Nghiên cứu xác định giới tính bằng kỹ thuật PCR đa mồi

Bài viết tiến hành nghiên cứu nhằm hoàn thiện quy trình PCR đa mời để khuếch đại các đoạn gên SRY và ZFY; đánh giá giá trị của kỹ thuật này trong việc xác định giới tính.

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI HÀ PHƯƠNG THƯ Viện Khoa học Vật liệu HÀ THỊ MINH THI, NGUYỄN VIẾT NHÂN, Trường Đại học Y Dược Huế TĨM TẮT: Xác định giới tính đóng vai trò quan trọng di truyền y học Để xác định giới tính, ngồi phương pháp lập karyotype, kỹ thuật PCR đa mồi sử dụng rộng rãi nhằm xác định diện gene SRY Đề tài thực nhằm mục tiêu sau: (1) Hồn thiện quy trình PCR đa mồi để khuếch đại đoạn gene SRY ZFY (2) Đánh giá giá trị kỹ thuật việc xác định giới tính Quy trình PCR đa mồi thực với cặp mồi tương ứng gene SRY ZFX/ZFY, gene ZFX/ZFY dùng làm chứng nội Các mẫu DNA dùng thí nghiệm chiết tách từ máu ngoại vi 30 người tình nguyện có cái, gồm 15 nam 15 nữ Chúng rút kết luận sau: - Kỹ thuật PCR đa mồi với việc sử dụng cặp mồi tương ứng với gene SRY ZFX/ZFY khuếch đại đoạn DNA thích hợp - Kỹ thuật PCR đa mồi đủ điều kiện để ứng dụng xác định giới tính dựa việc đánh giá diện gene SRY Summary: STUDY ON THE SEX IDENTIFICATION BY MULTIPLEX PCR TECHNIQUE The sex identification plays an important role in medical genetics For sex identification, apart from method of karyotyping, multiplex PCR technique is often used in order to identify the presence of SRY gene This study is aimed at: (1) Improving of multiplex PCR technique in order to amplify the DNA fragments of SRY and ZFY gene (2) Evaluating of the value of this technique in the sex identification The process of multiplex PCR was carried out by using two primer pairs of SRY and ZFY gene ZFX/ZFY gene was used as an internal control The DNA samples used in this experiment were extracted from peripheral blood of thirty volunteers who have children, including fifteen men and fifteen women Results: - The technique multiplex PCR with the using of two primer pairs of SRY and ZFX/ZFY gene amplified the corresponding DNA fragments - This technique has enough criteria to be used in sex identification based on confirmation the presence of SRY gene Y HỌC THỰC HÀNH (644+645) - Số 2/2009 ĐẶT VẤN ĐỀ Xác định giới tính đóng vai trị quan trọng di truyền y học Trước đây, việc xác định giới tính thực phương pháp di truyền tế bào lập karyotype, cặp nhiễm sắc thể (NST) giới tính nữ XX nam XY Tuy nhiên, thực tế có nhiều trường hợp đảo ngược giới tính (sex reverse), người mang kiểu hình nữ cặp NST giới tính XY, ngược lại người mang kiểu hình nam cặp NST giới tính XX Vì vậy, việc phối hợp thêm phương pháp di truyền phân tử nhằm phân tích gene chịu trách nhiệm hình thành giới tính nam cần thiết Hiện nay, người ta phát nhiều gene liên quan đến việc hình thành giới tính nam, quan trọng gene SRY (sex-determining region of Y gene) phân lập vào năm 1990 Gene SRY mã hoá yếu tố phiên mã có khả gắn với DNA đặc hiệu thúc đẩy hoạt động gene mã hoá yếu tố tham gia hình thành tinh hồn Những người mang NST Y thiếu gen SRY không hình thành tinh hồn mang kiểu hình bên ngồi nữ, ngược lại người mang NST giới tính XX có gene SRY hình thành tinh hồn có kiểu hình bên ngồi nam Để xác định diện gene SRY genome, kỹ thuật phân tử đơn giản, nhanh nhạy PCR sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, dùng cặp mồi nhằm khuếch đại đoạn gene SRY gặp khó khăn phân tích kết người nữ, khơng có sản phẩm PCR khơng phân biệt khơng có gene SRY (người nữ) hay phản ứng PCR khơng hiệu Vì vậy, cần phải thiết kế kỹ thuật PCR đa mồi, ngồi cặp mồi đặc hiệu với gene SRY, phải kết hợp thêm cặp mồi khuếch đại gene khác ln có mặt nam lẫn nữ để làm chứng nội (internal control) Gene lựa chọn làm chứng nội kỹ thuật ZFX/ZFY Đề tài thực nhằm mục tiêu sau: (1) Hồn thiện quy trình PCR đa mồi để khuếch đại đoạn gene SRY ZFX/ZFY (2) Đánh giá giá trị kỹ thuật việc xác định giới tính ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu DNA chiết tách từ bạch cầu máu ngoại vi 30 người tình nguyện có cái, gồm 15 nam 15 nữ Phương pháp nghiên cứu 2.1 Chiết tách DNA từ bạch cầu máu ngoại vi - Lấy 300 µl máu tĩnh mạch ngoại vi chống đông EDTA - Chiết tách DNA theo protocol kit AquaPure genomic DNA (Bio-Rad) - Đo nồng độ DNA chiết tách đánh giá độ tinh máy quang phổ kế điện di gel agarose 0,8% 2.2 Kỹ thuật PCR đa mồi - Mồi: Cặp mồi khuếch đại gene SRY: Mồi xuôi (SRY-F): 5’-GAA TAT TCC CGC TCT CCG GA -3’ Mồi ngược (SRY-R): 5’-GCT GGT GCT CCA TTC TTG AG -3’ Cặp mồi khuếch đại gene ZFX/ZFY: Mồi xuôi (ZFY-F): 5’-ACC ACT GTA CTG ACT GTG ATT ACA C -3’ Mồi ngược (ZFY-R): 5’ -GCA CCT CTT TGG TAT CCG AGA AAG T -3’ - Thành phần phản ứng PCR: Kit PCR: FideliTaq PCR Master Mix 2X (USB Corporation) Nồng độ mồi 0,25 µM Lượng DNA phản ứng 25 µl 200 ng - Điều kiện luân nhiệt: 95oC, 10 phút 30 chu kỳ: 94oC, 30 giây; 57oC, 90 giây; 72oC, 60 giây 72oC, 10 phút Thực máy luân nhiệt Bio-Rad - Phát sản phẩm: Điện di gel agarose 2%, đệm TBE 1X, điện 80 V, kích thước gel cm x 10 cm, thời gian 30 phút Sử dụng thang chuẩn 100 bp Nhuộm ethidium bromide phân tích gel hệ thống GelDoc Bio-Rad KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết hoàn chỉnh kỹ thuật PCR Hình 1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gel agarose Cột 1: Mẫu DNA người nam Có băng với kích thước 495 472 bp Cột 2: Mẫu DNA người nữ Chỉ có băng kích thước 495 bp 495 bp Cột 3: Thang chuẩn 100 bp 472 bp Đánh giá giá trị kỹ thuật PCR đa mồi xác định giới tính Bảng 1: Kết PCR xác định giới tính 30 mẫu DNA người tình nguyện Gene Giới Nam Nữ SRY Số mẫu Tỷ lệ % PCR (+) 15 100% 0% ZFX/ZFY Số mẫu Tỷ lệ % PCR (+) 15 100% 15 100% Nhận xét: Tất mẫu DNA nam giới có sản phẩm PCR tương ứng gene SRY ZFX/ZFY Tất mẫu DNA nữ giới có sản phẩm tương ứng gene ZFX/ZFY khơng có sản phẩm tương ứng gene SRY BÀN LUẬN Hoàn chỉnh kỹ thuật PCR đa mồi Cặp mồi ZFY-F ZFY-R thiết kế để khuếch đại đoạn DNA từ vị trí 1648 đến 2142 gene ZFY (GI: 33239439) NST Y với kích thước sản phẩm 495 bp Trên NST X có gene ZFX (GI: 71061445) với trình tự nucleotide tương đồng với ZFY Cặp mồi ZFY-F ZFY-R khuếch đại đoạn DNA từ vị trí 1625 đến 2119 gene ZFX với kích thước sản phẩm 495 bp Như vậy, tất người dù nam hay nữ có sản phẩm PCR với cặp mồi ZFY-F ZFY-R Do đó, sản phẩm PCR cặp mồi đủ điều kiện để làm chứng nội cho phản ứng PCR đa mồi Cặp mồi SRY-F SRY-R thiết kế để khuếch đại đoạn DNA từ vị trí 479 đến 950 gene SRY (GI: 36604) với kích thước sản phẩm 472 bp Trên hình cho thấy có mẫu DNA nam giới có sản phẩm PCR có kích thước 495 472 bp, cịn mẫu DNA nữ giới có sản phẩm kích thước 495 bp Khơng có sản phẩm PCR khơng đặc hiệu Như kỹ thuật PCR đa mồi sử dụng để xác định giới tính từ mẫu máu Ngồi ra, với DNA từ bệnh phẩm khác chân tóc, nước bọt, dịch thể, nước ối áp dụng kỹ thuật để xác định giới tính Việc xác định giới tính kỹ thuật PCR đa mồi ứng dụng để xác định giới tính trường hợp chưa rõ giới tính lâm sàng phương diện tế bào học Nó cịn ứng dụng sàng lọc trước sinh bệnh di truyền liên kết giới tính bệnh máu khó đơng, teo Duchene Ngồi ra, cịn ứng dụng ngành y học tội phạm giúp xác định giới tính người gây án cách nhanh chóng, kỹ thuật đóng vai trị quan trọng mẫu máu để lại trường Đánh giá giá trị kỹ thuật PCR đa mồi xác định giới tính Chúng tơi sử dụng mẫu DNA 30 người tình nguyện (15 nam 15 nữ) để kiểm chứng kỹ thuật Các người có cái, nghĩa giới tính họ xác định rõ ràng, khơng có bất thường hệ sinh sản Kết bảng cho thấy tất mẫu DNA người nam có sản phẩm PCR tương ứng với cặp mồi sử dụng, mẫu DNA người nữ có sản phẩm PCR tương ứng Y HỌC THỰC HÀNH (644+645) - Số 2/2009 với cặp mồi ZFY mà khơng có sản phẩm với cặp mồi SRY Như vậy, sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi xác định giới tính Đây nghiên cứu bước đầu chúng tơi nhằm hồn chỉnh kỹ thuật trước áp dụng chẩn đoán cho bệnh nhân Trong thời gian tới chúng tơi áp dụng chẩn đốn cho trường hợp bệnh lý chưa xác định giới tính lâm sàng KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu thử nghiệm, rút kết luận sau: Kỹ thuật PCR đa mồi với việc sử dụng cặp mồi tương ứng với gene SRY ZFY khuếch đại đoạn DNA thích hợp từ gene SRY ZFX/ZFY, gene ZFX/ZFY dùng làm chứng nội Kỹ thuật PCR đa mồi đủ điều kiện để ứng Y HỌC THỰC HÀNH (644+645) - Số 2/2009 dụng xác định giới tính dựa việc đánh giá diện gene SRY TÀI LIỆU THAM KHẢO Erdal ME., Barlas IO (2000), “Detection of the SRY gene in a 46,XY phenotypic female by the PCRSSCP method”, Turk J Med Sci, 30: 501-503 Mohammed F., Tayel SM (2005), “Sex identification of normal persons and sex reverse cases from bloodstains using FISH and PCR”, Journal of Clinical Forensic Medicine, 12(3): 122-127 Simoni M., Bakker E., Krausz C (2004), “EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions State of the art 2004”, Internal Journal of Andrology, 27: 240249 Sinclair AH (1998), “Human Sex determination”, The Journal of Experimental Zoology, 281: 501-505 ... bọt, dịch thể, nước ối áp dụng kỹ thuật để xác định giới tính Việc xác định giới tính kỹ thuật PCR đa mồi ứng dụng để xác định giới tính trường hợp chưa rõ giới tính lâm sàng phương diện tế bào... giá trị kỹ thuật PCR đa mồi xác định giới tính Bảng 1: Kết PCR xác định giới tính 30 mẫu DNA người tình nguyện Gene Giới Nam Nữ SRY Số mẫu Tỷ lệ % PCR (+) 15 100% 0% ZFX/ZFY Số mẫu Tỷ lệ % PCR (+)... Đánh giá giá trị kỹ thuật PCR đa mồi xác định giới tính Chúng tơi sử dụng mẫu DNA 30 người tình nguyện (15 nam 15 nữ) để kiểm chứng kỹ thuật Các người có cái, nghĩa giới tính họ xác định rõ ràng,