Ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR trong xác định giới tính phôi giống bò
MỤC LỤC
Phân tích di truyền tế bào để xác định giới tính
Phương pháp phân tích di truyền tế bào còn được gọi là karyotyping (in nhân) được tiến hành bằng cách tạo sinh thiết phôi để lấy một số ít tế bào, nuôi chúng trong môi trường có colcemid giúp các tế bào tiến tới nguyên phân. Các NST sẽ được cố định và nhuộm bằng phẩm nhuộm vĩnh cửu rồi đem quan sát dưới kính hiển vi. Một, phải có kỹ thuật cao và làm sao tạo được nhiều tế bào ở metaphase để NST dàn trói rừ ràng.
Để giải quyết những khó khăn này, người ta có nhiều cách nhưng tất cả các cách hoặc chỉ giảm áp lực thời gian hoặc chỉ tăng số tế bào ở metaphase nhưng lại vướng phải khó khăn còn lại. Dù có rất nhiều cản trở cho khả năng áp dụng thương mại đối với phương pháp này, nhưng do độ chính xác cao của nó nên phương pháp phân tích di truyền tế bào thường được sử dụng để khẳng định kết quả của những kỹ thuật phân biệt giới tính khác.
Sử dụng đoạn dò DNA chuyên biệt NST Y để phân biệt giới tính phôi Nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật này là việc lai DNA tổng số lấy từ những tế bào
Do vậy, công cuộc tìm kiếm phương pháp xác định giới tính phù hợp vẫn còn tiếp tục.
Phân biệt giới tính bằng kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR)
Một số công trình xác định giới tính bằng PCR
Sau hơn một thập niên phát triển, kỹ thuật xác định giới tính bằng PCR đã ngày càng chứng tỏ ưu thế nhanh, nhạy và phù hợp với thương mại. Vào 1990, Schorder và ctv công bố công trình xác định giới tính phôi bò giai đoạn 6 - 7 ngày tuổi dựa trên phản ứng PCR. Trong công trình này, các tác giả thực hiện sinh thiết phôi ở giai đoạn phôi dâu và lấy đi 2 - 8 tế bào từ phôi để thực hiện việc xác định giới tính.
Trong nghiên cứu, các tác giả chỉ sử dụng đoạn mồi đặc hiệu cho giới tính đực mà không sử dụng đoạn mồi cho các trình tự chung của 2 giới để kiểm tra hiệu quả nhân bản của phản ứng. Các tác giả cho rằng việc sử dụng đoạn mồi cho các trình tự chung này là không cần thiết nếu như đã thực hiện việc kiểm tra sự hiện diện của mẫu sinh thiết trước khi thực hiện phản ứng PCR. Với mục tiêu chính là phát triển một phương pháp xác định giới tính nhanh cho một vài loài thú hữu nhũ, Pomp và ctv (1995) đã xác định chính xác 209 phôi heo con được thu thập từ 21 con nái tơ sau 10 - 11 ngày giao phối bằng kỹ thuật PCR.
Toàn bộ qui trình từ lúc nhập phôi đến lúc cho kết quả chỉ mất 6 giờ, cải thiện hơn rất nhiều so với các phương pháp khác. Sau đó, ông đã áp dụng phương pháp xác định giới tính này trên các loài hữu nhũ khác như: ngựa, mèo, chó, bò, dê,… và người nhưng kết quả không được chính xác và không đáng tin cậy như trên heo. Vào 1999, Kitiyanant và ctv đã phân biệt giới tính từ một tế bào được tách từ phôi giai đoạn 2 tế bào bằng 2 phương pháp: karyotyping và PCR.
Cũng vào năm này, Chen và ctv đã khẳng định độ nhạy và độ chính xác của phản ứng PCR xác định giới tính khi dùng 10 pg DNA, 100% thành công trên tế bào phôi của các giống Holstein, Jussay và. Bắt kịp với nhịp phát triển thương mại trong chẩn đoán giới tính phôi trước khi chuyển cấy, hãng Takara Bio (Nhật Bản) đã cho ra đời bộ kit chẩn đoán giới tính bò mang tên Cycleave PCRTM Bovine sexing kit (Takara bio Inc, 2005). Để khẳng định khả năng áp dụng một qui trình PCR chẩn đoán giới tính trên nhiều giống bò khác nhau, năm 2003, Alves và ctv đã tiến hành phân biệt giới tính trên 2 nhóm giống bò Bos indicus và Bos taurus.
Năm 2002, Nguyễn Thị Thu Lan đã xác định giới tính heo nhà (Sus scrofa domestica) bằng cách khuếch đại đoạn DNA dài 166 bp đặc hiệu cho giới tính đực và đoạn 447 bp đặc hiệu cho cả hai giới tính. Năm 2003, Huỳnh Thị Lệ Duyên ứng dụng qui trình xác định giới tính bằng PCR của Nguyễn Thị Thu Lan (2002) để xác định giới tính phôi. Ngoài ra, trung tâm Công Nghệ Sinh Học Phôi Việt Nam cũng đang thực hiện nhiều công trình xác định giới tính phôi bằng kỹ thuật PCR trên bò, dê, cừu, sao la,….
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- VẬT LIỆU
- PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .1 Lấy và bảo quản mẫu
Band 370 bp phải hiện diện trên gel sau khi điện di như là sản phẩm đặc trưng chung cho cả bò đực lẫn bò cái. - Mẫu lông: lông đuôi bò được thu nhặt có cả phần gốc lẫn phần ngọn; rửa sạch dưới vòi nước máy; cắt thành 2 phần: phần gốc và phần ngọn lông; mỗi phần được trữ trong túi ni lông 10*20 cm ở -70oC. Trong quá trình thử nghiệm qui trình PCR để xác định giới tính, chúng tôi nhận thấy nếu làm quá khô DNA sau khi tủa trong cồn tuyệt đối thì PCR sẽ không cho hiệu quả cao (không xác định được chính xác giới tính đực cái).
Chính vì vậy, chúng tôi đã bố trí thí nghiệm thu hồi DNA mẫu cơ với mức độ làm khô DNA là yếu tố thí nghiệm. Đó là tỷ số OD, hàm lượng DNA thu hồi và kết quả phân biệt giới tính bằng phản ứng PCR (theo qui trình PCR tối ưu đã được xác định). DNA từ mẫu lông cũng được kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ quang với độ pha loãng là 10.
Để so sánh độ tinh sạch và hàm lượng DNA ly trích được từ cơ và lông, thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố được tiến hành trên 10 mẫu DNA lông (gồm cả gốc lông và ngọn lông) và 54 mẫu DNA cơ. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố trên hai đối tượng gốc lông và ngọn lông của cả ba giống. Để tìm được qui trình PCR xác định giới tính phù hợp, chúng tôi thử nghiệm hai chu trình nhiệt và so sánh Taq polymerase (Taq) từ ba nguồn cung cấp khác nhau.
Dựa trên cơ sở chu trình nhiệt tìm ra được, bố trí thí nghiệm để so sánh hiệu quả của Taq ở nồng độ 1,5 UI do ba hãng Promega, Bio-rad, và ABgene sản xuất. Đây là thí nghiệm một yếu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với đối tượng được dựng là DNA cơ của giống ta Vàng. Sau khi có được qui trình PCR phù hợp (gồm chu trình nhiệt và thành phần hoá chất), chúng tôi tiến hành xác định giới tính ba giống bò khác nhau để xác định hiệu quả của qui trình đồng thời kiểm tra một số yếu tố ảnh hưởng có liên quan.
Kiểm tra hiệu quả xác định giới tính của qui trình này với DNA cơ của ba giống ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan. Sản phẩm PCR từ các thí nghiệm được điện di trên gel agarose 1,5% và quan sát dưới tia UV sau khi nhuộm ethidium bromide. Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học với trắc nghiệm chi - square hoặc trắc nghiệm F trên phần mềm Statgraphics 7.0.
