Ứng dụng kỹ thuật multiplex – pcr để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò

Đề tài được thực hiện nhằm xác định các gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, heo, bê và 9 mẫu bề mặt thịt bò b

Phần 1

MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề

Escherichia coli (E coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi

sinh vật đường ruột của người và động vật Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một

số nhóm E coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non E coli được xem là vi khuẩn chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng của chúng E coli thải qua phân ra môi trường bên ngoài Nếu quá trình vệ sinh kém thì E coli dễ vấy nhiễm vào thịt

tươi, nhất là trong quá trình giết mổ Từ đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm

không thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E coli hoàn toàn có thể xảy ra.

E coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC Trong

đó, nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E coli) mang nhiều gen độc lực như gen eae chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội

chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu

(HUS = hemolytic uraemic syndrome) ở người, gen stx2e sản sinh độc tố vero gây

bệnh phùng thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa Trong khi đó, nhóm ETEC

(Enterotoxigenic E coli ) mang gen lt sản sinh độc tố ruột kém chịu nhiệt (heat labile toxin = LT) và gen st sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu chảy trên người và vật nuôi Nhóm EPEC (Enteropathogenic E coli) mang gen eae

sản sinh protein intimin, …

Trước đây, để phát hiện E coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền

thống Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây lan rồi thì mới

có kết quả Hơn nữa, E coli là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E coli trong phân để tìm

nguyên nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toànkhông phản ánh được khả năng gây độc của chúng Do vậy, việc phát hiện các gen gây

độc của E coli bằng kỹ thuật PCR là bước cần thiết góp phần đánh giá nguy cơ gây

bệnh trên vật nuôi và con người PCR là phương pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết quả

trong thời gian ngắn, kịp thời phát hiện mầm bệnh để góp phần ngăn chặn tác hại củadịch bệnh.

Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học NôngLâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi ThịThu Trang, chúng tôi đã thực hiện đề tài:

“Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi

khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò”

1.2 Mục tiêu

- Phát hiện một số gen độc lực của E coli bằng kỹ thuật multiplex – PCR từ

mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò

1.3 Mục đích

- Góp phần chẩn đoán và kiểm soát bệnh do E coli gây ra cho động vật và

người

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn E coli

2.1.1 Định nghĩa

- Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi khoa

người Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông là người đầu tiên phân lập và mô tả vikhuẩn này vào năm 1885

- Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo hệ

thống phân loại của Bergey)

- E coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước khoảng

1,5m x 0,5m, không hình thành bào tử và có giáp mô (Trần Thanh Phong, 1996)

E coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong ruột của người và động vật máu

nóng, ở phần cuối của ruột non và ruột già Nó vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực

ở đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây ra rất nhiều bệnh đường ruột và ở các cơ quankhác

2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa

- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 35 -37oC, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu là 7,2– 7,4)

- E coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau

trên môi trường chọn lọc ở 37oC trong điều kiện hiếu khí E coli thường được phân lập

bằng môi trường Mac Conkey (MAC) hoặc eosin methylene blue agar (EMB) Trên

môi trường thạch EMB, E coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên môi trường thạch Mac Conkey, E coli cho khuẩn lạc đỏ hồng Ngoài ra, ta có thể sử dụng môi trường SMAC

(Sorbitol Mac Conkey) để phân biệt nhóm STEC không lên men đường sorbitol Trênmôi trường SMAC, nhóm STEC cho khuẩn lạc điển hình màu trắng, hơi nhầy, còn các

nhóm E coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng (FDA, 2002).

- E coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24

giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặtbóng, kích thước khoảng 2 – 3mm

- Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ, E coli làm đục nhẹ môi trường, càng để

lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có ván mỏng trên mặt môi trường

- Để phân biệt E coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng IMViC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate) E coli cho kết quả là + + - -

(biotype 1) hoặc - + - - (biotype 2) (FAO, 1992)

2.1.4 Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E coli

Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E coli:

- Sản xuất độc tố: Gồm các nhóm như ETEC, EAEC, STEC

- Tấn công – xâm lấn: Gồm nhóm EIEC

- Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm các nhóm như EPEC, EHEC

Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc hiệucho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998)

2.1.5 Phân loại E coli

Dựa trên đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màngnhày của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh),

E coli được chia thành 5 nhóm sau:

 STEC (Shiga toxin – producing E coli) hoặc VTEC (Vero toxingenic E

coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E coli)

 EPEC (Enteropathogenic E coli)

 EAEC (Enteroaggregative E coli)

 ETEC (Enterotoxigenic E coli)

 Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:

- EIEC (Enteroinvasive E coli)

- DAEC (Diffusely adherent E coli)

2.1.5.1 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC

a Danh pháp

Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp khác

nhau để đặt tên cho nhóm E coli này:

- Tên gọi Verotoxigenic E coli hoặc Vero cytotoxin producing E coli

(VTEC) được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhóm này sảnxuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997 Tên gọi VTEC được sử dụngrộng rãi ở Anh và nhiều tổ chức khoa học ở Châu Âu

- Tên gọi Enterohaemorrhagic E coli (EHEC) được đặt là do dòng này gây

viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS:haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998)

- Tên Shiga toxin - producing E coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like toxin - producing E coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống

như độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1997) Tên gọi STEC được sử dụng nhiều trongcác tạp chí khoa học ở Mỹ

STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau và cả hai đều chỉ ra rằng

nhóm E coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào Mặc dù vậy, không

phải có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác

Những dòng E coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe

mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một vài hay tất cả nhữngyếu tố độc lực khác nhau của STEC (Beutin và ctv, 1995) Do đó, không phải tất cảSTEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998)

b Shiga toxin và những yếu tố khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC

* Shiga toxin

Những dòng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay còn được gọi làVerotoxins (VT) hoặc Shiga – like toxins (Slt)

Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và

Stx2, được mã hóa bởi gen stx1 và stx2 Cả hai độc tố này được cấu tạo từ 5 tiểu đơn

vị B (được mã hóa bởi stxB) và 1 tiểu đơn vị A (được mã hóa bởi stxA) Cả hai gen stxA và stxB được định vị trên bacteriophage ôn hòa được chèn vào trong nhiễm sắc

thể (NST) của STEC Một dòng STEC chỉ sản xuất độc tố Stx1, hoặc Stx2, hoặc cảhai, hoặc thậm chí nhiều dạng Stx2 Ba dạng Stx2 được xác định: Stx2, Stx2c, vàStx2e (Pierard và ctv, 1998) Subtype Stx2e gây bệnh phù thủng ở heo hơn là gây bệnh

ở người Nhưng thỉnh thoảng những dòng này cũng có thể được phân lập từ bệnh nhânHUS (Thomas và ctv, 1994) Nhiều khi người ta có thể thay thế giữa thuật ngữ Stx và

VT (ví dụ: Stx1 = VT1 = Slt1, Stx2e = VT2e = Slt2e v.v…) (Caldervood và ctv,

1997) Hầu hết những phương pháp chẩn đoán phân tử đều có mục tiêu phát hiện gen

mã hóa Stx của nhóm STEC (Cocolin và ctv, 2000)

* Những yếu tố độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC

Những yếu tố độc lực khác của STEC là enterohaemolysin (Ehly) và có thể làheat – stable enterotoxin (EAST1) Gen mã hóa Ehly nằm trên plasmid 60 – MDa màplasmid này được tìm thấy ở nhiều dòng O157:H7 và cũng hiện diện ở các dòng STECkhông phải O157 Ở Đức, gần 90% dòng STEC được phân lập từ bệnh nhân có gen mãhóa Ehly (Beutin và ctv, 1994) Tuy nhiên, việc sản sinh Ehly như là một yếu tố độc

lực thì khó đánh giá, vì trong các nghiên cứu của tác giả này, E coli có Stx âm tính và

Ehly dương tính là nguyên nhân làm hư hại tế bào vero, Hep-2 hoặc Hela in vitro(Beutin và ctv, 1989) EAST1 đầu tiên được mô tả trong EAEC cũng được tìm thấytrong nhiều dòng STEC EAST1 trong mầm bệnh của STEC thì không được biết,nhưng nó có thể liên quan đến một số bệnh tiêu chảy không có máu thường xuyênđược tìm thấy ở những người bị nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998)

Yếu tố bám dính của STEC đóng vai trò quan trọng cho vi khuẩn định vị ở tếbào ruột Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa Protein

intimin được mã hóa bởi gen eae (E coli attaching và effacing) Intimin gây tổn

thương dạng bám dính và phá hủy (attaching - and – effacing, A/E) ở ruột già do vi

khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv, 1993) Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC Gen eae là một trong số các gen nằm trong vùng gây

bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột - locus of enterocyte effacement,LEE) Vùng LEE của STEC chứa những gen mã hóa intimin, gen mã hóa thụ thể đểvận chuyển intimin là Tir (translocated intimin receptor) và một số gen khác VùngLEE không chỉ là điều kiện cần mà là điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương

A/E Tuy nhiên, không phải tất cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae (Nataro và Kaper, 1998) Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein

màng ngoài vi khuẩn (protein intimin) và protein Tir Protein Tir được tiết ra khỏi vikhuẩn, chuyển vị vào màng của tế bào vật chủ (Kenny và ctv, 1997)

Hầu hết các ổ dịch do STEC gây ra bởi những dòng O157:H7, nên người ta chorằng có thể serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype khác Dấu hiệusinh hóa duy nhất cho những dòng STEC O157:H7 là không thể lên men sorbitol hoặckhông tạo ra- glucuronidase Vì thế, ở nhiều quốc gia, chẩn đoán STEC chỉ dựa vào

việc phát hiện E coli không lên men sorbitol O157:H7 và các serotype không phải

O157 liên quan đến việc gây bệnh ở người gồm O26:H11, O103:H2, O111:HNM vàO113:H21 (WHO, 1994)

c Nguồn lây nhiễm

STEC có thể được tìm thấy trong phân nhiều loài động vật như trâu, bò, cừu,

dê, heo, chó, mèo (Beutin và ctv, 1993; Chapman và ctv, 1997) và ngựa (Chalmers vàctv, 1997) và ngay cả chim hải âu (Makino và ctv, 2000) Loài động vật quan trọngnhất trong việc lây nhiễm cho người là bò Đường lây nhiễm chủ yếu của STEC vàochuỗi thực phẩm là việc vấy nhiễm những thành phần trong ruột và phân trong quátrình giết mổ (Butler, 1996)

STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước và từ người này sangngười khác Hầu hết các trường hợp bệnh là do ăn thực phẩm đã bị nhiễm, đặc biệt làthực phẩm có nguồn gốc động vật Trong đó thịt bò là nguyên nhân chủ yếu(Keskimaki, 2001)

2.1.5.2 Nhóm EPEC

Thuật ngữ enteropathogenic E coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv (1955) để chỉ những dòng E coli gây tiêu chảy ở trẻ em.

a Đặc điểm

Cũng như STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi khuẩn

bám dính vào niêm mạc ruột và gây hư hại (A/E); nhưng EPEC không sản xuất độc tốShiga

b Sự bám dính và phá hủy (AE) của những dòng EPEC

Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thểquan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm và trongnuôi cấy tế bào (Nataro và Kaper, 1998) Dạng tổn thương này được đặc trưng bởi sự

hư hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu

mô Tổn thương này khác với dạng tổn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và

V cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung mao) Gen cần thiết cho việc tạo tổn thương A/E là gen eae mã hóa intimin Protein này là yếu tố độc

lực cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993) Theo Nataro và Kaper (1998), gen

eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia

alvei, nhưng không hiện diện ở những dòng E coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột

thông thường

c Dịch tễ của sự nhiễm EPEC

Cũng như những E coli gây bệnh khác, sự truyền lây của EPEC qua đường

miệng, với sự vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm

Điểm đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ của bệnh do EPEC là sự phân bố lứa tuổi.Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng ở trẻ em Người trưởngthành và trẻ em lớn có phần đề kháng hơn với bệnh mà nguyên nhân có thể là do mấtcác thụ thể đặc hiệu Tuy nhiên, EPEC cũng có thể gây tiêu chảy ở người lớn nếu sốlượng vi khuẩn đủ cao

2.1.5.3 Nhóm ETEC

a Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là độc tố ruột

(enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF)

 Độc tố ruột enterotoxin

Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột Có hai loại: độc tố ruột chịu nhiệt (ST) vàđộc tố ruột kém chịu nhiệt (LT)

(1) Độc tố kém chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT):

Độc tố LT của E coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức

năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra.

LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhaukhoảng 80%), tương đồng về thụ thể, hoạt tính enzyme, và kiểu tác động của nó trênđộng vật hay trong nuôi cấy tế bào LT có hai serogroup chính là LT-I và LT-II LT-I

và LT-II không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch

- LT-I: Được tiết bởi những dòng E coli gây bệnh trên người và thú LT-I là

một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểuđơn vị B 11,5 kDa Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm như một enzym, gồm peptide A1

và peptide A2 liên kết nhau bởi cầu nối disulfur Những tiểu đơn vị B sắp xếp thànhvòng nhẫn, liên kết chắc chắn với ganglioside GM1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b vàvài glycoprotein ruột (các thụ thể của LT) Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và phảnứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp-I) đầu tiên được phân lập từ heo và LTh

(LTh- I) được phân lập từ người Gen mã hóa cho LT là elt hay lt-I nằm trên plasmid

mà plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và / hoặc gen mã hóa những khángnguyên của yếu tố định vị (colonization factor antigen – CFA).

Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-I thâmnhập qua màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăngmức AMP vòng (cAMP) trong tế bào cAMP hoạt hóa protein kinase (A kinase) từdạng không hoạt động thành dạng hoạt động Điều này dẫn đến sự phosphoryl nhữngkênh chloride hoạt động trên mức bình thường ở màng tế bào biểu mô Kết quả là kíchthích những tế bào mào ruột tiết ra Cl- một cách tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thuNaCl bởi những tế bào nhung mao (villus) Đây chính là nguyên nhân dẫn đến tiêuchảy dữ dội (Nataro và Kaper, 1998)

- LT – II: LT-II có cấu trúc giống với LT – I và CT khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn

vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B LT-II cũng làm gia tăngcAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II không liên quan đếnbệnh trên người và thú

(2) Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST)

Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nógiải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này ST được chia thành hai nhóm là STa

và STb Hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động Gen mã hóa cho cảhai nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìmthấy trên transposon Độc tố STa (hay còn gọi là ST-I) do ETEC sản sinh và một vài vi

khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica và V cholerae không phải O1 ST

giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC Một số báo cáogần đây cho rằng một vài dòng thuộc nhóm ETEC ngoài việc sản sinh ra STa, còn cóthể sản sinh độc tố EAST1 Trong khi đó, STb chỉ được tìm thấy ở ETEC

- STa: STa là một peptide gồm 18 – 19 acid amin với trọng lượng phân tử

khoảng 2 kDa STa được chia thành hai loại là STp (ST porcine hoặc STIa) từ E coli phân lập được trên heo và STh (ST human hoặc STIb) của E coli phân lập trên người.

Cả hai độc tố có thể được tìm thấy ở các dòng ETEC trên người

Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C).STa kết hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMPnội bào Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl- và / hoặc ngăn cản sựhấp thu NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu chảy

- STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ heo,vài chủng ETEC được phân lập từ người cũng sản sinh STb Không như STa, STb gây

ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung maocủa lớp biểu mô ruột và teo nhung mao một phần Thụ thể của STb chưa được biết rõmặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chấttrước khi vào bên trong tế bào Không gây ra sự tiết Cl- nhưng STb kích thích tế bàoruột tiết bicarbonat (HCO3-) STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nókích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào STb còn kích thích phóng thích PGE2

và serotonin, từ đó người ta cho rằng hệ thần kinh ruột cũng có thể liên quan đến đápứng tiết dịch gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi và ctv, 1992)

 Yếu tố định vị (colonization factor – CF)

Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiêncứu kỹ Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vàolông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factorantigens)

CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái Có 3 loại chính gồm loạilông hình que cứng, lông hình que mềm dạng bó, lông có cấu trúc mảnh mềm Có ítnhất 20 loại CF trong ETEC ở người Hầu hết, chúng được mã hóa bởi gen nằm trênplasmid, cũng là nơi mã hóa độc tố ST và/hoặc LT (Gaastra và Svennerholm, 1996).Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường tạo miễn dịch vượt trội do đó tiểu đơn vị có tínhkháng nguyên rất mạnh

b Dịch tễ

Dòng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trên trẻ

em thôi bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở khách du lịch Dịch tễ củabệnh do ETEC được quyết định bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dịch tại màng nhầy khácnhau của từng cá thể đối với sự nhiễm ETEC, (2) những người nhiễm không có biểuhiện triệu chứng vẫn bài thải một lượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm chỉ đạtđược khi liều gây nhiễm khá cao Ba đặc tính này tạo nên tình trạng ô nhiễm ETECtrong môi trường ở những vùng có dịch và hầu hết trẻ em trong vùng này sẽ đương đầuvới ETEC trong thời kì thôi bú Trẻ em đã ở tuổi đến trường và người lớn có nguy cơtiêu chảy do ETEC rất thấp Dòng ETEC sản sinh ST là nguyên nhân của hầu hết cáctrường hợp bệnh

Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn và nước bị ô nhiễm là nhữngphương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black và ctv, 1981) Sự nhiễm ETEC, ở nhữngvùng dịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng nóng và ẩm; khi đó, sự nhân lênmạnh mẽ của ETEC trong thực phẩm và nước.

Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những người trưởngthành chưa có miễn dịch cũng dễ bị nhiễm Thật vậy, ETEC là nguyên nhân chính gâytiêu chảy trên du khách trưởng thành từ những nước đã phát triển đến thăm nhữngvùng có dịch ETEC Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60% số du khách này có triệuchứng tiêu chảy và 20 - 40% các trường hợp là do ETEC Tiêu chảy trên du kháchthường xảy ra ở những du khách lần đầu tiên đến thăm những nước đang phát triển.Tiêu chảy trên du khách thường là do thức ăn và nước uống bị ô nhiễm

c Khía cạnh lâm sàng

Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14 – 50giờ) Bệnh nhân tiêu chảy toàn nước, thường không có máu; một vài bệnh nhân cóhiện tượng sốt và ói mửa Tiêu chảy do ETEC có thể nhẹ, ngắn và tự bớt dần nhưng

cũng có thể gây ra tiêu chảy nghiêm trọng giống như nhiễm Vibrio cholerae.

Hầu hết các trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy ra trên trẻ

em thôi bú ở những nước đang phát triển Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảmcũng làm giảm mức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trị có hiệu quả thì không sẵn có

ở những vùng nguy cơ cao; ngoài ra sự đề kháng kháng sinh của dòng ETEC cũng làvấn đề đáng quan tâm Do đó cần phải lưu ý rằng cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhânnhiễm ETEC là duy trì đủ lượng nước trong cơ thể nếu có triệu chứng tiêu chảy

d Phát hiện và chẩn đoán

Việc phát hiện nhóm ETEC dựa vào sự phát hiện độc tố LT và/hoặc ST Cónhiều phương pháp phát hiện ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linkedimmunosorbent assay (ELISA), DNA-probe, PCR…

2.2 Kỹ thuật PCR

2.2.1 Nguyên tắc

PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờpolymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 PCR là kỹ thuật in vitrocho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn(tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào)

Sự khuếch đại những primer oligonucleotide Primer là những phân tử DNAđơn, ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn (trình tự DNAmẫu xét nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate)trong điều kiện phản ứng thích hợp Các primer này gồm có primer “xuôi” (forwardprimer) và primer “ngược” (reverse primer) Kết quả là sẽ có những chuỗi DNA mới

bổ sung với sợi DNA mẫu Những chuỗi này sẽ tồn tại dưới dạng DNA chuỗi đôi Sựtổng hợp này sẽ được lặp lại theo một số chu kỳ nhất định đã được thiết lập

Multiplex – PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lênđồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp primer trong mộtphản ứng Multiplex – PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ

đó multiplex – PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA(Protocol online)

2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm

ba giai đoạn:

 Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)

Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn Phân tử DNAđược biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở

94 -950C trong vòng 30 giây đến 1 phút

 Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặpvới khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 600C tuỳ thuộc Tmcủa các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút

 Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)

Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạt động tổnghợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate ĐoạnDNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA

* Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăngđôi lượng DNA mẫu của lần trước Tổng DNA khuếch đại được tính theo công thức:

Tổng DNA khuếch đại = m*2n

Với n: Số chu kỳ; m: Số bản sao của chuỗi mã hóa

* Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài không xác định vì DNApolymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc bị phá hủy bởi chu

kỳ tiếp theo.Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng không xác định Tuy nhiên, ở chu

kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) được tổng hợp có chiều dài xác định Từchu kỳ thứ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại Vì thế số copy cuối cùngcủa trình tự đích được tính theo công thức:

Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2n – 2n) * x

n : Số chu kỳ

2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2

x : Số bản sao của chuỗi mã hóa

+ Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:

 Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng

 Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng

 Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với primer mà lại bắtcặp với nhau

Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu DNA mẫu ban đầu là

105 thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35– 40

Hình 2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR

Giai đoạn biến tính (denaturation)

Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)

Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)

Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR 2.2.3 Các thành phần của một phản ứng PCR

- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại

- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, cĩ trình tự bổ sungvới trình thự base của hai đầu mạch khuơn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA Việcchọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR Các primer được chọn phảiđặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với các trình tự lặp lại trêngen, khơng cĩ sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuơi và primer ngược và cũng khơng cĩnhững cấu trúc kẹp tĩc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một primer Chiều dài cácprimer tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 – 24nucleotide) Trình tự nằm giữa hai primer xuơi và ngược khơng quá lớn, phản ứngPCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb

- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nĩng Taq DNA polymerase

khơng bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phảnứng dưới sự hiện diện của Mg2+ Taq DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng

5’3’ và hoạt động tốt nhất ở 70-720C

Biến tính94-950C

Ủ bắt cặp

40-700C

Kéo dài

720C

Lặp lại n lần

Thời gian (phút)

- Các nucleotide (dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại:dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.

- Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzymeđược sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+ Nó hình thành một phức hợp hòa tan vớidNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làmtăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi Nồng độ Mg2+ (thường được sửdụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu củaphản ứng PCR Ngoài ra nồng độ MgCl2 có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp củaprimer, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động của enzyme và sự trungthực của kết quả Nồng độ Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thửnghiệm Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 –5mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện trường phụ thuộc vàokhối lượng của các phân tử (tức là số nucleotide), nồng độ các thành phần của gel vàđiện thế

Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng Các DNA trong gelagarose được hiện ra dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide Chất này có khảnăng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới tác dụng củatia UV (bước sóng =300 nm) thành vạch màu đỏ da cam

Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một yếu tốđánh dấu “trọng lượng phân tử” (molecular weight make – MWM) là một tập hợpnhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder)

2.2.5 Những ứng dụng của PCR

2.2.5.1 PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ

PCR có khả năng sử dụng một phân tử DNA đơn như là khuôn mẫu cho phảnứng khuếch đại Việc khuếch đại thành công DNA được ly trích từ tế bào gốc chỉ chứamột copy đơn của bộ gen ở người đã chứng minh được điều này

Khía cạnh này của PCR đã được chứng minh là rất quan trọng trong các phântích pháp lý, cho phép kỹ thuật genetic fingeprinting được sử dụng chỉ với một sợi tóc

và thậm chí với những vết máu, khiến cho những tên tội phạm khó có thể lọt lưới phápluật PCR cũng được sử dụng để khuếch đại DNA từ xương của những nạn nhân bịgiết (trong một vài trường hợp xác định danh tánh của họ) trong khi các phần thân xáccòn lại đã bị phân rã, do đó không thể sử dụng các phương pháp phân tích thôngthường

Tính nhạy cảm của PCR mở ra những khả năng mới trong khảo cổ và cổ sinhvật học, bằng cách làm cho các trình tự nucleotide được thu nhận từ các dấu vết DNAhiện diện trong các nguyên liệu được bảo tồn hay nguyên liệu hóa thạch Phương phápPCR cũng được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của người cổ xưa thôngqua khuếch đại và phân tích các trình tự di truyền từ các dấu vết DNA được giữ trongxương hay được bảo tồn trong các xác ướp

2.2.5.2 PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng

Phương pháp PCR cho phép các thông tin giải trình tự được thu nhận một cáchnhanh chóng, thông qua việc khuếch đại vùng liên quan trên genome dựa trên các kếtquả phân tích trực tiếp từ các sản phẩm của PCR Khả năng nhận biết đột biến mộtcách nhanh chóng không chỉ quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng mà nó cũng làm giatăng các nghiên cứu các bệnh di truyền

PCR cũng được ứng dụng trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh Ví dụ:Khuếch đại DNA của các vi khuẩn, virus trong các mẫu bệnh phẩm trước khi các triệuchứng bệnh bắt đầu xuất hiện nhiều ngày, nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng Từ đó ta

có thể đề ra cách chữa trị thích hợp và ngăn chặn được thiệt hại

2.2.5.3 PCR được dùng để khuếch đại RNA

PCR không chỉ khuếch đại các khuôn mẫu DNA, các khuôn mẫu RNA cũngđược khuếch đại nếu ban đầu chúng được biến đổi thành DNA tái tổ hợp (cDNA) nhờenzyme reverse transcriptase

Một ứng dụng có ích của RT – PCR là xác định số lượng tương đối của mộtmRNA trong các mô khác nhau hay trong cùng một mô nhưng tại các thời điểm khác

nhau Số lượng của một mRNA trong tế bào chính là sự phản ảnh về khả năng hoạtđộng của gen cha mẹ Vì thế, sự xác định số lượng của mRNA tạo ra những thay đổitrong sự biểu hiện gen để chúng có thể được kiểm soát

2.2.5.4 PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau

Sự khuếch đại ngẫu nhiên (random amplification) với các primer ngắn là kỹthuật hữu dụng trong phát sinh chủng loại, khu vùng nghiên cứu liên quan đến sự tiếnhóa và suy vong của các loài hay các nhóm sinh vật khác Hai sinh vật có quan hệ thântộc sẽ có nhiều band giống nhau hơn hai sinh vật có quan hệ thân tộc kém (Brown,1994)

2.2.6 Các hạn chế của phương pháp PCR

Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời với thao tác đơn giản, người ta cókhuynh hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề Tuy nhiên, takhông thể quên rằng phương pháp có nhiều hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệtkhi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả Có thể kể ba vấn đề lớn khi

2.2.6.2 Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao đối với phương pháp này

Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán vì hậu quả rấtnghiêm trọng Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại củanhững lần thao tác trước Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ốngnghiệm sau những lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín trong phòng thínghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơlửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị dung cụ…rồi nhiễm vào cácphản ứng tiến hành sau đó Có thể khắc phục một phần vấn đề này bằng một số biệnpháp sau:

- Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phântích các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau

- Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng chocác thao tác khác Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm vàođầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng

- Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đạitrước

- Tất cả các thành phần phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ,tính toán sao cho 1, 2 lần thao tác

2.2.6.3 Các sai sót gây ra do Taq polymerase

Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10-4, nghĩa là cứ

10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide) Đặc tính này không nghiêm trọngnếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng

có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA Ta không thểloại bỏ hoàn toàn các sai khác này mà chỉ có thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cânbằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩmkhuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức,…

Phần 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

3.1.1 Thời gian: Từ tháng: 2/2005 - 7/2005

3.1.2 Địa điểm

- Mẫu phân bò khảo sát được lấy từ hộ hoặc trại chăn nuôi ở Đồng Nai; mẫuphân heo được lấy ở Tiền Giang; mẫu bề mặt thịt bò được lấy ở lò mổ Dĩ An – BìnhDương

- Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại phòng thực hành Kiểm nghiệmThú sản và Môi trường, khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường Đại học Nông Lâm ThànhPhố Hồ Chí Minh

- Xác định các gen độc lực được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích ThíNghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

3.2 Nội dung

- Thu thập mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò

- Nuôi cấy, phân lập E coli trên môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC.

- Chọn khuẩn lạc điển hình của E coli / nhóm E coli.

- Giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch NA

- Ly trích DNA của E coli phân lập được.

- Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện gen gây độc của E coli.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Lấy mẫu

- Mẫu phân tiêu chảy

Được lấy từ trực tràng bằng tăm bông rồi cho vào môi trường vận chuyểnCarry Blair Bảo quản ở 4 – 80C cho đến khi tiến hành xét nghiệm (mẫu được giữ tối

đa 24 giờ)

- Mẫu bề mặt thịt

Dùng gạc y tế tẩm nước muối sinh lý quét đều lên bề mặt thịt, cho vào chai cósẵn 50 ml nước peptone đệm Sau đó đậy chặt chai, cho vào túi ny lông buộc kỹ Bảoquản 4 - 80C, chuyển về phòng thí nghiệm

- Số lượng mẫu: Số lượng mẫu khảo sát được tính là số mẫu đã phân lập được

vi khuẩn E coli từ các mẫu đã lấy.

Bảng 3.1 Số lượng mẫu

3.3.2 Nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E coli

3.3.2.1 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Mac Conkey (MAC), SMAC, thạch dinh dưỡng (NA), peptone đệm, Cefixime-Tellurite-SMAC (CT-SMAC), hóa chất thử IMViC…

Sorbitol-3.3.2.2 Nuôi cấy và phân lập

(1) Mẫu phân tiêu chảy được cấy trực tiếp trên đĩa thạch MAC và SMAC để có

những khuẩn lạc rời rạc sau 24 giờ ở 37oC Mẫu bề mặt thịt được làm đồng đều trong

125 ml peptone đệm phosphate có bổ sung kháng sinh cefixime với nồng độ 0,0125mg/l, vancomycin với nồng độ 8 mg/l (FDA, 2002) Ủ 24 giờ ở 37oC, cấy sang môi

trường CT-SMAC Vi khuẩn E coli nhóm STEC phát triển tạo khuẩn lạc không màu hoặc xám với tâm đục, E coli khác cho khuẩn lạc hồng giống như trên môi trường

MAC

(2) Chọn khuẩn lạc điển hình của E coli

- Quan sát các loại khuẩn lạc hiện diện trên bề mặt thạch MAC, SMAC, SMAC

CT Mỗi nhóm khuẩn lạc chọn 6 – 10 khuẩn lạc rời rạc đại diện E coli của mẫu

khảo sát Các nhóm khuẩn lạc như sau:

 6 – 10 khuẩn lạc hồng MAC (Ký hiệu HM)

 6 – 10 khuẩn lạc trắng SMAC (Ký hiệu TS)

 6 – 10 khuẩn lạc đỏ hồng SMAC (Ký hiệu HS)

 6 – 10 khuẩn lạc trắng CT – SMAC (Ký hiệu TC).

(3) Tăng sinh, giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên môi trường thạch dinh dưỡng(NA)

- Mỗi khuẩn lạc được chọn cấy chuyển vào ống thạch NA Phần khuẩn lạc cònlại của mỗi nhóm được thu gom chung vào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml nước cấtkhử ion vô trùng để ly trích DNA nhóm khuẩn lạc (DNA tổng)

Dựa theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với phương pháp ly trích DNA từ E coli của Cerna và ctv (2003) và Botteldoorn và ctv (2003) để tiến hành ly trích DNA từ

vi khuẩn E coli phân lập được bằng phương pháp nhiệt như sau: đun sôi 10 phút rồi

chuyển vào tủ -70oC để trong 10 phút, rã đông rồi ly tâm 13000 vòng/phút trong 3phút Thu phần nổi làm DNA khuôn mẫu (DNA xét nghiệm)

- Quy trình phân lập vi khuẩn E coli như sau:

Sơ đồ 3.1 Phân lập, xác định E coli và phát hiện gen độc lựcCạo tất cả những khuẩn lạc đã chạm theo từng nhóm riêng:

(1) 6 – 10 khuẩn lạc đỏ hồng SMAC(2) 6 – 10 khuẩn lạc hồng MAC(3) 6 – 10 khuẩn lạc trắng SMAC(4) 6 – 10 khuẩn lạc hồng CT – SMAC(5) 6 – 10 khuẩn lạc trắng CT - SMAC

CT - SMAC(37oC/24h)

Thu tất cả phần còn lại của những khuẩn lạc đã chọn để cấy qua ống NA theo từng nhóm riêng, cho vào eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml H2O cất

lạc đỏ hồng trắng và / hoặc đỏ hồngChọn 6-10 khuẩn lạc trắng và / hoặc đỏ hồngChọn 6-10 khuẩn lạc

Ly trích DNA (DNA nhóm khuẩn lạc)

3.3.3 Xác định các gen stx1, stx2, eae, hly, stx2e, sta, stb, lt-I của E coli phân lập

được bằng multiplex - PCR

- Việc phát hiện các gen độc lực của E coli được thực hiện bằng 2 phản ứng

multiplex – PCR với máy luân nhiệt (thermal cycler):

 Multiplex – PCR1: Phát hiện các gen eae, hly, stx1, stx2.

 Multiplex – PCR2: Phát hiện các gen stx2e, sta, stb, lt-I.

- Trong quá trình thực hiện phản ứng multiplex – PCR, mẫu đối chứng dương(EDL933 hoặc H44) được thực hiện đồng thời với mẫu khảo sát

 EDL933 là đối chứng dương với các gen eae, hly, stx1, stx2.

 H44 là đối chứng dương với các gen stx2e, stb, lt-I.

Hai mẫu đối chứng dương này được cung cấp từ Trường đại học Thú y Toulouse(Pháp)

AB gene 0.5UI; DNA khuôn mẫu 1l; nước cất 2 lần khử ion vừa đủ 50l

* Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex – PCR1 (Paton và Paton, 1998a):

Bước 1

0C / 2 phút 10 chu kỳ

độc lực Primer Trình tự đoạn primer (5’ 3’)

Kích cỡ đoạn DNA khuếch đại (bp)

150 ng, STa-R 150ng, STb-F 45 ng, STb-R 45 ng, Vt2e-F 225 ng, Vt2e-R 225 ng; Taq

- polymerase AB gen 0.5UI; DNA khuôn mẫu 3,5 l; nước cất 2 lần khử ion vừa đủ

50l

* Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex – PCR2 (Nguyen Ngoc Hai, 2002):

3.3.4 Điện di trên gel aragose và đọc kết quả điện di

Sau phản ứng multiplex - PCR, 6l sản phẩm PCR cùng với 1,2l loading dyeđược điện di trên gel agarose 1,4% trong TBE 0,5X Ladder cũng được điện di đồngthời Thời gian điện di là 30 – 35 phút ở 100V, 250mA

Sau khi điện di, gel được ngâm trong 30 phút với dung dịch ethidium bromide1mg/ml TBE Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UV bằng máy chụp