Xác định giới tính bằng chỉ thị phân tử và vi nhân giống cây Kiwi vàng (Actinidia chinensis)

Bài viết Xác định giới tính bằng chỉ thị phân tử và vi nhân giống cây Kiwi vàng (Actinidia chinensis) được nghiên cứu với mục tiêu là phát triển một phương pháp để chọn lọc hiệu quả giới tính cây Kiwi bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết giới tính.

Khoa học Nông nghiệp / Công nghệ sinh học nơng nghiệp, thủy sản DOI: 10.31276/VJST.64(7).54-59 Xác định giới tính thị phân tử vi nhân giống Kiwi vàng (Actinidia chinensis) Nguyễn Thị Mỹ Hạnh1, 2, 3, Hoàng Thanh Tùng1, Hoàng Đắc Khải1, Đỗ Mạnh Cường1, Nguyễn Thị Như Mai1, Vũ Quốc Luận1, Huỳnh Văn Biết4, Huỳnh Hữu Đức5, Hoàng Thị Như Phương6, Bùi Văn Lệ7, Dương Tấn Nhựt1* Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Học viện KH&CN, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Trường Cao đẳng nghề Đà Lạt Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh Trường Đại học Đà Lạt Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Ngày nhận 25/2/2022; ngày chuyển phản biện 2/3/2022; ngày nhận phản biện 28/3/2022; ngày chấp nhận đăng 31/3/2022 Tóm tắt: Trong nghiên cứu này, thị phân tử liên kết giới tính sử dụng để xác định giới tính mẫu Kiwi Ngoài ra, mẫu xác định giới tính sử dụng làm nguồn mẫu ban đầu cho q trình vi nhân giống thơng qua q trình cảm ứng mô sẹo, tái sinh chồi tăng sinh cụm chồi Kết ghi nhận cho thấy, phương pháp xác định giới tính Kiwi dựa thị phân tử nhiễm sắc thể Y khuếch đại cặp primer SmY1_F/R nhận diện thành công mẫu Kiwi đực loài Kiwi vàng (Actinidia chinensis) Ngoài ra, trình khử trùng bề mặt mẫu cấy tái sinh chồi tối ưu mẫu khử trùng với 200 ppm dung dịch nano bạc, đó, mơi trường ni cấy bổ sung 20% nước dừa cho hiệu tăng sinh cụm chồi tốt Từ khóa: giới tính, Kiwi vàng, nano bạc, tăng sinh chồi Chỉ số phân loại: 4.6 Đặt vấn đề Kiwi vàng loại ăn có giá trị kinh tế cao Quả Kiwi có vị chua thanh, nguồn cung cấp vitamin chất xơ dồi Loài này cũng chứa nhiều kali, vitamin E đặc biệt flavonoid Những chất dinh dưỡng mang đến sức khỏe dẻo dai cho người, chống lại bệnh tim mạch, ung thư đường ruột Kiwi xem loại ăn thành công kỷ XX hóa kỷ [1] Ngồi ra, nghiên cứu phân loại, hệ thống, phân bố địa lý, đa dạng di truyền… thực [2] Nhân giống Kiwi đã cải tiến liên tục phương pháp kỹ thuật nhằm đáp ứng nhu cầu trồng chất lượng cao Hiện nay, Kiwi được trồng từ hạt, ghép in vitro Việc trồng từ gốc ghép có ưu điểm cho suất cao ổn định mặt di truyền [3] Tuy nhiên, loài Actinidia sp tạo thách thức việc nghiên cứu lai tạo, tất loài biết chi đơn tính Cây mang hoa có dạng lưỡng tính tạo hạt phấn trống, đực có hoa đơn tính với nhiều nhị hoa bao quanh nhụy cách thơ sơ, phát triển bị kìm hãm trước kéo dài kiểu dáng bắt đầu phóng nỗn Giới tính xác định nhiễm sắc thể (X)4XX (X)4XY đực [3] * Nhiễm sắc thể Y định giới tính đực cây, không phụ thuộc vào số lượng nhiễm sắc thể X thể bội [4] Các đề xuất trình tự đặc hiệu X Y giả định gen gợi ý rằng, số yếu tố di truyền nhiễm sắc thể thường ảnh hưởng đến việc xác định giới tính [5, 6] Gần đây, gen mã hóa tín hiệu cytokinin Shy Girl (SyGl), nằm nhiễm sắc thể Y phát ngăn chặn phát triển quan hoa cái, dẫn đến phát triển hoa đực [7] Một gen đề xuất thứ hai Friendly Boy (FrBy) nằm nhiễm sắc thể Y, hoạt động độc lập với SyGl biểu Kiwi dẫn đến phát triển đơn tính [7] Ngồi ra, số trình tự SmX, SmY, SmY1 SmY2 sử dụng để xác định giới tính số loài Kiwi, kết ghi nhận cho thấy, SmY1 xác định giới tính đực Kiwi với độ xác lên tới 95% [8] Giai đoạn sinh trưởng Kiwi kéo dài 4-8 năm, việc xác định mang trái giai đoạn đầu trình sinh trưởng quan trọng nhà lai tạo [9] Vì lý này, ngồi thị hình thái sinh hóa, thị phân tử hữu ích để xác định đực giai đoạn phát triển ban đầu Mục tiêu nghiên cứu phát triển phương pháp để chọn lọc hiệu giới tính Kiwi cách sử dụng thị phân tử liên kết giới tính Để đạt mục tiêu này, thử nghiệm thị liên kết giới tính phân tử để Tác giả liên hệ: Email: duongtannhut@gmail.com 64(7) 7.2022 54 Khoa học Nông nghiệp / Công nghệ sinh học nông nghiệp, thủy sản Sex determination by molecular markers and micropropagation of Actinidia chinensis Thi My Hanh Nguyen1, 2, 3, Thanh Tung Hoang1, Dac Khai Hoang1, Manh Cuong Do1, Thi Nhu Mai Nguyen1, Quoc Luan Vu1, Van Biet Huynh4, Huu Duc Huynh5, Thi Nhu Phuong Hoang6, Van Le Bui7, Tan Nhut Duong1* Tay Nguyen Institute for Scientific and Research, VAST Graduate University of Science and Technology, VAST Dalat Vocational Training College Nong Lam University, Ho Chi Minh city Biotechnology Center of Ho Chi Minh city Dalat University University of Science, Vietnam National University, Ho Chi Minh city Received 25 February 2022; accepted 31 March 2022 Abstract: In this study, a molecular sex-linked marker was used to determine the sex of kiwifruit plants In addition, leaf explants with sex determination were used as the original plant material for micropropagation via callus induction, shoot regeneration, and shoot cluster proliferation The results showed that the sex determination method of Kiwi plants based on molecular markers on the Y chromosome amplified by primer pair SmY1_F/R successfully identified male Kiwi explant belonging to Actinidia chinensis In addition, optimal explant surface sterilisation and shoot regeneration were obtained from leaf explants disinfected with 200 ppm silver nanoparticles; meanwhile, the culture medium supplemented with 20% coconut water was suitable for the highest efficiency of shoot cluster proliferation Keywords: Actinidia chinensis, sex, shoot cluster proliferation, silver nanoparticles Classification number: 4.6 xác định giới tính mẫu Kiwi Ngồi ra, sau xác định giới tính đực Kiwi vàng, mẫu sử dụng làm nguồn mẫu ban đầu nhằm tạo nguồn mẫu in vitro thông qua q trình cảm ứng mơ sẹo, tái sinh chồi tăng sinh cụm chồi để làm vật liệu cho nghiên cứu Vật liệu phương pháp nghiên cứu Nguồn mẫu dung dịch nano bạc Các mẫu Kiwi (Actinidia sp.) lấy vị trí cách 10 cm từ ngồi tự nhiên (1 năm tuổi) mẫu thương mại thị trường tỉnh Kon Tum Lâm Đồng Mẫu Kiwi, bao gồm A deliciosa (AD1), A latifolia (AL2), A chinensis (AC3), A chinensis (AC4), A chinensis (AC5), A chinensis (AC6), A chinensis (AC7) A chinensis (AC8) thu nhận định danh tên khoa học thông qua DNA barcode (rbcL, matK, ITS) để phân tích đa dạng di truyền nhận diện loài Kiwi trước sử dụng làm nguồn mẫu để xác định giới tính (bảng 1) Sau xác định giới tính giống Kiwi A chinensis, mẫu sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho nuôi cấy in vitro Dung dịch nano bạc (AgNPs) cung cấp Viện Công nghệ Môi trường, VAST AgNPs có kích thước nhỏ 20 nm tạo phương pháp khử dung dịch nước sử dụng tiền chất AgNO3, tác nhân khử NaBH4 chất ổn định sử dụng chitosan [10] Nồng độ AgNPs 1.000 ppm Dung dịch AgNPs pha với nước cất khử trùng thành nồng độ: 100, 200, 300 500 ppm để khử trùng mẫu Môi trường nuôi cấy Môi trường cảm ứng mẫu cấy tái sinh chồi MS [11] bổ sung 0,5 mg/l BA, 30 g/l sucrose g/l agar [12] Môi trường tăng sinh cụm chồi MS bổ sung 0,01 mg/l TDZ, 30 g/l sucrose g/l agar [13] Môi trường nuôi cấy điều chỉnh pH=5,8 đổ vào bình thủy tinh 250 ml chứa 40 ml mơi trường; sau hấp khử trùng autoclave 121oC, atm thời gian 20 phút Điều kiện ni cấy Mẫu cấy ni cấy phịng ni điều chỉnh điều kiện nhiệt độ 25±2°C, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 45 µmol.m-2.s-1 ánh sáng huỳnh quang độ ẩm trung bình 55-60% Phương pháp nghiên cứu Xác định giới tính Kiwi dựa thị phân tử: - Ly trích DNA tổng số: DNA gen mẫu Kiwi ly trích phương pháp sử dụng CTAB chloroform Mẫu (0,05 g) nghiền dung dịch ly trích (CTAB 20 g/l, NaCl 1,4 mol/l, Tris HCl 0,1 mol/l, Na2EDTA 0,02 mol/l, polyvinylpyrrolidone (PVP) 1%, để 64(7) 7.2022 55 Khoa học Nông nghiệp / Công nghệ sinh học nông nghiệp, thủy sản Bảng Một số đặc tính hình thái mẫu Kiwi sử dụng nghiên cứu Tên mẫu A deliciosa A latifolia A chinensis thương mại A chinensis thương mại A chinensis thương mại A chinensis thương mại A chinensis thương mại A chinensis thương mại Ký hiệu Cấu trúc Đặc điểm Đỉnh Nhọn dài AD1 AL2 AC3 Cuống Màu xanh nhiều lông Dài: 1,5 cm Đường kính: mm Nhọn dài Lá: mỏng, mặt màu xanh sáng mặt xanh xám phủ sợi lông màu trắng Phiến lá: dài 11-13 cm, rộng 11-14 cm Gân lá: thứ cấp, không đối xứng hai bên; bề mặt có lơng Màu đỏ sậm nhiều lơng Dài: 1,5 cm Đường kính: mm Tù, tròn đều, đối xứng Lá: dày, mặt màu xanh đậm mặt màu xanh xám phủ sợi lông màu trắng Phiến lá: dài 11-12 cm, rộng 9-10 cm Gân lá: thứ cấp, không đối xứng hai bên bề mặt nhám khơng có lơng Màu đỏ sậm khơng có lơng Dài: cm Đường kính: 1,5 mm Nhọn trịn dài, đối xứng AC4 Hình dạng Mép Lá: dày, mặt màu xanh đậm mặt màu xanh xám phủ sợi lông màu trắng Phiến lá: dài 10-11 cm, rộng 11-14 cm Gân lá: thứ cấp, không đối xứng hai bên bề mặt nhám khơng có lơng Khơng có Lá: dày, mặt màu xanh đậm mặt màu xanh cưa, có lơng xám phủ sợi lông màu trắng Phiến lá: dài 13-14 cm, rộng 10-12 cm Gân lá: thứ cấp, không đối xứng hai bên bề mặt nhám khơng có lơng Mặt phẳng Hình oval rộng, có dạng hình tim Hình oval rộng, có dạng hình trịn Màu xanh khơng có lơng Hình oval Dài: 2,7 cm rộng, có dạng hình tù Đường kính: 1,5 mm Nhọn trịn, đối xứng Lá: dày, mặt màu xanh đậm mặt có màu xanh xám phủ sợi lông màu trắng Phiến lá: dài 11-13 cm, rộng 11-14 cm Gân lá: thứ cấp không đối xứng hai bên, bề mặt nhám khơng có lơng Màu xanh đậm khơng có lơng Dài: 1,5 cm Đường kính: mm Tù, trịn dài, đối xứng Lá: mỏng, mặt màu xanh sáng mặt màu xanh xám phủ sợi lông màu trắng Phiến lá: dài 11-13 cm, rộng 11-14 cm Gân lá: thứ cấp, không đối xứng hai bên, bề mặt có lơng Màu xanh khơng Hình oval có lơng rộng, có dạng Dài: 1,5 cm hình quạt Đường kính: mm AC7 Nhọn dài Lá: dày, mặt màu xanh sáng mặt có màu xanh xám phủ sợi lông màu trắng Phiến lá: dài 11-13 cm, rộng 11-14 cm Gân lá: thứ cấp, đối xứng hai bên, bề mặt có lơng Có cưa AC8 Lõm tròn đều, đối xứng Lá: dày, mặt màu xanh đậm mặt màu xanh xám phủ sợi lông màu trắng Phiến lá: dài 11-13 cm, rộng 11-14 cm Gân lá: thứ cấp, khơng đối xứng hai bên, bề mặt lơng Khơng có cưa có lơng AC5 AC6 phá vỡ tế bào giải phóng DNA Sau đó, DNA tinh lần cách cho hỗn hợp mẫu/CTAB ủ 65°C 60 phút, ly tâm hỗn hợp mẫu/CTAB 14.000 rpm 10 phút Chuyển dịch sang ống mới, bổ sung µl RNase, ủ 37°C thời gian phút, bổ sung 500 μl hỗn hợp chloroform:isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1), lắc đều, ly tâm tốc độ 14.000 rpm 10 phút Thu dịch (chứa DNA) sang ống (khoảng 450-500 µl), bổ sung ethanol tuyệt đối (tỷ lệ 1:1 so với thể tích thu được) 1/2 thể tích NaCl 5M so với thể tích thu Hỗn hợp ủ đá giờ, ly tâm 13.000 rpm 10 phút Hỗn hợp sau ly tâm loại bỏ dịch thu tủa, bổ sung 500 μl ethanol 70% lạnh đảo ống, ly tâm 13.000 rpm phút (lặp lại lần), loại bỏ dịch nổi, thu tủa Để khô kết tủa nhiệt độ phịng Hịa DNA 64(7) 7.2022 Hình oval rộng, có dạng hình trịn Màu xanh khơng có lơng Dài: cm Đường kính: mm Hình oval rộng, có dạng hình tim Màu xanh khơng có lơng Dài: cm, Đường kính: mm 200 µl nước khử trùng lần DNA sử dụng trực tiếp cho phản ứng PCR - Kiểm tra độ tinh DNA: DNA gen mẫu Kiwi kiểm tra nồng độ độ tinh phương pháp đo mật độ quang bước sóng 260 280 nm máy quang phổ BioDrop™ µLITE (Anh) - Phương pháp PCR: phản ứng PCR thực với cặp primer SmY1_F (5’-TCG CAA TTC GTT AGG GAT GAT GCG-3’) SmY1_R (5’-CAT AAT CAA CCA TCC ATA AAA ACC AT-3’) [14] khếch đại vùng gen nằm nhiễm sắc thể Y có kích thước 770 bp Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 25 µl bao gồm: 12,5 µl MyTaq Mix (Bioline), 0,5 µl primer (nồng độ 10 µM), 9,5 µl nước 56 Khoa học Nông nghiệp / Công nghệ sinh học nông nghiệp, thủy sản khử ion µl DNA gen Chu trình nhiệt phản ứng PCR là: 94°C phút; 35 chu kỳ: 94oC 50 giây, 55oC 55 giây, 72oC 50 giây, 72oC phút - Điện di sản phẩm PCR đọc kết quả: sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện 100 V thời gian 30 phút Gel nhuộm Gelred quan sát kết đèn UV, chụp hình máy chụp gel (GelDoc-It®2315 imager UVP, Mỹ) Tạo nguồn mẫu in vitro: - Khử trùng bề mặt mẫu cấy tái sinh chồi: mẫu thu nhận từ khỏe mạnh ngồi tự nhiên rửa vịi nước chảy 30 phút Sau đó, mẫu ngâm dung dịch Sunlight (Unilever, TP Hồ Chí Minh) 20% 10 phút rửa lại nước máy nhiều lần, sau rửa nước cất vơ trùng trước đưa vào tủ cấy Trong tủ cấy, mẫu rửa với nước cất vô trùng lần, lần phút Tiếp theo, mẫu khử trùng sơ ethanol 70% 30 giây, rửa lại nước cất vơ trùng lần Sau đó, mẫu khử trùng g/l HgCl2, 10 g/l NaOCl AgNPs nồng độ khác (100, 200, 300 500 ppm) có bổ sung vài giọt Tween-80 thời gian phút Cuối cùng, mẫu rửa lại lần nước cất vô trùng trước cắt mẫu cấy vào môi trường nuôi cấy Mẫu sau khử trùng cắt thành hình chữ nhật (0,5×1 cm) có chứa gân cấy lên môi trường cảm ứng mô sẹo Sau tuần nuôi cấy, tỷ lệ mẫu nhiễm (%), hoại tử/chết, mẫu sống cảm ứng mô sẹo (%) ghi nhận Những mẫu cấy tiếp tục theo dõi đến tuần thứ thu nhận số chồi/mẫu, chiều cao chồi (cm), khối lượng tươi (g) khối lượng khô (g) - Tăng sinh cụm chồi: cụm chồi có nguồn gốc từ mẫu cắt thành cụm chồi nhỏ chứa chồi/mẫu; sau đó, cụm chồi cấy lên môi trường tăng sinh cụm chồi bổ sung dịch chiết hữu (nước dừa, chuối xanh khoai tây) với nồng độ khác (5, 10, 15 20%) Sau tuần nuôi cấy, chiều cao chồi (cm), số lá/chồi, khối lượng tươi (g) hình thái chồi ghi nhận Bảng Kết ly trích DNA tổng số Mẫu AD1 AL2 AC3 AC4 AC5 AC6 AC7 AC8 Nồng độ (ng/µl) 99,76 51,57 127,8 38,74 36,38 31,20 53,19 41,44 A260/280 2,046 2,017 1,942 1,962 1,877 1,926 1,956 1,933 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR cho thấy tất mẫu (AD1, AL1, AC3, AC4, AC5 AC6) không cho băng Trong đó, kết khuếch đại thành cơng đoạn gen có kích thước 770 bp nhiễm sắc thể Y giúp nhận diện mẫu đực AC7 AC8 (hình 1) Hình Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR M: marker; -: đối chứng âm mẫu nước cất; +: đối chứng dương đực chứa nhiễm sắc thể Y Nghiên cứu Akagi cs (2019) [7] rằng, nhiễm sắc thể Y ngăn chặn phát triển quan hoa cái, thúc đẩy phát triển hoa đực biểu Kiwi dẫn đến phát triển đơn tính Vì vậy, việc phát nhiễm sắc thể Y nhằm xác định giới tính Kiwi có ý nghĩa quan trọng công tác nhân giống bảo tồn nguồn gen Việc sử dụng cặp mồi SmY1 để xác định giới tính A deliciosa [16, 17] cho kết đáng tin cậy Do đó, kết nghiên cứu lần chứng minh hiệu phương pháp việc xác định giới tính đực Kiwi vàng Ngoài ra, Kiwi cần 4-8 năm trồng ngồi tự nhiên xác định giới tính vấn đề lớn [9] Vì vậy, thị phân tử hữu ích để xác định giới tính giai đoạn phát triển ban đầu Khử trùng bề mặt mẫu cấy tái sinh chồi Xử lý số liệu Thí nghiệm bố trí hồn toàn ngẫu nhiên, với lần lặp lại Mỗi lần lặp lại cấy 15 bình/nghiệm thức với bình chứa mẫu cấy Các số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excel® 2010 SPSS 20.0 với phép thử Duncan mức p