Nghiên cứu biện pháp công nghệ sinh học thực vật nhằm giảm chiều cao cây và tăng khả năng chống đổ của các giống lúa chất lượng cao

Nghiên cứu biện pháp công nghệ sinh học thực vật nhằm giảm chiều cao cây và tăng khả năng chống đổ của các giống lúa chất lượng cao

1 Mở đầu

Công nghệ sinh học thực vật đang có nhiều đóng góp có giá trị cho sản xuất

nông nghiệp, đặc biệt trên lĩnh vực tạo giống cây trồng mới Sự ra đời và pháttriển của các kỹ thuật sinh học hiện đại như nuôi cấy mô tế bào thực vật, chọndòng đột biến, công nghệ gen đang là công cụ có hiệu quả cao trong việc nghiêncứu và cải tiến các giống cây trồng có giá trị kinh tế và đã thu được nhiều kết quảtrên nhiều đối tượng cây trồng [1]

Ở Việt nam công nghệ sinh học thực vật đang được nghiên cứu ứng dụngtriển khai trong công tác giống cây trồng và đã thu được những kết quả đáng kểnhư nhân giống cây sạch bệnh bằng nuôi cấy mô, nuôi cấy đơn bội, nuôi cấy vàdung hợp tế bào trần, chọn dòng tế bào đột biến trên các đối tượng cây trồng nhưlúa, khoai lang, thuốc lá, dứa sợi [9] Đặc biệt Viện Công nghệ sinh học đã chọntạo được hai giống lúa DR1 và DR2 bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào mang biến dịsoma cho năng suất cao và ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn sovới giống gốc [10].

Lúa là cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới, 90% diện tích lúa trồngvà tiêu thụ chủ yếu ở châu Á Hiện nay lúa được trồng trong những điều kiệnsinh thái và khí hậu rất khác nhau ở cả vùng nhệt đới, á nhiệt đới và ôn đới ở cácchâu lục [3, 8].

Việt Nam là nước đứng thứ hai trên thế giới về xuất khẩu gạo, nhưng giá trịkinh tế không cao, vì chất lượng nhiều giống lúa không đáp ứng được nhu cầu củathị trường Trong khi đó chúng ta có những giống lúa chất lượng cao đặc sản rấtquí, hạt dài, cơm dẻo và rất thơm ngon như Tám thơm, Dự thơm, Tẻ di hương nhưng năng suất thấp vì cây cao thân mềm, chống đổ kém, lá dài, mỏng và rủ, hạtthưa, thời gian sinh trưởng dài, phản ứng chặt chẽ với ánh sáng ngày ngắn [2, 7,8]

Kết hợp giữa công nghệ tế bào thực vật, đột biến thực nghiệm và công nghệgen cho phép cải biến các giống lúa nói trên theo các hướng như gây đột biến tếbào bằng tia gamma và chọn dòng tế bào để chọn các đột biến thấp cây, chống đổhoặc sử dụng công nghệ gen để chuyển gen hạ thấp chiều cao cây

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi xây dựng đề tài: “Nghiên cứu biện phápcông nghệ sinh học thực vật nhằm giảm chiều cao cây và tăng khả năngchống đổ của các giống lúa chất lượng cao” Với mục đích hạ thấp chiều cao

cõy, tăng cường tớnh chống đổ để cải thiện năng suất, rỳt ngắn thời gian sinhtrưởng của giống lỳa Tỏm thơm, Dự thơm và Tẻ di hương

2 Tổng quan tài liệu2.1 Các giống lúa chất lợng cao ở miền Bắc Việt Nam

ở nớc ta cây lúa luôn giữ vị trí trọng yếu trong hệ thống các cây trồng nôngnghiệp Ngày nay khi mà lúa gạo đã có đủ cho nhu cầu trong nớc và có d để xuất khẩuthì vị trí của các giống lúa chất lợng cao đặc sản ngày càng quan trọng

Nhu cầu sử dụng các giống lúa chất lợng cao đặc sản ngày một gia tăng, trong khiđó hầu hết các giống lúa này đang trong tình trạng bị thoái hoá, chất lợng gieo trồngthấp, kỹ thuật canh tác cha phù hợp nên sản phẩm cha đạt yêu cầu chất lợng nh mongmuốn Các giống lúa chất lợng cao nh Tám xoan, Tẻ di hơng, Dự thơm, Nàng hơng là

2

giống lúa đặc sản vùng đồng bằng Bắc bộ có phẩm chất gạo rất tốt và có mùi thơm ngon,nhng năng suất thấp do có nhiều đặc điểm yếu nh cao cây, thân yếu chống đổ kém, kémchịu phân, lá dài rủ, hạt tha, cổ bông dài, trong đó tính trạng cần khắc phục nhất là caocây [7, 8].

Các giống lúa chất lợng thuộc nhóm lúa mùa chính vụ có thời gian sinh trởng dài150-160 ngày, phản ứng chặt chẽ với ánh sáng ngày ngắn, biên độ thời vụ khá rộng Hiệnnay có khoảng 12 giống lúa Tám đợc trồng ở miền Bắc nớc ta, trong đó các giống chất l-ợng cao nổi tiếng nhất nh: Tám xoan Hải Hậu, Tám ấp bẹ Xuân Đài, Tám cổ ngỗng Namđịnh Các giống này thờng đợc trồng ở vùng Thái Bình, Nam định, Hải Dơng, HảiPhòng Các giống lúa Dự thơm, Tẻ di hơng cũng là những giống lúa đặc sản nổi tiếng đ-ợc trồng nhiều ở các tỉnh ven biển đồng bằng Bắc bộ, hiện nay đợc chú ý khôi phục trởlại do tính chất chịu mặn, chịu chua phèn, gạo dự hơng đợc coi là loại gạo đặc sản dùngtrong ngày lễ, ngày tết [8].

Hầu hết các giống lúa chất lợng cao đang trồng ở miền Bắc nớc ta đều cao cây,chống đổ kém và đợc trồng vào vụ mùa, đây là mùa ma nhiều Nên vào giai đoạn gần thuhoạch các giống này do cao cây chống đổ kém nên dễ bị khi gặp gió và ma, vì vậy hạt lúadễ bị mọc mầm, ảnh hởng đến chất lợng và năng suất Tính trạng qui định chiều cao câylà do đa gen qui định và chịu ảnh hởng của điều kiện môi trờng Việc nghiên cứu cácbiện pháp để giảm chiều cao cây có ý nghĩa rất lớn không chỉ đối với các giống lúa chấtlợng cao mà còn có ý nghĩa đối với các giống cây trồng khác nh lúa nếp, lúa tẻ, các giốngngô.

2.2 Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Cơ sở chọn dòng biến dị soma trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật.

Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng đểphát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào [1]

Soma là tên gọi các tế bào sinh dỡng, nó khác với tế bào sinh dục Biến dị somadùng để chỉ tất cả các biến dị xảy ra trong quá trình nuôi cấy mô, tế bào Từ các tế bàosoma có thể tạo nên bất kỳ bộ phận nào của cây hay cây hoàn chỉnh thông qua kỹ thuậtnuôi cấy mô tế bào thực vật Nguyên lý chung của việc chọn dòng mang biến dị soma làcác tế bào nuôi cấy in vitro có tỷ lệ biến dị di truyền lớn (10-5-10-8), nếu kết hợp xử lý độtbiến hoặc xử lý stress thì tần số có thể tăng lên gấp 10 lần, vì thế có thể chọn đợc các cáthể đột biến nhanh hơn và có hiệu quả hơn so với các phơng pháp chọn giống thông th-ờng khác áp dụng cho cây nguyên vẹn ở mức độ tế bào, nhất là tế bào đơn bội hầu nhnhững đặc điểm đột biến đợc thể hiện ra ngay Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào còn cho phépgiảm bớt đáng kể thời gian cần thiết để chọn đợc những tính trạng theo ý muốn [1].

Theo Lê Trần Bình và CS (1997), bản chất và cơ chế của biến dị soma liên quan mậtthiết đến những thay đổi trong genome của tế bào nuôi cấy Do nhiều nguyên nhân nh tácđộng của hocmon sinh trởng trong thời gian dài và các yếu tố khác làm cho nhiễm sắc thểtrong tế bào nuôi cấy có thể tăng lên tạo ra các dạng đa bội lệch và mức bội thể cao Nhiềutrờng hợp các, các đoạn của nhiễm sắc thể đợc chuyển đổi hoặc đảo ngợc Cấu trúc của phântử DNA cũng có thể bị thay đổi dẫn đến đột biến kiểu hình thực sự.

Tơng tự nh vậy, nhiều công trình công bố cũng cho rằng biến dị soma thờng xuấthiện ở các cây tái sinh đợc sau khi nuôi cấy tế bào qua giai đoạn mô sẹo [14], có nhiềukiểu đột biến nh: đột biến nhân, đột biến tế bào chất, đa bội thể và các bất th ờng kháctrong nhiễm sắc thể [25].

Những ứng dụng lớn nhất trong việc chọn dòng mang biến dị soma của công tácgiống chính là chọn ra các kiểu hình với các kiểu gene tơng ứng, thích hợp với yêu cầucủa các giống mới là có năng suất cao, chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi,chất lợng tốt và ổn định Nhiều công trình công bố đã thành công trong việc chọn dòngmang biến dị soma trên các đối tợng giống cây trồng, ở thuốc lá, nuôi cấy hạt phấn và tế

bào trần đã thu đợc những cây đột biến có năng suất cao, thời gian sinh trởng ngắn, hàmlợng đờng và alkaloid thấp [1]

2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo và sự biến dị di tryuền

Mô sẹo (callus) là khối mô thực vật gồm những tế bào không phân hoá, có khả

năng phân bào liên tục Trong tự nhiên, mô sẹo thờng phát sinh trên vết thơng ở cây vìvậy có tên gọi theo nghĩa đen là mô sẹo

Bởi vì mô sẹo là một khối các tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc thấp, cha phânhoá nhng phân chia một cách hỗn loạn và thờng có tính biến động di truyền cao Trongnuôi cấy in vitro mô sẹo đợc tạo ra bằng cách nuôi cấy các cơ quan của thực vật (thân, rễ,lá, hoa, quả ) ở các môi trờng chứa chất điều khiển sinh trởng cần thiết (auxin,cytokinin) và điều kiện nuôi cấy thích hợp Khi tái sinh cây từ những mô sẹo đợc cấychuyển nhiều lần, thì những cây này dễ mang những biến động di truyền về nhiễm sắcthể (dị bội, đa bội) và những biến đổi di truyền khác [1].

Đối với việc chọn dòng biến dị soma, những cây tái sinh từ mô sẹo với những biếndị di truyền có một ý nghĩa rất lớn, từ đây ta có thể chọn ra đ ợc nhiều dòng cây mangnhững đặc điểm khác nhau so với giống ban đầu Vấn đề này đã mở ra một triển vọngtrong việc sử dụng công nghệ tế bào thực vật để cải tiến di truyền những giống cây trồngcó ý nghĩa kinh tế

2.2.3 Tái sinh cây từ mô sẹo

Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, kỹ thuật tạo, nuôi và tái sinh cây từ mô sẹophải đợc hoàn thiện một cách tối u nhất, trong đó đặc biệt là vấn đề tái sinh cây Nhiềutác giả sau khi chọn đợc dòng tế bào đột biến từ nuôi cấy mô sẹo đã không tái sinh đợccây hoặc những cây này lại không duy trì đợc tính trạng vừa chọn lọc.

ở một vài loại cây cho hạt quan trọng, việc tái sinh chồi từ mô sẹo còn gặp nhiều

khó khăn ở các đối tợng thuộc họ Fabacaea việc tái sinh cây hoàn chỉnh cho tới nay chỉthành công trong một số trờng hợp chẳng hạn Archis hypogaea, Onobrychis viciifolia

Nuôi cấy mô sẹo của thuốc lá sau nhiêu lần cấy chuyển vẫn duy trì đợc khả năng tái sinh[18]

Theo Amirato và cs (1984) nguồn gốc mô sẹo cũng ảnh hởng đến khả năng táisinh cây, chẳng hạn ngời ta chỉ thu đợc cây tái sinh từ mô sẹo nuôi cấy bằng đoạn hoa tựcủa lúa mì Mức bội thể của mô sẹo cũng là nguyên nhân gây sự khác nhau trong quá

trình tái sinh cây, mô sẹo đơn bội từ đoạn thân hoặc mảnh lá của Datura innoxia tạo chồi

nhanh hơn mô sẹo cùng loài của cây nhị bội.

Theo Sharp (1984) năm 1951-Levine là ngời đầu tiên đã thành công trong việc tạo

mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo của Nicotiana affinis và Helianthus annuus, đến nay

ngời ta đã tạo và tái sinh cây thành công từ mô sẹo trên hơn 100 loài.

2.3 Đột biến thực nghiệm và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng

Tính ổn định trong cấu trúc di truyền ở cá thể sống không phải là tuyệt đối, nó có thể bị biến đổi do tác động của các tác nhân vật lý và hoá học Ngời ta gọi những biến đổinhỏ nhất trong cấu trúc gen hoặc nhiễm sắc thể là đột biến [11].

Cùng với tác nhân gây đột biến là các tác nhân hoá học, thì các tác nhân vật lý(chiếu xạ bởi tia Rơnghen, tia Gamma, bức xạ Neutron ) là những tác nhân gây đột biếncó hiệu quả giúp con ngời tạo ra hàng loạt giống mới có những thuộc tính mới có lợi vềmặt kinh tế: thấp cây, thời gian sinh trởng ngắn, năng suất cao, chất lợng dinh dỡng tốt,đề kháng với sâu bệnh [5].

Đối với chiếu xạ tia Gamma thờng dùng nguồn là Co60 hoặc Cs137 có hoạt tínhphóng xạ, tuỳ từng đối tợng cụ thể có thể sử dụng 2 cách chiếu xạ: (1) Chiếu xạ nhanhtrong một thời gian ngắn bằng nguồn mạnh và cờng độ chiếu xạ mạnh, (2) Chiếu xạ từ từbằng nguồn yếu và thời gian chiếu xạ kéo dài.

2.3.1 Cơ chế gây đột biến khi chiếu xạ

4

Dựa vào tính chất biến đổi cấu trúc di truyền mà ngời ta chia đột biến thành hai kiểucơ bản: Đột biến gen (còn gọi là đột biến điểm) và đột biến nhiễm sắc thể.

- Đột biến gen là những biến đổi trong cấu trúc phân tử của gen, tức là nó thay đổi trậttự các nucleotid trong DNA hoặc thay thế các bazơ nitơ trong các cặp nucleotid - Đột biến NST là những đột biến làm đứt và thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể, vì thế nó

làm thay đổi nhiều dấu hiệu hay các đặc tính khác nhau của cơ thể Ngoài ra còn loạiđột biến nữa là sự tăng hoặc giảm một số lần bộ nhiễm sắc thể, gọi là đa bội thể.Khi chiếu xạ bằng tia Gamma từ nguồn Co60 lên tế bào hoặc mô thì các phân tử sinhhọc chịu tác dụng trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hoá.

- Tác dụng trực tiếp: bức xạ trực tiếp ion hoá và kích thích các phân tử sinh học làm tổn ơng các phân tử đó, đối với vật chất di truyền xảy ra các hiệu ứng sau: (1) Thay đổi thànhphần cấu tạo của DNA: đứt liên kết photphodieste giữa các phân tử đờng, phá huỷ liênkết bazơ - đờng, thay đổi cấu trúc bậc 2 của DNA (đứt đoạn, biến tính, kết hợp chéo) (2).ảnh hởng lên sự sao chép DNA - RNA (3) Tay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể: đứt đoạn,mất đoạn, đảo đoạn, lặp đoạn, trao đổi chéo, thay đổi mức bội thể.

th Tác dụng gián tiếp: bức xạ ion hoá tác dụng lên các phân tử nớc với ion H+, OH-, cácgốc tự do OH., H. và các sản phẩm oxy hoá mạnh nh H2O2 Các sản phẩm kể trên củaquá trình xạ phân (Radiolyse) nớc rất hoạt động về mặt hoá học, chúng sẽ công phácác phân tử sinh học làm thay đổi cấu trúc chức năng của chúng.

Bức xạ có thể gây ra những thay đổi hình thái cũng nh thay đổi chức năng trong tế bàovà mô Nhng bức xạ không tạo ra chức năng mới trong tế bào và mô mà chỉ làm thay đổicác chức năng sẵn có hay làm xuất hiện các chức năng trớc đó tiềm tàng [5, 11].

2.3.2 Một số thành tựu của chọn giống đột biến

Công tác chọn giống và tạo giống mới có vai trò hết sức quan trọng trong việctăng năng suất và chất lợng cây trồng đặc biệt là cây lơng thực Chính công tác này đãđóng vai trò quyết định trong cuộc cách mạng xanh trong những năm 1960 ở ấn Độ vànhiều nớc khác trên thế giới [5] Một trong những thành tựu xuất sắc nhất của thế kỷ 20là khám phá ra phơng pháp tạo giống bằng cách gây đột biến thực nghiệm Với kết quảcủa hơn 60 nớc đã thu đợc chứng tỏ đây là phơng pháp có hiệu quả để tạo giống mới

Theo thống kê của Tổ chức lơng thực và Tổ chức năng lợng nguyên tử thế giới(FAO/IAEA) năm 1960 chỉ có 7 giống cây trồng đột biến, 1975 có 145 giống, 1992 có1530 giống, năm 1997 có 1870 giống Phần lớn các giống tạo ra là cây ngũ cốc nh: lúa,lúa mì, lúa mạch, ngô Các nớc tạo ra nhiều giống đột biến nh: Trung Quốc, ấn Độ,Nhật Bản, các nớc Liên Xô cũ [11].

Từ năm 1968, Việt Nam đã bắt đầu nghiên cứu chọn giống đột biến và đã thu đợckết quả đáng kể nh tạo ra các giống lúa A-20, DT10, DT-11, DT13, giống ngô DT-6, đậutơng DT84, DT-90 (Quý1997) Gần đây Nguyễn Minh Công và cộng sự đã tạo đợcgiống Tám thơm đột biến không cảm quang, có thể gieo cấy đợc cả hai vụ [2].

2.4 Chuyển gen ở thực vật và thành tựu trong cải tạo giống cây trồng 2.4.1 Các phơng pháp chuyển gen ở thực vật

Hiện nay có nhiều phơng pháp chuyển gen ở thực vật đã đợc nghiên cứu và thànhcông trên nhiều đối tợng cây trồng Những thành công chuyển gen đầu tiên đợc tiến hànhbằng các phơng pháp xung điện hay sử dụng polyethylene glycol Sử dụng súng bắn genđể chuyển các gen mong muốn vào mô sẹo cho tỷ lệ tái sinh cao đã thành công trong

chuyển gen vào phôi non bằng cách lây nhiễm với Agrobacterium [23, 24]

Hai phơng pháp chuyển gen thành công nhất là chuyển gen trực tiếp bằng súng

bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium:

- Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen: Đây là một trong những phơng pháp đa các

gen ngoại lai vào tế bào do Sanford, 1990 đa ra Phơng pháp này đợc áp dụng với những

đối tợng mà việc chuyển gen bằng Agrobacterium khó thực hiện đợc (do không mẫn cảmvới Agrobacterium) hay khả năng tái sinh kém (khi chuyển gen vào tế bào trần) [15] Ph-ơng pháp này đợc sử dụng rộng rãi sau phơng pháp chuyển gen qua Agrobacterium với

các u và nhợc điểm sau [16]:

+ Ưu điểm: Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô và tế bào, chuyển DNA ngoại

lai vào tế bào nhanh, dễ sử dụng với quy trình đơn giản, một số lợng lớn mẫu có thể đợcxử lý trong thời gian ngắn, các vecto đợc thiết kế đơn giản: không đòi hỏi các trình tự

DNA cho đoạn T-DNA nh chuyển gen bằng Agrobacterium, cần một lợng nhỏ plasmid

DNA, biểu hiện gen tạm thời có thể đợc quan sát sau vài ngày

+ Nhợc điểm: Nhiều bản sao vào tế bào cùng một lúc, gây khó khăn cho việc

phân tích chọn lọc về sau này, hiệu quả chuyển gen vẫn còn thấp, chi phí cao [23]

- Phơng pháp chuyển gen bằng Agrobacterium: Đây là phơng pháp chuyển gen đợc sử

dụng rộng rãi nhất, có hiệu quả cao với số bản copy chuyển vào tế bào thực vật thấp [30].

Phơng pháp chuyển gen bằng Agrobacterium thờng đợc dùng cho các loại cây hai lámầm vì Agrobacterium mẫn cảm với các loại cây này Tuy nhiên, ngày nay ngời ta đãtìm ra các chủng Agrobacterium mẫn cảm với cây một lá mầm trong đó có ngô, lúa vàcác cây chuyển gen hữu thụ đã nhận đợc [21, 23] Chuyển gen bằng Agrobacterium đã đ-

ợc nghiên cứu thành công bởi nhiều tác giả, các yếu tố ảnh hởng tới hiệu quả chuyển gen

đã đợc tối u hoá nh chủng Agrobacterium, kiểu gen của từng loài, giống, thành phần môi

trờng nuôi cấy, nhiệt độ ) [24].

Một nghiên cứu gần đây ở đậu tơng đã kết hợp hai phơng pháp dùng súng bắn gen

và Agrobacterium: trớc khi lây nhiễm mô bằng Agrobacterium mô đợc làm bị thơng bằng

cách “bắn” đạn không mang gen Phơng pháp này có thể cho hiệu quả lây nhiễm cao, bởisau khi bị “bắn” mô tạo phản ứng đối với vết thơng, tạo điều kiện cho lây nhiễm bằng

Gibberellin đợc tổng hợp ở trong các cơ quan đang sinh trởng nh hạt nảy mầm, lá non, quả non trong đó sự tổng hợp mạnh nhất là ở tế bào lục lạp GA đợc tổng hợp từ mevalonat qua hàng loạt các phản ứng dẫn đến hợp chất trung gian quan trọng là kaurent cơ sở của tất cả các GA trong cây.

Vai trò sinh lý của GA đã đợc nghiên cứu trên nhiều đối tợng GA kích thích sựnảy mầm của hạt và củ, kích thích sự ra hoa và phân hoá giới tính, làm tăng kích thớc quảvà tạo quả không hạt.

Hiệu quả sinh lý rõ rệt nhất của GA là kích thích mạnh mẽ sự sinh trởng kéo dài của thân, sự vơn dài của lóng cây họ lúa do kích thích đặc trng của GA lên pha giãn tế bào theo chiều dọc [12].

2.4.2.2 ứng dụng chuyển gen ức chế tổng hợp Gibberellin

Những nghiên cứu gần đây cho thấy quá trình tổng hợp và điều hoà hoạt động củaGA là do gen qui định Các nghiên cứu về trao đổi chất di truyền của GA đã khẳng địnhrằng các đột biến lùn của một số thực vật nh ngô, đậu Hà lan (chiều cao cây chỉ bằngkhoảng 20% chiều cao cây bình thờng) là các đột biến gen đơn giản, dẫn đến sự thiếu hụtcác enzym trên con đờng tổng hợp GA mà cây không thể hình thành đợc GA Với nhữngđột biến này thì việc bổ sung GA ngoại sinh sẽ làm cho cây sinh trởng bình thờng [12].

Theo thông báo của Goodman ở cây A thaliana gen GA2 nằm trên nhiễm sắc thể

số 1 và có chiều dài là 2506 base [32], khi GA2 bị đột biến thì thiếu sự tổng hợp của chấttrung gian ent-kaurent B dẫn đến làm thay đổi hoạt động của enzym để chuyển từCopalyl pyrophosphate sang ent-kaurene ở giai đoạn đầu của quá trình sinh tổng hợp GA.

Theo Meier C và CS (2001) ở cây A thaliana còn có gen lùn đột biến - lue1, gen này

6

cũng nằm trên nhiễm sắc thể số 1 và gần vị trí của gen GA2, cây có gen lùn đột biến lue1

có chiều cao chỉ bằng 30% so với cây đối chứng và các chồi thứ cấp cũng bị giảm.Nghiên cứu gần đây đã thành công chuyển gen ức chế hoạt động của GA2-oxidase

(AtGA2-ox) ở cây A thalinia, cây đợc chuyển gen AtGA2-ox có chiều cao cây thấp hơn

hẳn so với đối chứng [29].

Hahn và CS [2000] nghiên cứu ở lúa có gen nửa lùn Sd-1 nằm trên nhiễm sắc thểsố 1, Sd-1 là gen đơn lặn làm giảm chiều cao cây lúa và đợc sử dụng rộng rãi để tăng khảnăng chống đổ, nâng cao năng suất

2.4.3 Các thành tựu của chuyển gen tạo giống cây trồng

Ngày nay kỹ thuật chuyển gen đã đợc áp dụng rộng rãi trong việc chuyển các genhữu ích vào các giống cây trồng, đặc biệt là các cây 2 lá mầm Lợi nhuận thu đợc từ trồnggiống ngô chuyển gen Bt tăng 99 triệu USD và tiết kiệm đợc 216 triệu USD do giảm chiphí thuốc diệt cỏ và thuốc trừ sâu khi trồng đậu tơng Roundup ready và bông Bt (Nguồn:

Trung tâm chính sách Nông nghiệp thực phẩm 01/2001)

Tính đến năm 1996 đã có khoảng 2000 dòng cây chuyển gen khác nhau đã đợctạo ra ở Mỹ, 250 dòng cây chuyển gen đợc tạo ra ở châu Âu, trong đó có 1030giống/dòng ngô, 325 giống/dòng cà chua, 279 giống/dòng đậu tơng, 265 giống/dòngkhoai tây và 193 giống/dòng bông Trong số các cây đợc tạo ra bằng con đờng chuyểngen này có 761 giống/dòng cây kháng thuốc diệt cỏ, 252 dòng kháng virus, 676 dòngkháng côn trùng, 106 dòng kháng bệnh, 738 dòng mang tính trạng chất lợng và 199 dòng

mang các tính trạng khác (Nguồn: Transgene Nutzpflanzen, 1999)

Trên thế giới các giống cây chuyển gen đợc trồng trên diện tích 44,2 triệu ha vào năm2000, chiếm 16% tổng diện tích các cây trồng chính ở các nớc đang phát triển, diện tíchkhảo nghiệm các giống chuyển gen chiếm 15% tổng diện tích trồng cây chuyển gen Diện tích trồng các cây chuyển gen dự kiến sẽ tiếp tục tăng trong thời gian tới.

Các nớc trồng cây chuyển gen chính là Mỹ, Argentina, Canada và Trung quốc.Mỹ là nớc công nghiệp đầu tiên cho phép sản xuất cây chuyển gen làm thức ăn vào năm

1994 với giống/dòng cà chua mang gen chín chậm Flavr-SavrTM Tiếp theo đó các cây

chuyển gen đã đợc trồng trên quy mô lớn vào năm 1996

Trung quốc là nớc đầu tiên thơng mại hoá cây chuyển gen vào những năm đầu củathập kỷ 90 với các giống thuốc lá, khoai tây kháng virus và các giống bông chuyển genBt kháng sâu Tính đến năm 1999 Trung Quốc đã trồng đợc 2,0 triệu ha các giống bôngchuyển gen Bt và 8 giống bông đã đợc thơng mại hoá.

(Nguồn: Transgene Nutzpflanzen, 1999)

3 Mục đích của luận án

- Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào kết hợp với đột biến thực nghiệm để chọn tạo ra các dòng lúa thấp cây.

- Xây dựng qui trình chuyển gen hạ thấp chiều cao cây ở lúa.- Thu đợc các dòng cây chuyển gen hạ thấp chiều cao cây

4 Điểm mới của luận án

Đây là công trình nghiên cứu sử dụng kết hợp giữa công nghệ tế bào thực vật, đột biến mô sẹo lúa và phơng pháp chuyển gen để hạ thấp chiều cao cây của các giống lúa chất lợng cao.

5 Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu5.1 Vật liệu

- Các giống lúa đặc sản của Việt Nam: Tám xoan, Tám ấp bẹ, Dự thơm, Tẻ di hơng, doTrung tâm tài nguyên di truyền thực vật, Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt namcung cấp.

- Vector pCAMBIA1301 và Promoto 35S do tổ chức CAMBIA, australia cung cấp.

- Các hoá chất, enzim sử dụng của các hãng Sigma, Biolab, Invitrogen

- Tạo cây hoàn chỉnh và đa ra đồng ruộng

- Chuyển gen

- Kiểm tra sự có mặt của gen trong cây: PCR, lai Southern, lai Western

5.2.4 Phơng pháp nghiên cứu trên đồng ruộng

- Cây từ ống nghiệm đa ra ngoài đồng ruộng (thế hệ R0) đợc cấy 1 dảnh và đợc gọi là 1 dòng.Bông của mỗi dòng thu đợc đánh dấu và thu hoạch riêng để gieo trồng cho vụ tiếp theo.

- Theo dõi sự phát triển của các dòng chọn lọc qua các giai đoạn phát triển trong mỗi vụgieo trồng Phân tích các đột biến và thu nhận các dòng có các đột biên có lợi, đánh giácác chỉ tiêu nông sinh học của các dòng chọ lọc theo các chỉ tiêu nông sinh học:

- Chiều cao cây- Số bông trên khóm- Chiều dài bông- Số hạt chắc trên bông

8Kiểm tra

bằng kỹthuật sinhhọc phân tửChọn lọc

dòng utú và khảo

chọn lọctrên đồng

cây(1) Xử lý độtbiến

(2) Chuyển gen

lúachín

- Chiều dài hạt- Chiều rộng hạt- Trọng lợng 1000 hạt- Thời gian sinh trởng

- Đặc điểm hình thái của bộ lá và lá đòng- Khả năng chống đổ

5.2.5 Phơng pháp đánh giá tính đa hình DNA

- Tách DNA tổng số từ lá

- Xác định hàm lợng và độ sạch DNA- So sánh RAPD và phân tích số liệu RAPD

5.3 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

- Các máy móc, thiết bị chuyên dụng cho nuôi cấy mô và nghiên cứu sinh học phân tử của phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng máy chung thuộc Viện Công nghệ sinh học nh máy PCR, máy điện di, máy ly tâm, máy đo quang phổ

6 Nội dung nghiên cứu

+ Chọn dòng đột biến:

- Thu thập và nhân hạt giống gốc để làm nguyên liệu

- Xây dựng hệ thống tạo mô sẹo và tái sinh tối u đối với các giống lúa Tám.- Xác định liều lợng chiếu xạ đối với mô sẹo lúa bằng tia Gamma Co60

- Xác định sự đa dạng di truyền của các giống lúa Tám thơm và các dòng chọn lọcbằng kỹ thuật RAPD

- Xử lý đột biến mô sẹo, tái sinh cây

- Trồng và theo dõi các dòng thu đợc trên đồng ruộng- Phân tích các đột biến của các dòng thu đợc

- Chọn lọc các dòng đột biến thấp cây và đa trồng thử nghiệm.+ Chuyển gen:

+ Tách dòng gen atGA+ Xác định trình tự gen atGA

+ Thiết kế cấu trúc gen (đoạn khởi động+ gen cấu trúc (atGA) + đoạn kết thúc)+ Đa cấu trúc (đoạn khởi động+ gen cấu trúc (atGA) + đoạn kết thúc) vào vector chuyển gen

+ Chuyển gen atGA vào mô sẹo lúa

- Kiểm tra sự có mặt của gen trong cây: PCR, lai Southern, lai Western - Trồng và theo dõi các dòng cây chuyển gen trong nhà lới

7 Dự kiến sơ bộ về việc thực hiện đề tài7.1 Nơi thực hiện đề tài

Tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học Kết hợp với mộtsố cơ quan khác: Trại thí nghiệm của Viện CNSH, Trung tâm chiếu xạ quốc gia - TừLiêm, Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống cây trồng trung ơng

10