 tấn/ha), sản lợng đạt 1,8 triệu tấn (số liệunăm 2003) [38] Điều đó chứng tỏ Mỹ là nớc đứng đầu về áp dụng các tiếnbộ khoa học kỹ thuật.

2.1.3.2 Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam

ở nớc ta, lạc đợc trồng rộng rãi trên nhiều loại đất và địa hình khácnhau Diện tích trồng lạc có xu hớng tăng mạnh những năm trớc đây và naycó xu hớng ổn định diện tích 245- 247 triệu ha (bảng 1)

Bảng 1: Diễn biến sản xuất lạc ở nớc ta

Năm (1000ha)Diện tích Năng suất(tạ/ha) Sản lợng(tấn)

Triển vọng phát triển cây lạc ở Việt Nam:

ở nớc ta, lạc đợc coi là cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và có giá trịrất đa dạng Trớc hết, với giá trị dinh dỡng cao nên lạc là cây thực phẩm

quan trọng của nhân dân ta Trong dầu lạc chứa hàm lợng axít béo cha nocao (80% trong thành phần axít béo của dầu lạc), đây chính là loại dầu thựcphẩm tốt Ngoài giá trị dinh dỡng, lạc còn là cây cải tạo đất rất tốt.

Lạc là cây trồng nhiệt đới và á nhiệt đới nên phù hợp với điều kiệnnhiệt đới của nớc ta Bên cạnh đó, yêu cầu về đất đai đối với cây lạc khôngkhắt khe lắm

Đất đai nông nghiệp của ta bị rửa trôi và phong hoá nhanh, hàm lợngmùn và dinh dỡng thấp (nhất là đất bạc màu, đất phù sa cổ, đất dốc tụ…).).Vì vậy, trồng lạc là một trong những biện pháp cải tạo đất, tạo nền nôngnghiệp bền vững Lạc là cây trồng cải tạo đất quan trọng trong hệ thốngcanh tác đa canh ở nớc ta [10], [12].

Vài năm trở lại đây, tình trạng hạn hán kéo dài, Đảng và Nhà nớc cóchủ trơng chuyển đổi cây trồng sang cây trồng cạn, trong đó lạc là một trongnhững cây trồng chủ đạo.

2.1.4 Một số phơng pháp chọn tạo giống cây lạc và vừng

2.1.4.1 Xây dựng tập đoàn giống và cảI tiến quần thể

Bớc đầu tiên trong công tác chọn tạo giống là xây dựng tập đoàngiống nhằm thu nhập nguồn gen làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọntạo sau này Tập đoàn giống gồm các giống có nguồn gốc khác nhau: các

giống có thể thu thập từ các địa phơng hay nhập nội…).

Từ tập đoàn giống, ta tiến hành các thí nghiệm so sánh, khảo nghiệmđể xác định giống tốt cho sản xuất, một số giống khác lại đợc dùng làmnguyên liệu cho lai tạo hoặc xử lý đột biến Từ năm 1991 – 1995, bằng ph-ơng pháp chọn lọc cá thể, dòng lạc VD1 đợc chọn tạo từ giống địa phơngLỳ Qua đánh giá giống VD1 cho năng suất cao hơn giống đối chứng địa ph-ơng Lỳ 19%, hàm lợng dầu cao hơn 3% Hiện tại, VD1 đã đợc Bộ Nôngnghiệp & PTNT cho phép khu vực hóa phía Nam.

Hiện nay, thông qua các bớc đánh giá, tuyển chọn từ các giống nhậpnội chúng ta đã tuyển chọn đợc nhiều giống lạc cho năng suất cao, thíchhợp với các điều kiện sinh thái khác nhau Các giống hiện đợc trồng phổbiến rộng rãi ở phía Bắc là L14, L18…). Đều là những giống có nguồn gốcnhập nội từ Trung Quốc đợc Trung tâm NC & TN Đậu đỗ – Viện KHNN ViệtNam chọn tạo [10] [12].

Ngày nay, ngoài việc đánh giá tập đoàn giống bằng các chỉ thị hìnhthái, ngời ta còn đánh giá tập đoàn giống bằng các phơng pháp chị thị phântử (RAPD, SSR, RFLP, AFLP…).) Nhờ các chỉ thị này mà chúng ta biết đợckhoảng cách di truyền giữa các giống, tạo việc lựa chọn bố mẹ cặp lai phùhợp.

2.1.4.2 Chọn tạo giống lạc bằng phơng pháp lai hữu tính

Lai giống là phơng pháp cơ bản để tạo ra biến dị tổ hợp phục vụ chochọn lọc Nhờ lai giống mà có thể phối hợp đợc các đặc tính và tính trạng cólợi của các dạng bố mẹ và con lai Tuy nhiên, bố mẹ truyền cho con cái bộgen của chúng và kết quả của quá trình tái tổ hợp mà nhiều kiểu gen mới đ-ợc tạo ra, sau khi tơng tác với môi trờng đã tạo ra các kiểu hình mới rất cóích cho chọn giống Đó là cây kiểu thâm canh, kiểu cây lý tởng ở lúa, hàm l-ợng dầu siêu cao ở hớng dơng

Một hiệu ứng đặc biệt nhận đợc trong lai giống là hiệu ứng u thế laibiểu hiện ở đời F1 Nhờ hiệu ứng này mà phơng pháp tạo giống u thế lai đãra đời và nhiều giống cây trồng năng suất siêu cao đã đợc tạo ra nh ngô,lúa, mía, hành

Lai hữu tính kết hợp với chọn lọc đúng kỹ thuật là phơng pháp chọntạo giống lạc nhanh và có hiệu quả cao Bớc đầu tiên và có tính quyết địnhtrong công tác lai tạo là chọn bố mẹ cặp lai Tiêu chuẩn chọn bố mẹ tùytheo mục đích lai: có thể lai để cải tiến một đặc điểm nào đó (vỏ quả, tínhchống chịu…).); hoặc sử dụng trong nghiên cứu di truyền ta chọn bố mẹ cặplai có nhiều tính trạng tơng phản, có quan hệ di truyền xa [12].

Từ phơng pháp lại hữu tính, Trung tâm NC & TN Đậu đỗ đã chọn tạođợc giống L12, L03 là những giống triển vọng, phù hợp với vùng nớc trời.

2.1.4.3 Xử lý đột biến

Đột biến là sự thay đổi đột ngột về vật chất di truyền của tế bào Độtbiến có thể xảy ra ở gen (mất hay thay đổi cấu trúc) hoặc ở nhiểm sắc thể.Đột biến là quá trình hoàn toàn ngẫu nhiên và đa số chúng gây hại cho cơthể sinh vật Tuy nhiên, trong chọn tạo giống, đột biến nhân tạo có tần sốbiến dị có lợi là rất thấp nhng u điểm là thời gian tạo giống nhanh chóng vìphần lớn các biến dị đều di truyền

- Phơng pháp xử lý

Đối với cây lạc, xử lý đột biến bằng tác nhân vật lý hay hóa học đềucó tác dụng gây đột biến Các tác nhân hóa học nh: H2O2, nồng độ 1-10%và NMU (Nitro – methyl ure) nồng độ 0,01 – 0,025% Tác nhân vật lý: th-ờng dùng tia gamma Co60 liều lợng 5kr – 25 kr.

Xử lí hóa chất thờng là dùng phơng pháp ngâm hạt, thời gian ngâm 30 phút Xử lý phóng xạ bằng phơng pháp xử lý hạt khô.

5 Chọn lọc sau xử lý

Chọn lọc cá thể từ M1-M4, chọn các dòng ổn định để tiến hành chọnlọc quần thể Quần thể đột biến ổn định từ M8 và sau đó có thể tiến hànhnhân giống [13].

Giống lạc V79 là giống lạc quốc gia đợc Viện KHNN Việt Nam chọntạo bằng phơng pháp xử lý đột biến tia gamma Co60 liều lợng 5kr…).[10].2.2 Giới thiệu về cây vừng

2.2.1 Nguồn gốc, Phân loại và phân bố

Cây vừng (Sesamum indicum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày và làcây lấy dầu quan trọng Cây vừng thuộc họ vừng (Pedaliaceae) gồm 16 chivới 60 loài Có khoảng 37 loài thuộc chi Sesamum nhng chỉ Sesamumindicum là loài duy nhất đợc con ngời sử dụng trong trồng trọt Về di truyền

học, vừng là cây lỡng bội 2n = 2x = 26 [46].

Vừng là cây lấy dầu cổ xa nhất, có nguồn gốc từ Nam Phi Tại đâycòn rất nhiều vừng hoang dại cho hạt, nhng có vị đắng ở Babylon vàAssyria vừng đã đợc đánh giá là cây lấy dầu có giá trị cao cách đây 4000năm [39] Theo nhiều con đờng khác nhau, vừng đã lan tỏa ra khắp ChâuPhi, Trung Mỹ, Nam Mỹ, miền Trung á, ấn Độ, Trung Quốc, các nớc ĐôngNam á trong đó có Việt Nam Vừng có mặt ở các vùng nhiệt đới, á nhiệt đớivà một phần ôn đới vào lúc thời tiết cha bắt đầu lạnh giá Vừng chỉ có thểnảy mầm khi nhiệt độ đất trên 200C và phát triển ở nhiệt độ dới 300C Sảnphẩm chính của vừng là hạt, hạt vừng chứa bình quân 50% dầu thực vật,25% protein, 5% chất khoáng…).[14], [46], [40].

Theo tạp chí Dầu thực vật thế giới thì có khoảng 30 n“small” và “Gudiyaham Bunch” Nh ớc trên thế giớicó gieo trồng vừng quy mô tối thiểu trên 10 nghìn ha Ai Cập là nớc có năngsuất bình quân cao nhất (11,5 tạ/ha) nhng sản lợng không nhiều (khoảng 20nghìn tấn) ấn Độ, Trung Quốc là những nớc sản lợng lớn nhất thế giới, tiếptheo là Mianmar, Sudan, Mehico, Nigeria, Venezuela, Thổ Nhỉ Kỳ, Ugandaand Ethiopia Sản lợng dao động do nền kinh tế địa phơng và điều kiện thờitiết Sản lợng vừng trên toàn thế giới 2-5 triệu tấn đợc trồng ở 5-16,3 triệuha Theo tổ chức FAO (Food and Agriculture Organization of the UnitedNations) (2002), thì sản lợng vừng đợc xếp vị trí thứ 6 trong số hạt cây lấydầu ăn đợc (2.893,114 triệu tấn), và xếp vị trí 12 đối với sản lợng dầu thựcvật trên toàn thế giới (754.159 triệu tấn) [39].

ở Việt Nam, việc gieo trồng vừng đã có từ lâu Trong sách Vân đài“small

loại ngữ , nhà bác học Lê Quý Đôn đã từng tổng kết: phép làm ruộng tốt” và “Gudiyaham Bunch” Nh“small

thì nên trồng đỗ xanh trớc, sau đó đến các loại đậu nhỏ và vừng Sản l” và “Gudiyaham Bunch” Nh ợngvừng hiện nay của nớc ta khoảng 30 nghìn tấn/năm, năng suất bình quân4,8 tạ/ha

2.2.2 Tình hình sản xuất vừng

Trên thế giới, diện tích trồng vừng khá hẹp (5-16,3 triệu ha), năng suấtbình quân khoảng 3,5 tạ/ha, sản lợng 2,2 triệu tấn Lợng vừng sản xuất đợcchủ yếu dùng trong tiêu thụ nội địa

Trung Quốc và ấn độ là hai nớc có sản lợng vừng lớn nhất (trên 500tấn) Nhóm các nớc có sản lợng đứng thứ hai (trên100 nghìn tấn) là:Myanma, Sudan, Uganda Nhóm các nớc có sản lợng vừng dới 100 nghìntấn: Guatemala, Mehico, Thái Lan, Thổ Nhĩ Kì [46] trong đó có Việt Nam(bảng 2)

2.3 ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việcphân tích đa hình kiểu gen

Trong những năm qua, với sự ra đời của sinh học phân tử và côngnghệ gen, một ngành khoa học mới đã xuất hiện: Phân loại học phân tử(molecular taxonomy), chủ yếu dựa trên các kỹ thuật phân tích ADN Các kỹthuật điểm chỉ ADN phân tích và so sánh trình tự nucleotide của các đoạn“small” và “Gudiyaham Bunch” Nh

ADN đã giúp cho việc phát hiện các loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ vềvị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủngloại và tiến hoá của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật [59].

Các kỹ thuật đợc sử dụng trong phân loại phân tử bao gồm: kỹ thuậtisozym (đồng enzym), các kỹ thuật phân tích đoạn ADN nh phơng pháp đahình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment LengthPolymorphism - RFLP), các kỹ thuật trên cơ sở của phản ứng PCR nh ADNtiểu vệ tinh (Simple Sequence Repeats - SSR), đa hình các đoạn ADN nhânbản ngẫu nhiên (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA), đa hìnhchiều dài các đoạn ADN nhân bản (Amplified Fragment LengthPolymorphism - AFLP), kỹ thuật điểm chỉ ADN đa locus, lai ADN, phân tíchtrình tự ADN

Năm 1990, William và cộng sự đã phát triển kỹ thuật RAPD dựa trên cơ sởcủa phơng pháp PCR.Mồi th ờng gồm khoảng 10 nucleotide đ ợc sắp xếpường gồm khoảng 10 nucleotide được sắp xếp ường gồm khoảng 10 nucleotide được sắp xếptheo một trình tự ngẫu nhiên nào đó, vì vậy xác suất bắt cặp một đoạnnucleotide trong genome có 10 gốc bổ trợ sẽ vào khoảng 1/410  1/1010 =1/1.000.000 Có nghĩa cứ khoảng 1 triệu gốc nucleotide sẽ có 1 vị trí gồm 10gốc bổ trợ cho 10 gốc của mồi RAPD với trình tự xác định nào đó Do kỹthuật này chỉ sử dụng một loại mồi đồng nhất cho cả hai đầu của đoạn ADNcần nhân bản, ngoài ra 2 đoạn mồi này phải đ ợc kết cặp trên hai sợi đơnường gồm khoảng 10 nucleotide được sắp xếpkhác nhau của chuỗi ADN và phải đi theo chiều hớng vào nhau, nên xácsuất trên phải nhỏ đi nhiều Trên thực tế xác suất bắt cặp của các mồi cònnhỏ hơn nhiều lần nữa, bởi trong điều kiện PCR thông th ờng chỉ tổng hợpường gồm khoảng 10 nucleotide được sắp xếpđ ợc một đoạn ADN không dài quá năm nghìn nucleotide Đối với ADNường gồm khoảng 10 nucleotide được sắp xếpthực vật, các mồi RAPD th ờng cho sản phẩm PCR từ một vài băng đến vàiường gồm khoảng 10 nucleotide được sắp xếpchục băng có chiều dài từ 100-5000 nucleotide [3],[16].

Với đặc điểm là ngắn, nên khả năng đoạn mồi tìm ra đợc điểm gắntrên DNA khuôn không quá khó khăn Tuỳ vào từng loại thực vật hay vi sinhvật mà các đoạn mồi ngẫu nhiên đợc thiết kế Theo lý thuyết, số lợng củacác đoạn DNA đợc nhân bản phụ thuộc vào độ dài và vị trí của các đoạnmồi, kích thớc và mức độ phức tạp của cấu trúc DNA geneome Kết quả là

sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện đợc tính đa hình dựa trên cácphân đoạn DNA đợc nhân bản Sự đa hình của sản phẩm RAPD là do kếtquả thay đổi các điểm gắn của mồi (ví dụ: đột biến điểm) hoặc do thay đổinhiễm sắc thể trong các vùng đợc nhân bản (ví dụ: thêm đoạn, mất đoạnhay đảo đoạn) sẽ gây ra sự thay đổi về kích thớc hay ngăn cản sự nhân bảnDNA Sản phẩm khuyếch đại đợc phân tách bằng điện di trên gel agarosehoặc polyacrylamide và có thể quan sát đợc sau khi gel đợc nhuộm bằnghoá chất đặc trng Tính đa hình đợc nhận ra do sự có mặt hoặc vắng mặtcủa một sản phẩm nhân bản

2.3.1.2

2.3.1.3 u nhợc điểm của phơng pháp RAPD

Kỹ thuật RAPD cho phép đánh giá toàn bộ hệ gen của sinh vật, đemlại tính đa hình cao, trong lập bản đồ thì chỉ thị RAPD chủ yếu là chỉ thị trội.Phơng pháp tiến hành đơn giản, ít tốn kém u điểm nữa của kỹ thuật này lànhanh, rẻ và cho phép tiến hành với số lợng mẫu lớn Kỹ thuật RADP khôngyêu cầu mẫu dò ADN, không cần biết thông tin về trình tự đoạn ADN cầnnghiên cứu, quy trình tiến hành nhanh, chỉ cần một lợng nhỏ ADN khuôn vàcó thể thực hiện tự động [33] Với một bộ mồi ta có thể sử dụng đợc với cácloài khác nhau trong khi các mẫu dò RFLP chỉ có thể dùng đợc cho các loàicó quan hệ gần gũi Tính đa dạng thu đợc từ các chỉ thị RAPD đợc đánh giácao hơn so với kỹ thuật RFLP trong trờng hợp thực hiện trên cùng một vậtliệu và cho phép phát hiện đợc tính đa dạng ngay cả trong các đoạn chứacác trật tự nucleotide lặp lại [21], [33]

Bên cạnh đó, RAPD còn là một kỹ thuật lấy dấu ADN có độ nhạy cao,có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, lập bản đồ di truyền, lập bản đồgen liên kết và phân tích con lai F1 Bằng phơng pháp này có thể xác địnhđợc ngay các gen liên kết của quần thể F1 mà không cần chờ các tính trạngcủa thế hệ F1 biểu hiện khi trồng và thu hoạch Tuy nhiên, RAPD cũng cónhững nhợc điểm do mồi không đặc hiệu nên có rất nhiều băng khó phântích, dẫn đến khi phân tích kết quả rất dễ sai lầm do cách đánh giá chủ quancủa từng ngời Nhng vì nó dễ tiến hành nên phơng pháp này hiện nay đợcứng dụng khá phổ biến ở những nớc có điều kiện nh nớc ta Hiện nay, ph-ơng pháp RAPD đợc ứng dụng trong nớc ta trong nhiều lĩnh vực: nh đánhgiá tính đa hình ở lúa, đậu tơng, lạc, chè, cà phê, bông, vải…). định vị genkháng rầy nâu ở lúa [4], [7],[9].

2.3.1.4 ứng dụng

Kỹ thuật RAPD có khả năng phát hiện đợc những thay đổi nhỏ tronghệ gen của các cá thể thân thuộc hơn hẳn so với kỹ thuật Isozym, kỹ thuậtRFLP (Foolad et al, 1993) khi nghiên cứu về các dòng khoai tây đợc nuôi

cấy thấy rằng: 63% trong tổng số 313 mồi phát hiện thấy đoạn ADN đa hìnhnhờ phơng pháp RAPD trong khi RFLP là 16% và Isozym là 0% Do sự pháthiện tính đa hình dễ dàng nên kỹ thuật này đợc sử dụng cho việc nghiên cứutính thuần của giống.

Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây cho thấy kỹ thuật RAPD là một ơng pháp rất hiệu quả trong việc phân tích quần thể và nguồn gốc loài,nghiên cứu di truyền loài, lập bản đồ di truyền Kỹ thuật RAPD cũng đợc sửdụng để nhận biết và phân loại các giống cây khác nhau, sự đa hình ditruyền trong các kiểu gen lúa nớc và lúa nơng, sự đa hình di truyền giữa lúaIndica và Japonica, xác định sự đa hình của các cây tái sinh có nguồn gốctừ mô sẹo, tế bào huyền phù và tế bào trần

ph-Kỹ thuật RAPD đợc sử dụng để phân tích và xác định mối quan hệthân thuộc giữa các loài hay giữa các cá thể để phục vụ cho công tác lai tạohoặc phân loại Chúng cũng đợc sử dụng nh những chỉ thị phân tử để xácđịnh những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ởcây trồng, nh tính trạng chất lợng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virut ở càchua [6], [20].

Hiện nay, kỹ thuật RAPD đợc sử dụng trong nhận biết, phân loại vàphân tích đa hình di truyền của các loài khác nhau nh phân tích sự đa dạngADN giữa các giống mía [35], xác định và phân loại các kiểu di truyền củacác giống đậu Hà Lan [60], phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài

Orobanche [58], phân tích các biến đổi di truyền trong loài cỏ ba lá trắng ở

Bắc Mỹ [34].

Hai nhà khoa học Yang và Quiros đã sử dụng 28 đoạn mồi có trình tự10 nucleotide để nghiên cứu sự khác biệt của 28 giống cần tây và đợc chialàm ba nhóm Kết quả thu đợc càng đợc khẳng định khi sử dụng 6 chỉ thịprotein để phân loại các giống cần tây trên [70] Tơng tự, nhiều tác giả đã sửdụng RAPD để lập cây chủng loại phát sinh của ngô, lúa gạo, lúa mì [9],[61].

Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất hiệu quả trong việc tìm ra cácchỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau Sun và cộngsự (2003) đã sử dụng 160 mồi RAPD để phân tích tính đa hình ADN của 35

giống lúa mì xuân kháng bệnh FHB (Fusarium head blight) và phát hiện ra 3

chỉ thị RAPD liên quan đến tính kháng bệnh FHB [65].

Orozco và cộng sự (1994) đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sátmối quan hệ di truyền và tiến hoá của các giống cà phê đợc lai tạo từ cácloài bố, mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp laivới mục đích tạo con lai có đặc điểm quý Bùi Mạnh Hùng cùng cộng sự(2000) cũng cho biết khi sử dụng kỹ thuật RAPD đã phân biệt đợc hai giốngđậu Vetch và Lentil cùng giống nhau về hình thái (trọng lợng 1000 hạt, màu

sắc, kích thớc ) Điều này có một ý nghĩa lớn trong việc xác định độ thuầndi truyền cũng nh mức độ lẫn tạp cơ giới của các loại giống cây trồng [1],[52]

Lansium domesticum Corr (Bòn bon) là loài cây ăn quả đợc trồng

phổ biến ở Malaysia Các giống đợc trồng tại đây là giống Dokung, Duku,Langsat…)., chúng khác nhau ở một số đặc điểm hình thái học, sinh học hayvùng phân bố Ngoài ra, cũng có những giống khác nhau do chúng là dạngcon lai hoặc do sự đặt tên khác nhau của ngời dân địa phơng Sự phức tạpnày đã gây ra hiện tợng mất tên hoặc sai tên của một số loài Để giải quyếtvấn đề này, Song và cộng sự (2000) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để phântích mối quan hệ di truyền giữa chúng Công trình này đã làm sáng tỏ mối

quan hệ di truyền và cung cấp những kiến thức sâu hơn để tìm ra các loài L.domesticum khác nhau [62].

2.3.2 Phơng pháp phân tích SSR (Simple Sequence Repeats)

2.3.2.1 Nguyên lý

SSR hay còn gọi là microsatellites, nó thờng là những đoạn ADNngắn có trình tự lặp lại của hai đến sáu nucleotide nh CACACACA, vàchúng có khuynh hớng chiếm các vùng ADN không mang mã (vùng dịnhiễm sắc nh: tâm động hoặc đầu mút của nhiễm sắc thể), một vài đơn vịSSR (nh CA) có thể đợc lặp lại bốn lần, một số đơn vị khác lại đợc lặp lại từhai đến ba mơi lần.

Phơng thức lặp lại cũng rất đa dạng và có thể chia làm 3 loại: - Lặp lại hoàn toàn , các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau

- Lặp lại không hoàn toàn, xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là 1 hoặc 1 sốnucleotide.

- Lặp lại phức tạp, có sự xen kẽ vào các đơn vị lặp lại nhiều nucleotidekhác nhau.

Vùng microsatellites thờng là những vùng siêu biến, nó không chỉkhác nhau giữa các loài mà còn giữa các cá thể có quan hệ gần gũi Đóchính là cơ sở tạo ra tính đa hình của phơng pháp SSR Tính đa hình SSRthờng biểu lộ tính đồng trội

Cách thông thờng nhất để dò microsatellites là thiết kế các mồi PCRnó nằm duy nhất trong một locus trên genome, do vậy một cặp mồi PCR cóthể đặc trng cho từng cá thể trong loài, việc tạo ra các sản phẩm PCR cókích thớc khác nhau đó cũng chính là các microsatellites có kích thớc khácnhau [2], [8].

2.3.2.2 Phơng pháp

Phơng pháp SSR dựa trên nguyên tắc PCR với mồi đặc hiệu khoảng20 nucleotide, với nhiệt độ bắt mồi 550C - 65oC, cho sản phẩm đặc hiệu cókích thớc 100-400 bp, Sản phẩm đợc điện di trên gel polyacrylamide 6% -8%.

2.3.2.3 u nhợc điểm

Hầu hết các locus SSR ở thực vật có sự đa hình cao hơn các chỉ thịkhác Trong phân tích SSR không dùng phóng xạ hoặc bất kỳ một bớcnghiên cứu phức tạp nào khác mà cho kết quả nhanh, tin cậy hơn RAPDRFLP…). Chỉ thị SSR là các locus đặc trng, đa alen và cung cấp nhiều thôngtin nên chúng hết sức có ích cho việc phát hiện sự thay đổi trình tựnucleotide đặc trng cho một loài Vì thế SSR đợc xem nh là Finger printing“small” và “Gudiyaham Bunch” Nh

Hạn chế của kỹ thuật SSR là phơng pháp này đòi hỏi phải thiết kế mồiđặc trng cho mỗi loài nên chi phí rất cao Để xây dựng các cặp mồi đặc hiệucần tách dòng và đọc trình tự một số lợng lớn các đoạn ADN hệ gen chứaSSR [20], [36].

Số lợng các mồi cha đợc phát triển ở nhiều loài cây và lý do nàykhiến cho hiệu quả của SSR trong lập bản đồ di truyền bị hạn chế Tuynhiên, dựa vào ngân hàng gen đã có hiện nay có thể khai thác để sàng lọctính đa hình trong nghiên cứu của một số loại cây trồng, chẳng hạn các chỉthị SSR thiết kế trên đối tợng cây lúa có thể dùng cho nghiên cứu ở ngô,mía, mì mạch…). Tuy nhiên cho đến nay việc sử dụng các mồi đã đợc thiết kếcho các đối tợng cây trồng khác hầu nh không chỉ ra tính đa hình nào đối vớicây lạc

2.3.2.4 ứng dụng

Giá trị SSR là sinh ra tính đa hình từ rất nhiều vùng tơng ứng, bao phủrộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR.Những chuỗi đa hình đơn giản này đã đợc ứng dụng trong việc lập bản đồcả ở hai đối tợng động vật và thực vật, ở ngời microsetellite đợc gọi là thế hệthứ hai của các chỉ thị phân tử, ở thực vật tần số và số lợng microsetellite đãđợc xác định trên các cây nhiệt đới nh: bắp cải, đậu tơng, lúa mì và 34 giốngcây trồng khác Những kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra rằng ở thực vật sựlặp lại (AT)n nhiều hơn ở động vật Trong khi ở những loài động vật thì lạigiàu microsetellite (GT)n Những nghiên cứu trên lúa (Wu and tanksley,1993), Ngô (Senio and Heun, 1993) và Arabidopsis (Bell and Ecker, 1994)cũng cho kết quả tơng tự Tuy nhiên, chỉ thị này cũng có nhợc điểm cơ bảnnh quá trình thiết kế mồi rất tốn kém SSR thờng đợc dùng để lập bản đồnhững vùng khó tính (vùng dị nhiễm sắc)

Có khá nhiều nghiên cứu đa dạng phân tử ở lạc từ thập kỉ năm 70 ng đến nay cũng chỉ có vài công trình là chỉ ra mức độ đa hình (nhng tính đahình rất thấp) ở lạc khi sử dụng chỉ thị RFLP, AFLP, RAPD Vì thế một vàinăm trở lại đây việc thiết kế các mồi SSR chuyên dụng cho lạc đã đợc mộtsố Viện nghiên cứu trên thế giới thực hiện Hiện nay, có khoảng vài trăm chỉthị SSR đã đợc công bố là có tính đa hình cao ở lạc nuôi trồng Kết quả chỉra rằng trình tự lặp lại GA/CA đợc phân tán thờng xuyên trong lạc [36] Theonghiên cứu của He G và cs (2003) trong số 56 cặp mồi đợc thiết lập trên cơsở của cây lạc thì chỉ có 19 cặp mồi chỉ ra tính đa hình khi phân tích với 15giống lạc Trung bình có 4,25 alen trên một locus và đặc biệt có trên 14 alenđã đợc tìm thấy trong một locus Điều này chỉ ra rằng chỉ thị SSR cho độ đahình cao hơn các chỉ thị khác ở lạc

nh-ở Việt Nam, kỹ thuật SSR đã đợc ứng dụng rộng rãi để nghiên cứutính thuần của lúa, đánh giá quỹ gen của cây lúa, lập bản đồ phân tử cácđặc điểm rễ ở lúa cạn, xác định chỉ thị phân tử bệnh rỉ sắt ở lạc

3.1 Nguyên liệu nghiên cứu

3.1.1 Nguyên liệu thực vật

Vật liệu thực vật đợc sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm:

o 32 giống lạc và 14 giống vừng đang đợc trồng rộng rãi khắp cả nớc,đợc cung cấp bởi viện Viện Cây có dầu Miền Nam Danh sách cácgiống lạc và vừng nghiên cứu đợc trình bày ở phụ lục 1 và 2.

o Viết cụ thẻ số lợng Một số dòng lạc, vừng đột biến đợc trình bày ởphụ lục 3 và 4.

3.1.2 Thiết bị và hóa chất

Công trình nghiên cứu đợc thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bàothực vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học.

Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là của các hãng sảnxuất chuyên dụng cung cấp nh: Máy ly tâm (Beckman), máy PCR System9700 (Pharmacia), máy điện di (Biorad), máy đo quang phổ Diode ArraySpectrophotometer của hãng Hewlett - Packard, máy chụp ảnh gel - Doc(Pharmacia), máy ổn nhiệt, máy soi UV, lò vi sóng, các hóa chất tách chiết

ADN, hóa chất PCR, mồi

3.2 Phơng pháp nghiên cứu

3.2.1 Tách chiết ADN từ lá

Tạo cây con

Các hạt lạc/vừng đợc gieo vào các cốc đựng cát và đợc đặt trongkhay Hàng ngày tới nớc vào khay để nớc thấm từ dới lên trên, điều này tạocho cây luôn có độ ẩm và đủ ôxy cho hô hấp Cây con trồng đợc 1-2 tuần thìthu lấy lá.

Thu và bảo quản lá

Thu mẫu lá khi còn non, cho vào ống eppendorf 2 ml, nhanh chóngcho vào nitơ lỏng Chúng đợc dùng ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh ởnhiệt độ - 840C cho đến khi sử dụng.

Hoá chất sử dụng:

- Ethanol 80%.

- Chloroform : isoamyl (24:1) - Nitơ lỏng.

Quy trình tách chiết:

B1: Cân 200 mg mẫu lá non cho vào ống eppendorf 2 ml.

B2: Cho nitơ lỏng vào ống eppendorf có chứa mẫu lá Nghiền bằngđũa thủy tinh có đầu nhọn vừa với ống eppendorf thành dạng bột mịn.

B3: Bổ sung 800 μl đệm tách ADN, đảo nhẹ để tạo thành hỗn hợpđồng nhất, ủ trong 60 phút ở 650C.

B4: Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

B5: Bổ sung 800 μl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl (24:1), đảo đều.B6: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút để phân tách thành 2 pha,hút cẩn thận dịch nổi cho vào ống eppendorf mới.

B7: Tủa dịch nổi bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1), đảo nhẹ.

B8: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút loại bỏ dịch nổi (hoặc vớtkết tủa ADN).

B9: Rửa ADN hai lần bằng ethanol 80%.

B10: Làm khô ADN bằng máy Speed - Vac hay ở nhiệt độ phòng.B11: Hoà tan ADN trong 300 μl TE 1X.

B12: Bổ sung 1 μl RNase (10 mg/ml), ủ ở 370C trong 30 phút.B13: Thêm 10 μl Sodium acetate 3M đảo nhẹ.

B14: Bổ sung 2,5 thể tích ethanol tuyệt đối, đảo nhẹ để ở - 200C ít nhất1 giờ.

B15: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi.B16: Rửa ADN hai lần bằng ethanol 80%.

B17: Hoà tan ADN trong 300 àl TE 1X, giữ ở -200C đến khi sử dụng.

3.2.2 Xác định hàm lợng và độ tinh sạch của ADN

3.2.2.1 Phơng pháp đo quang phổ

Việc xác định hàm lợng và độ tinh sạch của ADN có thể đợc thực hiệnbằng cách đo độ hấp thụ tia UV ở các bớc sóng 230, 260, 280 nm trên máyđo quang phổ Khi đó ADN có đỉnh hấp thụ cực đại ở bớc sóng 260 nm Từgiá trị OD260 ta sẽ tính đợc hàm lợng của ADN thu đợc (chẳng hạn số đotrên máy là 1,0 thì hàm lợng ADN sẽ vào khoảng 50 mg/1 ml mẫu) Độ tinhsạch của ADN có thể đợc xác định bằng tỷ số OD260/OD280 và OD260/OD230 Các tỷ số này lần lợt chỉ ra sự có mặt của các tạp chất là protein,các hợp chất polyphenol và carbonhydrate Một mẫu ADN đợc coi là tinhsạch nếu tỷ số OD260/OD280 và OD260/OD230 đạt 1,8 - 2.

Các bớc đo đợc tiến hành nh sau:

- Chỉnh cân bằng máy (Blank): dùng nớc cất 2 lần khử ion, vô trùng đểlàm chuẩn.

- Kiểm tra máy: đo một mẫu ADN có nồng độ chuẩn đã biết trớc (ADNcủa thực khuẩn thể ).

3.2.2.2 Phơng pháp điện di trên gen agarose

Ngoài phơng pháp kiểm tra và xác định hàm lợng ADN trên máyquang phổ kế, ta có thể xác định chất lợng ADN mẫu tách đợc bằng phơngpháp điện di trên gel agarose 0,8% Để xác định hàm lợng ADN, khi điện dimẫu ADN ta cho thêm một giếng đối chứng là ADN lam đa với nồng độ xácđịnh trớc.

- Hóa chất: + Agarose

+ Dung dịch TAE 1X (Tris bazơ 48,8 g/l : axit axetic 10,2 ml/l :EDTA 0,5M 20 ml/l pH 8,0)

+ Ethidium Bromide (EtBr) 0.5 μg/ml + Đệm tra mẫu (Buffers Dye 10X)

- Chuẩn bị gel: Cân 0,8 g agarose hòa tan trong 100 ml dung dịchTAE 1X Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn Để nguội đến 500

- 600C, đổ dung dịch vào khuôn gel điện di đã cài sẵn răng lợc Sau 30 - 60phút, khi gel agarose đã đông cứng, gỡ khay gel cài vào bể điện di Đổ đệmTAE 1X ngập bản gel agarose khoảng 2 mm, tháo lợc ra khỏi bản gel.

- Tra mẫu: Trộn mẫu theo tỷ lệ (1 μl ADN/1 μl đệm tra mẫu 10X: 7 μlH2O) và tra vào giếng.

- Điện di: Hiệu điện thế dùng để điện di từ 80 - 100 V ADN chuyển từcực âm sang cực dơng Quan sát sự di chuyển bằng mầu của bromophenolđể biết lúc nào ngừng điện di.

- Nhuộm ADN: Nhuộm ADN bằng Ethidium Bromide Bản gel đợc lấyra khỏi khay điện di và đa vào dung dịch EtBr 0,5μg/ml trong thời giankhoảng 15 phút trên máy lắc nhẹ.

- Soi ADN: Soi trên máy UV và chụp ảnh bằng máy Gen - Doc.

3.2.3 Phơng pháp phân tích tính đa hình ADN

3.2.3.1 Phơng pháp PCR-RAPD

Đoạn mồi ngẫu nhiên

Chúng tôi sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên dài 19 nucleotid, dophòng Công nghệ tế bào thực vật cung cấp Ký hiệu và trình tự của cácđoạn mồi này đợc trình bày trong phụ lục 5.

Phản ứng PCR- RAPD

Phản ứng PCR đợc thực hiện trên máy PCR System 9700 với thể tích20 μl (trong ống eppendorf dung tích 500 μl) trong đó chứa các thành phầnvà nồng độ của các chất tham gia phản ứng đợc trình bày trong bảng 3.

Bảng 3: Thành phần và nồng độ của các chất tham gia phản ứng PCR

Tất cả các chất trên đợc lấy theo thứ tự từ trên xuống và trộn đều (cácthao tác đợc tiến hành trong hộp xốp đựng đá để đảm bảo các hoá chất còngiữ nguyên hoạt tính).

Dùng pipet chia đều hỗn hợp ra các ống phản ứng có sẵn 2 μl ADNcủa từng mẫu nghiên cứu Các ống đợc trộn đều 1 - 2 giây sau đó li tâm nhẹtrong 5 giây.

Chu kỳ nhiệt: B1 : 94oC trong 4 phút B2 : 92oC trong 1 phút B3 : 37oC trong 1 phút B4 : 72oC trong 1 phút

B5 : trở về bớc hai 45 chu kỳ B6 : 72oC trong 7 phút

B7 : lu giữ ở 4oC

Điện di sản phẩm RAPD

Pha agarose 2% trong TAE 1X, đun nóng, để nguội khoảng 600C thìđổ vào khay gel có cài lợc sau 30 phút, cho đệm chạy TAE 1X ngập bản,tháo lợc ra Lấy 2,5 μl đệm tra mẫu (Dye 10X) cho vào mỗi ống sản phẩm,trộn đều Dùng pipet cho hỗn hợp vào giếng và chạy điện di ở điện thế 100Vtrong thời gian 150 phút Nhuộm gel bằng EtBr 0,5 μg/ml trong 15 phút, rửasạch bằng nớc, soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.

3.2.4 Phơng pháp PCR-SSR

Các cặp mồi SSR:

Mời lăm cặp mồi SSR đã đợc cung cấp từ Viện Nghiên cứu cây trồngmàu Quốc tế cho vùng nhiệt đới bán khô hạn (ICRISAT) Trình tự mỗi mồiđơn dài từ 19 đến 25 nucleotide Nhiệt độ gắn mồi và trình tự lặp lại của cácnucleotide nh trong phụ lục 6 Trình tự các cặp mồi nh trong công bố củaFerguson (2004).

- Chu trình nhiệt

B1 : 94oC trong 4 phút B2 : 92oC trong 45 giây B3 : 55-64oC trong 1 phút B4 : 72oC trong 1 phút B6 : trở về bớc hai 34 chu kỳ B5 : 72oC trong 10 phút B6 : lu giữ ở 4oC

- Chuẩn bị gel polyacrylamide 6%: 45ml nớc; 15ml TBE 10X; 15mlAcrylamide + Bis (29:1) 30% + 450àl APS 10% + 100àl TEMED

- Rót dung dịch polyacrylamide 6% vào xilanh, bơm vào khoảng giữahai tấm kính sao cho dung dịch chảy đều và không có bọt khí Cài lợc vàovà để bản gel trong1 giờ, cho đông hoàn toàn Sau đó cho vào máy điện di

- Chuẩn bị dung dịch để tra vào bản gel: Thêm 5 àl dye 3X vào 10 àlsản phẩm PCR, trộn đều, sau đố tra vào mỗi giếng 4 àl mẫu

(Chú ý: Trớc khi tra mẫu và ADN marker vào gel, cho chạy điện di ở1000V trong 15 phút)

- Chạy điện di: 600 V trong thời gian 3 giờ - Hiện hình

+ Sau khi điện di tách 2 tấm kính ra+ Đặt bản gel vào nớc rửa 3 phút

+ Nhuộm gel 20 phút trong dung dịch CTAB 0,1% (1g CTAB+1l H2O)

+ Nhuộm gel 15 phút trong dung dịch ammoniac 0,3% (13 mlammoniac+ 1l H2O)

+ Nhuộm gel 15 phút trong bạc (1g bạc + 4ml NaOH 1M +3,5ml ammoniac)

+ Rửa bản gel trong nớc 10 giây

+ Nhuộm bản gel trong dung dịch hiện hình (15g Na2CO3+200àl formaldehit) cho đến khi xuất hiện băng

+ Rửa bản gel trong nớc 10 giây

+ Cố định bản gel trong glycerol trong 15 phút+ Để khô ngoài không khí

3.2.5 Phân tích số liệu

Dựa trên ảnh điện di sản phẩm PCR các mẫu nghiên cứu với các mồiriêng, ta có đợc dữ liệu về sự xuất hiện của các băng điện di Nhập số liệuvào máy tính và xử lý số liệu bằng phần mềm NTSYSpc Version 2.0 để tạocác biểu đồ hình cây thể hiện mối tơng quan di truyền giữa các dòng, giốngnghiên cứu.

Tiêu chuẩn hoá sản phẩm RAPD/SSR theo quy ớc: Số 1 - xuất hiệnphân đoạn ADN Số 0 - không xuất hiện phân đoạn ADN.

Tất cả những băng ADN xuất hiện mờ, không rõ ràng bị bỏ qua Đốivới phơng pháp RAPD, ta tính các băng ADN từ đầu bảng đến cuối bảngđiện di Còn đối với phơng pháp SSR ta xác định băng ADN trong khoảnggiao động xác định 100bp - 400bp.

Phơng pháp nhóm khối hệ số tơng đồng đợc kiểm tra bằng việc thựchiện quá trình SIMQUAL, SAHN, và TREE từ chơng trình NTSYSpc version2.0 (Applied Biostatistics, Setauket, New York, USA) Quyền lựa chọn "TM"đợc đặt ra để "FIND" nhận ra tất cả các cây có thể Các phơng pháp nhómkhối UPGMA, WPGMA, Complete-link, and Single-link đợc ứng dụng ở tấtcả sự kết hợp có thể với hệ số tơng quan Dice, Jaccard, and Simple tơngxứng Phơng pháp nhóm khối hệ số tơng đồng đợc mô tả bởi Rohlf (1993).Hệ số tơng quan Cophenetic (Cophenetic correlation coefficients) (r) đợctính toán và so sánh đối với mỗi sự kết hợp đợc thực hiện theo quá trình

COPH và MXCOMP từ NTSYSpc 2.0 Những hệ số này chỉ ra mối quan hệgiữa một ma trận tơng đồng và cây phân loại theo kiểu hình là kết quả củaviệc phân tích khối cluster, và mức độ phù hợp nhất của việc phân tích khốiđối với ma trận tơng đồng [51], [49]

Hàm lợng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content =PIC) của mỗi mồi xác định theo công thức PIC = 1 - ∑Pij2, trong đó Pij là tầnsố allen thứ j của kiểu gen i đợc kiểm tra Phạm vi giá trị PIC từ 0 (không đahình) tới 1 (đa hình hoàn toàn) [26], [49],[57].

Để khẳng định kết quả phân nhóm theo sơ đồ hình cây, chúng tôibiểu diễn kết quả theo phơng pháp so sánh đa chiều (MDS =Multidimensional Scaling, Kruskal & Wish, 1978) và biểu đồ phân tíchtheo toạ độ chính (PCA = Principal Co-ordinate Analysis, Hauser &Crovello, 1982) [19], [72].

4.1 kết quả Tách ADN tổng số

4.1.1 Cải tiến quy trình tách ADN tổng số (Phải nêu rõ cải tiến ởchỗ nào?? Và theo cô thì phân fnày không cân fthiết chovào LV)

Việc tách chiết axit nucleic thực vật để sử dụng trong phân tích sinhhọc phân tử (PCR, RFLP, AFLP, RAPD, SSR, Southern blot…).) là một trongnhững bớc quan trọng và mất nhiều thời gian Mức độ tinh sạch và hàm lợngcủa ADN thu đợc sẽ ảnh hởng trực tiếp tới sự thành công của các bớc tiếptheo

Mặc dù đã có một số quy trình về tách chiết ADN từ đối tợng thực vậtcủa Dellaporta và cộng sự (1983), Draper và Scott (1988), Rogers vàBendich (1988), nhng vì dịch chiết từ lá lạc/vừng có chứa nhiềupolysaccharide và các hợp chất polyphenol Do đó, việc tách chiết ADN hệgen lạc/vừng tinh sạch và có hàm lợng cao vẫn là một việc rất khó khăn.

Một phơng pháp tách chiết đợc gọi là tối u phải thu đợc ADN tinhsạch, có hàm lợng cao và nguyên vẹn Phơng pháp đó cũng phải nhanh, íttốn kém và nếu có thể phải tránh đợc việc sử dụng các hóa chất độc hại[27], [63].

Bớc đầu tiên trong quy trình tách chiết ADN từ vật liệu thực vật là phávỡ thành tế bào để giải phóng các thành phần nội bào Bớc này phải tiếnhành nhanh để giảm đến mức tối thiểu lợng ADN bị đứt gãy cơ học trongquá trình tách chiết

Có thể dùng enzym, các hóa chất làm tan hoặc các phơng pháp

mẫu trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn Sau đó, phân huỷ màng tế bào đểgiải phóng ADN vào trong đệm chiết Bớc này thờng đợc thực hiện bằngcách sử dụng các chất tẩy nh là sodium dodecyl sulphate (SDS) hoặc cetyltri-methylamonium bromide (CTAB) ADN giải phóng ra phải đợc bảo vệkhỏi nuclease nội bào Do vậy EDTA thờng có mặt trong đệm chiết để tạophức chất với các ion magie (một co-factor không thể thiếu của các enzymnuclease) [22], [25].

Dịch chiết ADN từ thực vật nói chung có chứa một lợng lớn ARN,protein, polysaccharide, tanin và các sắc tố, chúng có thể gây trở ngại choADN đợc chiết và khó tách ra [53], [55] Hầu hết các loại protein sẽ đợc loạibỏ khỏi dịch chiết bằng cách biến tính và kết tủa khỏi dịch chiết bằngchloroform hoặc phenol Còn các ARN thì có thể đợc loại bỏ khi ủ dịch chiếtvới RNAse ở nhiệt độ 37oC Chỉ riêng polysaccharide và các hợp chấtpolyphenol là rất khó loại khỏi dịch chiết [24] Polysaccharide gây ức chế

hoạt tính của một vài enzym (Taq polymerase) [32] và ảnh hởng đến việc

xác định hàm lợng của axit nucleic bằng quang phổ kế Còn polyphenol (ởdạng oxi hoá) có khả năng liên kết đồng hoá trị với ADN cũng gây ảnh hởngđến quá trình nhân bản [48], [56], [68], [73].

Lúc đầu, khi sử dụng phơng pháp CTAB của Murray và Thompson(1980) để tách chiết ADN hệ gen của các đối tợng thực vật chúng tôi thu đ-ợc lợng ADN là 335,02 μg/1,0 g lá nguyên liệu Tuy nhiên, chúng vẫn cònlẫn polysacharide và các hợp chất polyphenol nh đợc chỉ ra bởi tỷ số đoquang phổ hấp thụ là OD260/OD280 = 1,52 và OD260/ OD230 = 1,17 Mẫu ADNthu đợc rất nhầy và có màu vàng nhạt Trên ảnh điện di, sản phẩm táchchiết ADN xuất hiện các băng ADN không nét và trên giếng cũng xuất hiệncác vệt sáng.

Sau khi tìm hiểu các tài liệu về tách chiết ADN tổng số, chúng tôi thấyrằng, NaCl ở các nồng độ lớn hơn 0,5M cùng với CTAB có thể loại bỏ đợccác loại polysacharide [32], [50], [54] Khoảng nồng độ NaCl dao động từ0,7M đến 6M [16] và phụ thuộc vào các loài thực vật khác nhau Theo Fangvà cộng sự (1992), NaCl 1M có khả năng loại bỏ polysaccharide khỏi ADNdo nó làm tăng tính tan của polysacharide trong ethanol vì vậy không kết tủacùng với ADN trong ethanol 80% [29], [46].

Riêng đối với các hợp chất polyphenol thì có thể sử dụng pyrolidone (PVP) để loại bỏ Vì PVP sẽ hình thành các liên kết hidro với cáchợp chất polyphenol và có thể đợc loại bỏ bằng cách ly tâm [28], [31], [48]

Polyvinyl-Do vậy, các thí nghiệm tiếp theo đợc tiến hành với nồng độ NaCl trongđệm tách tăng từ 1,5M đến 2M, bổ sung PVP (Mr 10.000) vào đệm tách vàcó sử dụng đệm rửa trớc khi tách chiết Khi đó, độ tinh sạch và chất lợngcủa ADN đã đợc cải thiện, các băng đợc chỉ ra trên điện di đồ sắc nét hơn.

Tuy nhiên, lợng ADN thu đợc lại giảm xuống còn 240,2 μg/1,0 g lá nguyênliệu [64]

Từ các cơ sở đó, tùy theo các đối tợng mẩu thu thập chúng tôi có thểchỉnh các nồng độ các chất trong tách chiết ADN tổng số sao cho phù hợp.Qui trình tách chiết ADN ở (mục 2.2.1) là qui trình đối với lá non đợc trồngtrong phòng thí nghiệm.

4.1.2 Kết quả tách chiết ADN tổng số

Các mẫu ADN đợc đo quang phổ hấp thụ ở dải bớc sóng từ 200 - 800nm Kết quả cho thấy, các mẫu ADN đều có một đỉnh hấp thụ cực đại ở bớcsóng 260 nm Điều này chứng tỏ, ADN tách chiết sạch, không bị lẫn tạp cácchất khác (hình 2).

Bảng 4: Độ sạch và hàm lợng ADN của một số giống lạc/vừng

STT mẫuTên OD260/OD230 OD260/OD280 Hàm lợng ADN

Hình 2: Phổ hấp thụ của ADN tách chiết

Ngoài phơng pháp đo quang phổ hấp thụ, chúng tôi còn sử dụng ơng pháp điện di trên gel agarose 0,8% Kết quả điện di trên (hình 3) chothấy, các mẫu ADN tách chiết từ lá lạc/vừng cho một băng duy nhất, sắcnét, có phân tử lợng cao, ở gần giếng và không có sự đứt gãy của các phântử ADN.

ph-Nh vậy, với quy trình đợc thiết lập trên có thể thu đợc ADN hệ gen củalạc/vừng có hàm lợng và độ tinh sạch đạt tiêu chuẩn để tiến hành phản ứngRAPD.

4.2 đánh giá tính đa hình ADN tập đoàn giống lạc vàvừng

4.2.1 Phân tích tính đa hình ADN lạc bằng phơng pháp SSR

Tập đoàn 32 giống lạc đợc phân tích với 15 cặp mồi SSR, trình tự cáccặp mồi đợc trình bày ở phụ lục 6 Đánh giá tính đa hình của mỗi cặp mồiSSR thông qua giá trị PIC) Giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình của cặp mồiđó càng cao.

Kết quả phân tích điện di sản phẩm SSR của 15 cặp mồi thì 13 cặpmồi SSR cho đa hình (trừ cặp mồi L35 và L45) với giá trị PIC từ 0,252 (L24)đến 0,994 (L36) Trong đó, 10/13 cặp mồi cho độ đa hình cao với giá trị PIC 0,5 (42%) Sở dĩ kết quả nghiên cứu của chúng tôi đối với tập đoàn lạc cótính đa hình cao nh vậy là do các cặp mồi đợc thiết kế trên cơ sở bộ gen củacây lạc Số lợng các phân đoạn ADN đợc nhân bản với mỗi cặp mồi xê dịchtừ 1 đến 31 trong phạm vi quan sát (bảng 6) Kích thớc của các phân đoạnADN nhân bản từ 120 bp đến 360 bp Trong phạm vi quan sát thì 114 phânđoạn ADN đã đợc nhân bản.

Bảng 5: Số phân đoạn ADN nhân bản và giá trị PIC của tập đoàn 33 giốnglạc nghiên cứu

Tên mồi thuyết (bp)Cỡ alen lý Cỡ alen quansát (bp) Giá trị PIC số alen số PĐ đahình số PĐ đơnhình % PĐ đahình

Chú thích: giếng 1: ADN () nồng độ 200 ng; giếng 2-4 là 3 giống lạc nghiên

cứu; 5-7 là 3 giống vừng nghiên cứu

H×nh 4: S¶n phÈm SSR cña måi L37 ®iÖn di trªn gen polyacrylamide 6%

Chó thÝch: M: marker 100pb; giÕng 1-32: thø tù c¸c gièng l¹c nh trong

phô lôc 1

Qua hình 4 và bảng 6 cho thấy mỗi giống có 1-3 phân đoạn ADN củalạc đợc nhân bản trong phạm vi quan sát (265 bp đến 360 bp) Mồi L37 chotính đa hình đối với quần thể lạc nghiên cứu Tại vị trí 285 bp các giếng 19;23;24;30;32 xuất hiện băng ADN, các giống còn lại không xuất hiện Trongkhi đó, giếng số 4 lại không xuất hiện băng ADN trong phạm vi 285 –360pb.

Kết quả phân tích tính đa hình với mồi L37 đã chứng minh rằng cácgiống lạc có sự khác nhau ở mức độ gen.

4.2.1.2 Cặp mồi L36

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Chú thích: M: marker 100pb; giếng 1-32: thứ tự các giống lạc nh trong phụ lục 1

Bảng 7: Phân tích sản phẩm điện di trên gel polyacrylamide 6% của 32giống lạc với cặp mồi L36

Kích thước(pb)

Thứ tự các giống

1 2 3 4 5 6 78 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 322500 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12520 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 12560 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12600 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12640 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 02680 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 32720 0 1 0 1 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 52760 0 0 0 0 0 00 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 22800 0 0 0 0 0 00 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 22840 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 12880 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 32920 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 12961 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13000 1 0 1 0 1 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 33040 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13080 0 0 0 0 0 01 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 53120 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23160 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 33200 0 1 0 1 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 63240 1 0 0 0 1 00 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 43280 0 0 0 0 0 00 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23320 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 13360 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 23401 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13440 1 0 0 0 1 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 33480 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13520 0 0 0 0 0 01 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 43560 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 23600 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 2

Hình 5: Sản phẩm SSR của mồi L36 điện di trên gen acrylamide 6%

3640 0 0 1 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13660 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 3 2 2 2 3 22 2 2 2 2 2 2 2 2 3 0 2 3 2 2 2 2 0 4 3 1 2 2 2 2 66

Kết quả điện di sản phẩm SSR của 32 giống lạc với cặp mồi L36 đãcho thấy mỗi giống có 0-4 phân đoạn ADN của genome lạc đợc nhân bảntrong phạm vi quan sát (250 bp – 366 bp) (hình 5) Đây là cặp mồi cho tínhđa hình rất cao với PIC = 0,994 Cặp mồi này chỉ ra tính đa hình tơng đối rõràng khi so sánh các giống Các giống này hầu hết cho kết quả 2 phân đoạnADN rõ ràng (bảng7) Theo nghiên cứu về mồi SSR thì mồi này cho kết quảdị hợp tử rất cao

Kết quả phân tích tính đa hình với mồi L36 đã chứng minh rằng cácgiống lạc có sự khác nhau ở mức độ gen.

4.2.1.3 Kết quả phân tích ADN tập đoàn lạc bằng phơng pháp SSR

Bảng 8: Tổng hợp phân tích sản phẩm điện di trên gel polyacrylamide 6%của 32 giống lạc với 15 cặp mồi SSR

Kết quả điện di sản phẩm SSR của 32 giống lạc với 15 cặp mồi SSRđã thu đợc tổng số 1261 phân đoạn ADN (bảng 8) Bình quân mỗi giốngxuất hiện 39,4 phân đoạn ADN, trong đó giống VD99-19; VD99-21 và giốngL14 có số phân đoạn ADN đợc nhân bản nhiều nhất (43 phân đoạn) vàgiống VD4 có số phân đoạn ADN đợc nhân bản ít nhất (24 phân đoạn) Nhvậy, việc sử dụng 15 mồi SSR đã cho thấy có sự khác nhau giữa 32 giốnglạc ở mức độ phân tử

Sau đây kết quả phân tích mối quan hệ di truyền thông qua hệ số ơng đồng giữa các giống lạc nghiên cứu.

t-4.2.1.4 Mối quan hệ di truyền giữa các giống lạc dựa trên phân tíchSSR

Viết thẳng trực tiếp vào kết quả, bỏ bớt đại từ nhân xng chúng tôi” và “Gudiyaham Bunch” Nh” và “Gudiyaham Bunch” Nh” và “Gudiyaham Bunch” Nh

Chúng tôi thiết lập mối liên quan giữa các giống ở mức độ phân tử dựa vàosự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn ADN của các giống khiđiện di sản phẩm SSR Số liệu nhận đợc sẽ tính toán và phân tích theo ch-ơng trình NTSYSpc 2.0 (theo quy ớc 1 = xuất hiện; 0 = không xuất hiện)

Để kiểm tra phơng pháp phân nhóm, chúng tôi đã tiến hành xác địnhgiá trị tơng quan kiểu hình theo ba phơng pháp tính hệ số di truyền giốngnhau (phơng pháp của Jaccard; Nei & Li; Sokal) với bốn kiểu phân nhóm(WPGMA, UPGMA, Complete và Cingle) (bảng 9) Biểu đồ hình cây đợcthiết lập dựa trên giá trị tơng quan cao nhất với các giá trị khi r  0.9: tơngquan rất chặt, r = 0.8-0.9: tơng quan chặt, r = 0.7-0.8: tơng quan tơng đốichặt, r  0.7: tơng quan không chặt [36]

Bảng 9: Giá trị tơng quan kiểu hình theo 3 phơng pháp tính hệ số di truyềngiống nhau với 4 kiểu phân nhóm

UPGMA WPGMA Liên kết hoàn toàn Liên kết đơn lẻ