Đánh giá đa dạng di truyền của các giống cây lấy dầu (lạc, vừng) bằng phương pháp phân tích đa hình ADN

Một số phơng pháp chọn tạo giống cây lạc và vừng 1. Xây dựng tập đoàn giống và cảI tiến quần thể

Hiện nay, thông qua các bớc đánh giá, tuyển chọn từ các giống nhập nội chúng ta đã tuyển chọn đợc nhiều giống lạc cho năng suất cao, thích hợp với các điều kiện sinh thái khác nhau. Tuy nhiên, trong chọn tạo giống, đột biến nhân tạo có tần số biến dị có lợi là rất thấp nhng u điểm là thời gian tạo giống nhanh chóng vì phần lớn các biến dị đều di truyền.

Nguồn gốc, Phân loại và phân bố

Giống lạc V79 là giống lạc quốc gia đợc Viện KHNN Việt Nam chọn tạo bằng phơng pháp xử lý đột biến tia gamma Co60 liều lợng 5kr [10].…. Trong sách Vân đài loại“ ngữ , nhà bác học Lê Quý Đôn đã từng tổng kết: phép làm ruộng tốt thì nên” “ trồng đỗ xanh trớc, sau đó đến các loại đậu nhỏ và vừng.

Tình hình sản xuất vừng

Trong những năm qua, với sự ra đời của sinh học phân tử và công nghệ gen, một ngành khoa học mới đã xuất hiện: Phân loại học phân tử (molecular taxonomy), chủ yếu dựa trên các kỹ thuật phân tích ADN. Các kỹ thuật đợc sử dụng trong phân loại phân tử bao gồm: kỹ thuật isozym (đồng enzym), các kỹ thuật phân tích đoạn ADN nh phơng pháp đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), các kỹ thuật trên cơ sở của phản ứng PCR nh ADN tiểu vệ tinh (Simple Sequence Repeats - SSR), đa hình các đoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình chiều dài các đoạn ADN nhân bản (Amplified Fragment Length Polymorphism - AFLP), kỹ thuật điểm chỉ ADN đa locus, lai ADN, phân tích trình tự ADN.

Phơng pháp phân tích RAPD (Random Aplified Polymorphic DNA)

Kỹ thuật RAPD có khả năng phát hiện đợc những thay đổi nhỏ trong hệ gen của các cá thể thân thuộc hơn hẳn so với kỹ thuật Isozym, kỹ thuật RFLP (Foolad et al, 1993) khi nghiên cứu về các dòng khoai tây đợc nuôi cấy thấy rằng: 63% trong tổng số 313 mồi phát hiện thấy đoạn ADN đa hình nhờ ph-. Hiện nay, kỹ thuật RAPD đợc sử dụng trong nhận biết, phân loại và phân tích đa hình di truyền của các loài khác nhau nh phân tích sự đa dạng ADN giữa các giống mía [35], xác định và phân loại các kiểu di truyền của các giống đậu Hà Lan [60], phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài Orobanche [58], phân tích các biến đổi di truyền trong loài cỏ ba lá trắng ở Bắc Mỹ [34].

Phơng pháp phân tích SSR (Simple Sequence Repeats) 1. Nguyên lý

Trong phân tích SSR không dùng phóng xạ hoặc bất kỳ một bớc nghiên cứu phức tạp nào khác mà cho kết quả nhanh, tin cậy hơn RAPD RFLP Chỉ… thị SSR là các locus đặc trng, đa alen và cung cấp nhiều thông tin nên chúng hết sức có ích cho việc phát hiện sự thay đổi trình tự nucleotide đặc trng cho một loài. Tuy nhiên, dựa vào ngân hàng gen đã có hiện nay có thể khai thác để sàng lọc tính đa hình trong nghiên cứu của một số loại cây trồng, chẳng hạn các chỉ thị SSR thiết kế trên đối tợng cây lúa có thể dùng cho nghiên cứu ở ngô, mía, mì mạch….

Nguyên liệu và phơng pháp

Phản ứng PCR đợc thực hiện trên máy PCR System 9700 với thể tích 20 μl (trong ống eppendorf dung tích 500 μl) trong đó chứa các thành phần và nồng độ của các chất tham gia phản ứng đợc trình bày trong bảng 3. - Lau tấm kính ngắn bằng dung dịch sigmacote và để khô trong 5 phút - Lau tấm kính dài bằng dung dịch kết dính (dung dịch kết dính: thêm 4,5 àl Bind silane vào 1 ml dung dịch 95% etanol+ 0,5% axit acetic) và để khô. Phơng pháp nhóm khối hệ số tơng đồng đợc kiểm tra bằng việc thực hiện quá trình SIMQUAL, SAHN, và TREE từ chơng trình NTSYSpc version 2.0 (Applied Biostatistics, Setauket, New York, USA).

Hàm lợng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content = PIC) của mỗi mồi xác định theo công thức PIC = 1 - ∑Pij2, trong đó Pij là tần số allen thứ j của kiểu gen i đợc kiểm tra. Để khẳng định kết quả phân nhóm theo sơ đồ hình cây, chúng tôi biểu diễn kết quả theo phơng pháp so sánh đa chiều (MDS = Multidimensional Scaling, Kruskal & Wish, 1978) và biểu đồ phân tích theo toạ độ chính (PCA = Principal Co-ordinate Analysis, Hauser & Crovello, 1982) [19], [72].

51(YT.TV) ICGV00380

Phân tích tính đa hình ADN vừng bằng phơng pháp RAPD Chúng tôi sử dụng 19 mồi ngẫu nhiên để đánh giá tính đa hình ADN

Từ bảng 13 ta thấy, việc sử dụng các bộ mồi RAPD đối với tập đoàn vừng này cho tính đa hình cha cao nhng cũng đã thể hiện đợc tính đa hình của các giống vừng nghiên cứu. Các số liệu thu đợc sẽ đợc xử lý và phân tích trong chơng trình NTSYSpc 2.0 để tìm ra mối tơng quan giữa các đối tợng nghiên cứu thông qua hệ số tơng đồng di truyền và biểu đồ hình cây. Chúng tôi tiến hành xác định giá trị tơng quan kiểu hình theo 3 phơng pháp tính hệ số di truyền giống nhau (Dice, Jaccard, SM) và 4 kiểu phân nhóm (UPGMA, WPGMA, liên kết hoàn toàn và liên kết đơn lẻ) (bảng 16).

Sau khi phân phân tích số liệu trong chơng trình NTSYS-SIMQUAL, chúng tôi tiến hành xử lý số liệu trong NTSYS-UPGMA để nhóm các giống vừng lại theo mức độ xa gần về mặt di truyền. Dựa trên sơ đồ hình cây và biểu đồ đa chiều biểu hiện tính đa hình ADN giữa các giống vừng nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy tập đoàn các giống vừng này có độ sai khác ở mức độ phân tử.

Xác định mức sai khác của các dòng lạc đột biến bằng ph-

Tổng cộng đối với 11 mồi SSR, chúng tôi đã thu đợc 590 phân đoạn ADN từ các dòng lạc đột biến (bảng 20).Sau khi đánh giá tổng quát các dòng lạc đột biến bằng 11 cặp mồi SSR, chúng tôi tiến hành phân tích cụ thể với hai nhóm dòng đột biến VD2 và L9801. a)Kết quả phân tích nhóm dòng lạc đột biến từ giống lạc VD2. Với chơng trình NTSYS version 2.0 chúng tôi tìm ra mối tơng quan kiểu hình r = 0.90568 chứng tỏ giá trị tơng quan giữa các dòng lạc đột biến từ giống VD2 là rất chặt. Dựa theo giá trị tơng quan kiểu hình, chúng tôi tiến hành xác định hệ số tơng đồng di truyền của cá các dòng lạc đột biến nghiên cứu (bảng 22) từ đó thiết lập hình cây phát sinh chủng loại (hình 14). Hệ số tơng đồng di truyền trung bình giữa các dòng lạc đột biến sử dụng trong nghiên cứu là 77%. Điều này chứng tỏ các dòng lạc đột biến đã có những biến đổi lớn về kiểu gen so với giống gốc. Qua hình 14 và 15 chúng tôi nhận thấy, tất cả các dòng lạc đột biến. đều có sự khác biệt so với giống gốc VD2. Điều này chứng tỏ ở mức chiếu xạ 10 kr các dòng lạc đột biến từ giống VD2. đã có sự biến đổi về mức độ gen. Tuy nhiên, cơ sinh vât luôn có sự tự điều chỉnh, sửa chữa cho nờn cỏc dũng lạc này cần đựợc theo dừi ở cỏc thế hệ tiếp theo. b)Kết quả phân tích nhóm dòng lạc đột biến từ giống L9801.

Cũng nh việc đánh giá các dòng lạc đột biến từ giống VD2, chúng tôi tiến hành xác định mức độ đa hình bằng cách so sánh số phân đoạn đơn hình và đa hình thu đợc từ các mồi. Số liệu đợc xử lý và phân tích trong chơng trình NTSYS version 2.0 để tìm ra mối tơng quan giữa các đối tợng nghiên cứu thông qua hệ số tơng đồng di truyền và biểu đồ hình cây.

Xác định mức sai khác của các dòng vừng đột biến bằng phơng pháp RAPD

Nhìn chung mồi cho nhiều phân đoạn nhất là OPH04 (333 phân. Bảng 26: Tổng hợp phân tích sản phẩm điện di trên gel agarose 2% của 9 dòng vừng với 10 cặp mồi RAPD. Sau khi đánh giá tổng quát các dòng vừng đột biến bằng 10 mồi RAPD, chúng tôi tiến hành phân tích cụ thể với hai nhóm dòng vừng đột biến V6 và V36. c)Kết quả phân tích nhóm dòng vừng đột biến từ giống vừng V6. Dựa theo giá trị tơng quan kiểu hình, chúng tôi tiến hành xác định hệ số tơng đồng di truyền của các dòng vừng đột biến nghiên cứu từ đó thiết lập cây phân biệt. Hệ số tơng đồng di truyền trung bình giữa các dòng vừng đột biến sử dụng trong nghiên cứu là 77% (bảng 28). Bảng 28: Hệ số tơng đồng giữa các dòng vừng đột biến nghiên cứu. Qua hình 19 và 20 chúng tôi nhận thấy, tất cả các dòng vừng đột biến. đều có sự khác biệt so với giống gốc V6. d)Kết quả phân tích nhóm dòng vừng đột biến từ giống V36.

Kết quả thu đợc xử lý và phân tích trong chơng trình NTSYSpc 2.0 để tìm ra mối tơng quan giữa các đối tợng nghiên cứu thông qua hệ số tơng đồng di truyền và biểu đồ hình cây. Dựa theo giá trị tơng quan kiểu hình, chúng tôi tiến hành xác định hệ số tơng đồng di truyền của cá các dòng vừng đột biến nghiên cứu theo phơng pháp Jaccard (bảng 30).