Luận văn : XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TRÊN BA GIỐNG BÒ part 1 potx

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TRÊN BA GIỐNG BÒ NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2001 - 2005 SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN VĂN ÚT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TRÊN BA GIỐNG BÒ Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN NGUYỄN VĂN ÚT BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 3 LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính ghi ơn ba má, hai người suốt đời trăn trở, dốc hết công lao cho con được ngày hôm nay. Em xin ghi khắc ơn sâu của các anh chị, những người luôn dành mọi điều kiện tốt đẹp cho em ăn học nên người. Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: * Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng Quý thầy cô đã tạo điều kiện tốt đẹp cũng như truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường. * Ban giám đốc cùng tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. * Tập thể cán bộ thú y và các cô chú tại lò mổ tập trung huyện Dĩ An - Bình Dương đã giúp đỡ em trong suốt quá trình lấy mẫu. Em xin trân trọng biết ơn cô Trần Thị Dân và Thầy Nguyễn Ngọc Tuân đã hết lòng hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quí báu cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Quách Tuyết Anh và thầy Lê Hữu Ngọc đã chỉ dẫn cho em từng thao tác và hướng đi trong quá trình thực tập. Em xin chân thành cảm ơn: * Chị Oanh, chị Trang, anh Điểm, chị Hưng cùng các anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm đã giúp đỡ, động viên, chỉ dẫn tận tình trong lúc em tiến hành đề tài. * Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học K27 đã chia sẻ những khó khăn vất vả, vui buồn trong quá trình học tập cũng như hết lòng hỗ trợ tôi trong thời gian thực tập. 4 TÓM TẮT KHÓA LUẬN Nguyễn Văn Út, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 9/2005, “XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TRÊN BA GIỐNG BÒ”. Hướng dẫn khoa học : 1. PGS. TS. Trần Thị Dân 2. BSTY. Quách Tuyết Anh Đề tài được tiến hành từ ngày 14-02-2005 đến ngày 06-07-2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Đối tượng được nghiên cứu trong đề tài là ba giống bò ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan. Đây là những giống bò được nuôi phổ biến nhất ở Việt Nam và mang lại nguồn lợi lớn cho ngành chăn nuôi. Do đó chúng tôi sử dụng phương pháp multiplex PCR để xác định giới tính của chúng nhằm ứng dụng phương pháp này trong xác định giới tính của phôi ở các giống bò sau này. Kết quả đạt được như sau: 1. Ly trích được 54 mẫu DNA từ cơ vân và 10 mẫu DNA từ lông đuôi của ba giống bò. Trong đó, DNA từ cơ (tỷ số OD trung bình 1,76) tinh sạch và có hàm lượng cao hơn DNA từ lông (1,49), thấp nhất từ ngọn lông (1,22). 2. Trong hai chu trình nhiệt của phản ứng PCR được thử nghiệm, chu trình nhiệt I cho hiệu quả xác định giới tính kém hơn chu trình nhiệt II (0% so với 100%) khi tiến hành trên giống ta Vàng. Chu trình nhiệt I có thời gian ngắn hơn chu trình nhiệt II 3. Taq polymerase có nguồn gốc từ hãng ABgene và Bio-rad cho hiệu quả xác định giới tính cao hơn Taq có nguồn gốc từ hãng Promega (100% so với 0%) khi thí nghiệm trên giống ta Vàng. 4. Qui trình PCR với chu trình nhiệt I và Taq ABgene 1,5 UI có thể xác định giới tính trên ba giống ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan với tỷ lệ thành công 100%. 5. 11 mẫu DNA cơ làm khô theo mức độ I cho hiệu quả PCR cao hơn 11 mẫu DNA cơ làm khô theo mức độ II (100% so với 20%). 6. Tỷ lệ thành công trong xác định giới tính bằng PCR trên 10 mẫu DNA lông thấp hơn rất nhiều so với tỷ lệ thành công trên 32 mẫu DNA cơ (20% so với 100%). 5 MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa i Trang tựa ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt khóa luận iv Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt vii Danh sách các bảng viii Danh sách các hình và biểu đồ ix PHẦN I. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu và yêu cầu 2 1.2.1 Mục tiêu 2 1.2.2 Yêu cầu 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Khái quát về nguồn mẫu chiết xuất DNA 3 2.1.1 Đặc điểm về ngoại hình các giống bò 3 2.1.2 Đặc điểm về nguồn mô chiết xuất DNA 3 2.1.2.1 Một vài đặc điểm về cơ bò 3 2.1.2.2 Một vài đặc điểm về lông bò 3 2.2 Cơ sở xác định giới tính 4 2.2.1 Lịch sử khám phá cơ chế xác định giới tính tự nhiên ở động vật 4 2.2.2 Sơ lược về NST giới tính 5 2.2.2.1 Các gen trên NST Y 6 2.2.2.2 Các gen trên NST X 8 2.3 Các phương pháp xác định giới tính 9 2.3.1 Kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST 9 2.3.2 Phản ứng miễn dịch đối với kháng nguyên chuyên biệt giới tính 10 2.3.3 Phân tích di truyền tế bào để xác định giới tính 11 2.3.4 Sử dụng đoạn dò DNA chuyên biệt NST Y để phân biệt giới tính phôi 11 2.3.5 Phân biệt giới tính bằng kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) 12 2.3.5.1 Cơ sở phản ứng PCR dùng để phân biệt giới tính 12 2.3.5.2 Một số công trình xác định giới tính bằng PCR 13 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Nội dung nghiên cứu 15 3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành 15 3.3 Vật liệu 15 3.3.1 Nguồn mẫu chiết xuất DNA 15 3.3.2 Đoạn mồi 15 3.4 Phương pháp tiến hành 16 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu 16 3.4.2 Ly trích DNA 16 3.4.2.1 Ly trích DNA từ cơ 16 3.4.2.2 Ly trích DNA từ lông 18 6 3.4.3 Multiplex PCR xác định giới tính 19 3.4.3.1 Xây dựng qui trình PCR xác định giới tính bò 19 3.4.3.2 Áp dụng qui trình PCR để xác định giới tính bò 20 3.4.4 Điện di và quan sát sản phẩm PCR 20 3.4.4.1 Chuẩn bị gel agarose 1,5% 21 3.4.4.2 Điện di sản phẩm PCR 21 3.5 Xử lý số liệu 21 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Ly trích DNA 22 4.1.1 So sánh DNA ly trích từ cơ thu hồi theo hai mức độ làm khô 22 4.1.2 So sánh DNA ly trích từ cơ và lông 22 4.1.3 Kết quả ly trích DNA từ gốc lông và ngọn lông 23 4.2 PCR xác định giới tính 25 4.2.1 Kết quả xây dựng qui trình PCR 25 4.2.1.1 So sánh hai chu trình nhiệt 25 4.2.1.2 Thử nghiệm ba loại Taq 26 4.2.2 Áp dụng qui trình PCR 28 4.2.2.1 Xác định giới tính của ba giống bò với DNA từ cơ 28 4.2.2.2 Kết quả PCR với DNA từ cơ được phơi khô theo hai mức độ 29 4.2.2.3 So sánh kết quả PCR trên DNA của cơ và lông 30 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 36 7 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AHC: adrenal hypoplasia congenita bp: base pair ctv: cộng tác viên DNA: deoxyribonucleic acid DSS: dosage – sensitive sex reversal HMG: high mobility group H-Y: histocompatibility Y antigen mRNA: message ribonucleic acid NST: nhiễm sắc thể OD: optical density ORF: open reading frame PAR: pseudo autosomal region PCR: polymerase chain reaction Taq: Taq polymerase TDF: testis determining factor Tỷ số OD: tỷ số OD 260 nm / OD 280 nm UI: unit UV: ultra violet VNĐ: Việt Nam đồng W: wave 8 DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi 16 Bảng 3.2 Mức độ phơi khô cặn 18 Bảng 3.3 Thành phần hoá chất PCR 19 Bảng 3.4 Sự khác nhau chủ yếu giữa hai chu trình nhiệt 19 Bảng 3.5 Thành phần chủ yếu của ba loại PCR buffer 20 Bảng 4.1 Tỷ số OD và hàm lượng DNA thu hồi theo hai mức độ làm khô 22 Bảng 4.2 Tỷ số OD và hàm lượng DNA ly trích từ cơ và lông 23 Bảng 4.3 Tỷ số OD và hàm lượng DNA ly trích từ gốc lông và ngọn lông 24 Bảng 4.4 Tỷ lệ thành công của hai chu trình nhiệt 25 Bảng 4.5 Tỷ lệ thành công khi PCR với ba loại Taq 26 Bảng 4.6 Kết quả áp dụng PCR lên xác định giới tính của ba giống bò 28 Bảng 4.7 Hiệu quả PCR trên mẫu DNA làm khô theo hai mức độ 29 9 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 2.1 Sự phân bố các gen trên NST X và Y 7 Hình 4.1 Sản phẩm PCR từ hai chu trình nhiệt 26 Hình 4.2 Sản phẩm PCR từ ba loại Taq 27 Hình 4.3 Sản phẩm PCR chẩn đoán giới tính ba giống bò 28 Hình 4.4 Sản phẩm PCR từ hai mức độ làm khô DNA cơ bò đực 29 Hình 4.5 Kết quả PCR từ ngọn lông và gốc lông 30 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 So sánh DNA ly trích từ cơ thu hồi theo mức độ I và II 22 Biểu đồ 4.2 So sánh DNA ly trích từ cơ và lông 23 Biểu đồ 4.3 So sánh DNA ly trích từ ngọn lông và gốc lông 24 10 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Xác định giới tính phôi động vật có thể mang lại hiệu quả trong chăn nuôi, nhất là đối với động vật cao sản như bò sữa. Nhờ xác định giới tính, ta có thể quyết định nuôi động vật có giới tính mong muốn để giảm chi phí chăn nuôi, và góp phần phục hồi một số loài động vật quí hiếm nhưng gặp khó khăn trong vấn đề sinh sản và đang có nguy cơ tiệt chủng. Chính vì thế, các nhà khoa học luôn tìm cách xác định giới tính. Cho đến ngày nay, rất nhiều phương pháp xác định giới tính đã được thực hiện. Những phương pháp bao gồm lai tại chỗ và phát huỳnh quang để xác định nhiễm sắc thể (NST) Y, phân tích NST hoặc xác định kháng nguyên H - Y có trên bề mặt các tế bào phôi đực đã được tiến hành rất nhiều. Tuy vậy, các phương pháp này hoặc có độ tin cậy không cao hoặc bị hạn chế về lượng mẫu dùng (đòi hỏi dùng lượng mẫu DNA quá lớn mà phôi khó cung cấp được). Ngoài các phương pháp trên, người ta còn phát hiện ra phương pháp PCR (polymerase chain reaction). Đây là phương pháp xác định giới tính bằng cách khuếch đại đoạn DNA (deoxyribonucleic acid) đặc trưng cho giới tính đực hiện diện trên NST Y. Phương pháp này có độ tin cậy cao và khá nhạy vì có thể tiến hành với lượng mẫu DNA ban đầu tương đối nhỏ. Ở Việt Nam, tiềm năng phát triển chăn nuôi động vật rất lớn, nhất là gia súc, gia cầm. Để phát triển chăn nuôi, định hướng nuôi con gì, giới tính nào, số lượng bao nhiêu là rất quan trọng. Việc tiền chọn lọc giới tính giúp cho ta hoạch định sẽ nuôi bao nhiêu thú cung cấp sữa, bao nhiêu thú cung cấp thịt và vẫn giữ đúng định hướng ấy mà lại giảm thiểu đáng kể tổn thất về kinh tế. Hiện tại, Việt Nam đang cố gắng tạo được đàn bò có số lượng và chất lượng đủ đáp ứng về thịt và sữa cho người tiêu dùng trong nước, một phần có thể xuất khẩu. Khi đó, việc nhập phôi đông lạnh hoặc tạo hàng loạt phôi được phân biệt giới tính rõ ràng bằng các kỹ thuật chẩn đoán giới tính hiện đại sẽ là hai trong số những giải pháp cho vấn đề này. Vì phôi đông lạnh được phân biệt giới tính trước thì quá đắt, cho nên việc tạo phôi động vật nhân tạo là hướng giải quyết mang tầm chiến lược về kinh tế và khoa học. Mặc khác, việc tạo ra được phôi của động vật cao sản không phải là vấn đề đơn giản ở Việt Nam trong thời điểm hiện tại, nhất là ở những cơ sở nhỏ. Do đó, để thiết . Ly trích DNA 16 3.4.2 .1 Ly trích DNA từ cơ 16 3.4.2.2 Ly trích DNA từ lông 18 6 3.4.3 Multiplex PCR xác định giới tính 19 3.4.3 .1 Xây dựng qui trình PCR xác định giới tính bò 19 3.4.3.2. biệt giới tính 10 2.3.3 Phân tích di truyền tế bào để xác định giới tính 11 2.3.4 Sử dụng đoạn dò DNA chuyên biệt NST Y để phân biệt giới tính phôi 11 2.3.5 Phân biệt giới tính bằng kỹ thuật. TÓM TẮT KHÓA LUẬN Nguyễn Văn Út, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 9/2005, “XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TRÊN BA GIỐNG BÒ”. Hướng dẫn khoa học : 1. PGS. TS. Trần