Đây cũng là một trong những giai đoạn quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro được nuôi trong điều kiện ổn định về nguồn dinh dưỡng, ánh sánh, nhiệt độ… Khi chuyển ra ngoài môi trường tự nhiên hoàn toàn khác cây nên con dễ bị chết do mất nước, nhiệt độ cao… Vì thế ta phải tiến hành làm cho cây con thích nghi dần với điều kiện ngoài tự nhiên. Quá trình thích nghi là sự thay đổi những đặc điểm sinh lý và hình thái của cây. Thời gian tối thiểu để cây con có thể thích nghi được với điều kiện bên ngoài là khoảng 2-3 tuần. Trong thời gian này cây con cần được chăm sóc và bảo vệ cẩn thận
Tiến hành trồng trong bầu chúng tôi thử nghiệm trên năm loại giá thể khác nhau:
1. Đất trồng cây
2. Đất trồng cây : Trấu hun 3. Cát đen
5. Trấu hun
Sau khi tạo được cây con hoàn chỉnh ta tiến hành trồng vào các loại giá thể trên. Các bầu này được cho vào các khay và được phủ kín bằng túi nilon trong 1 tuần đầu tiên, đặt nơi có ánh sáng khuyếch tán, thoáng mát, tưới đủ ẩm mỗi ngày để cây con dần thích nghi với điều kiện bên ngoài. Tỷ lệ cây con sống sau 1 tháng trên các loại giá thể khác nhau thu được ở bảng 10.
Bảng 10: Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ cây con sống
TT Công thức Tỷ lệ Số cây trồng Số cây sống Tỷ lệ Cây sống (%) 1 Đất trồng cây 1 40 26 65
2 Đất trồng cây : Trấu hun 1 : 1 40 30 75
3 Cát đen 1 40 34 85
4 Cát đen : Trấu hun 1 : 1 40 38 95
5 Trấu hun 1 40 18 45
Kết quả ở bảng 10 cho ta thấy rõ sự ảnh hưởng của các loại giá thể đến sự sống của cây con nuôi cấy invitro ngoài tự nhiên. Trong các loại giá thể trên thì giá thể trấu hun cho tỷ lệ cây sống thấp nhất là 45%. Còn trên giá thể Đất trồng cho tỷ lệ cây con sống cao hơn là 65%.
Trên giá thể Đất trồng cây : Trấu hun (1:1) và giá thể Cát đen có tỷ lệ cây con sống lần lượt là 75% và 85%. Riêng giá thể Cát đen : Trấu hun (1:1) có tỷ lệ cây con sống cao nhất là 95%. Cây con phát triển tốt, đồng đều.
Dựa vào kết quả trên chúng tôi lựa chọn giá thể thích hợp nhất để trồng cây con Ngưu tất ra ngoài môi trường tự nhiên là giá thể Cát
PHẦN 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận
- Bước đầu đã nhân giống thành công cây Ngưu tất bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Nồng độ khử trùng mẫu thích hợp là: dung dịch javen nồng độ 75%, trong khoảng 10 phút.
- Môi trường thích hợp nhất để tạo chồi cây Ngưu tất là: NTC4 (MS + 20g/ l đường Saccharose + 8g/l agar + 0,6mg/l BAP và 0,1mg/l NAA).
- Môi trường thích hợp để tạo rễ cây Ngưu tất là: NTH3 (MS + 20g/l đường saccharose + 8g/l agar + 0,4mg/l IBA và 0,1mg/l Kinetin).
- Giá thể thích hợp để trồng cây trong bầu là: Giá thể Cát đen : Trấu hun (1:1) với tỷ lệ cây con sống là 95%.
Tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện các điều kiện nuôi trồng cây Ngưu tất từ nuôi cấy in vitro ra ngoài môi trường tự nhiên để đạt hiệu quả kinh tế cao nhất.
PHỤ LỤC
Các thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)
Thành phần khoáng đa lượng Nồng độ (mg/l)
NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Thành phần khoáng vi lượng Nồng độ (mg/l) MnSO4.H2O 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2EDTA 37,3 FeSO47H2O 27,8 Vitamin Nồng độ (mg/l) Thiamin HCl 0,1 Nicotinic Axit 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glyxine 2,0
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội.
2. Nguyễn Thanh Danh, Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân (2005), Kết quả bước đầu nhân giống in vitro cây Vù hương bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt
xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học. Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, Hà Nội 03/11/2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 450-453.
3. Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
4. Huỳnh Văn Kéo, Ngô Viết Nhơn (2006), Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen thực vật ở vườn quốc gia Bạch Mã. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 1(2): 127-129.
5. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, NXB ĐH Quốc Gia TPHCM.
6. Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phục hồi loài gỗ quý Giá tỵ. Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 25-26/7/2003, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 352-357.
7. Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phục hồi loài cây đặc sản Trầm hương. Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 25-26/7/2003, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 358-361. 8. Hoàng Thị Nga (2011), Ứng dụng Công nghệ tế bào thực vật vào quy
trình nhân nhanh cây hoa Đồng tiền, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
9. Nguyễn Hoàng Nghĩa (1997), Bảo tồn nguồn gen cây trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội.
10.Nguyễn Thị Quỳnh, Phan Vũ Tiên, Trịnh Việt Nga (2003), Nuôi cấy mô quang tự dưỡng cây Lõi thọ (Gmelina arbrea Roxb). Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 25-26/7/2003, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 394-397.
11.Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương (2005), Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh cây Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp in vitro. Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, Hà Nội 3/11/2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 722-724.
12.Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXb Nông Nghiệp Hà Nội.
13.Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội
14.Nguyễn Văn Uyển (1996), Những phương Pháp công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông nghiệp TPHCM.
15.Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật và ứng dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
16.Vũ Văn Vụ, Vũ Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học (tập 2), NXB Giáo dục Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
17.Balaraju K, Agastian P, Preetamraj JP, Arokiyaraj S, Ignaciumthu S (2008), Micropropagation of Vitex agnuscatus (Verbenaceae) - Avaluable medicinal plant. In vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 44(5): 436-411.
18.Bedir E, Lata H, Schaneberg B, Khan IA, Morase RM (2003), Micropropagation of Hydrastis canadensis: Goldenseal a North American endangered species, Planta Med, 86-88.
19.Catherine AO, Joanne LT (1998), Tissue culture of Grevillea species at mount Annan Botanic Gardens. The Grevillea Book (1), Kangaroo Press, Sydney, Australia.
20.George EF (1993), Plant propagation by tissueculture, Exegetics Ltd, Edin. 21.Havens K, Guerrant E, Maunder M (1999), Strategies for survival: Ex
situ Plant conservation. Report of a research symposium held at the Chicago Botanic Garden, BG Journal, 3(3).
22.Joshi M, Dhar U (2003), In vitro propagation of Saussurea obvallata
Edgew - An endangered ethnoreligious medicinal herb of Himalaya. Plant Cell Rep, 21(10): 933-939.
23.Mukherjee A, Roy Chowdhury B (2008), The In vitro propagation of a high value medicinal plant: Asparagus racemosus wild. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 1(2): 116-119.
24.Murashige T, Skoog F (1962), A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol Plant, 15: 473-497.
25.Nandi SK, Kumar A, and Palni L M S (2002), Role of plant tisue culture in biodiversity conservation and economic development, Gyanodaya Prakashan. 26.Nishritha B, Sanjay S (2008), In vitro propagation of a high value
medicinal plant: Asparagus rasemosus Willd. In Vitro Cellular & Developmental Biology-plant, 44(6): 525-532.
27.Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), Improved in vitro plant regeneration and micropropagation of Rehmannia glutinosa L. Journal of Medicial Plants Research, 3(1): 031-034.
28.Pereira AM, Amui SF, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC (2003), Micropropagation of Anemopaegma arvense: Conservation of an endangered madicinal plant. Plant Med, 69(6): 571-573.
Tài liệu trên Internet:
29.http://www.caythuocquy.info.vn/modules.php? name=News&opcase=detailsnews&mid=1106&mcid=245&pid=&menu id. 30.http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Duoc%20lieu/Nguutat/Nguutat.htm. 31.http://www.thegioisuckhoe.com/y-hoc/y-hoc-dan-toc/nhung-cay-thuoc- mang-ten-nguu-tat. 32.http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=news&catid=8&pg=5.
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Xuân Đắc, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Xin chân thành cảm ơn Trung tâm nuôi cấy mô thực vật Thanh Hóa, Sở Khoa học và Công nghệ Thanh Hóa đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia chương trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Chu Hoàng Hà, Trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật, cùng toàn thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật và Trại Thực nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Đồng thời, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Công nghệ sinh học, Viện đại học Mở Hà Nội đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học tập.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên để tôi có tự tin trong học tập và nghiên cứu khoa học.
Hà Nội, tháng 5 năm 2011 Sinh viên
NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
2,4 D 2,4 - Dichlorophenoxy Axetic Axit ADN Axit Deoxyribonucleic
ARN Axit Ribonucleic
BAP 6 - Benzyl Amino Purin CTMT Công thức môi trường
cs Cộng sự
ĐC Đối chứng
IAA Indol - 3- Axetic Axit IBA 3 - Indol Butyric Axit
K Kinetin
KTST Kích thích sinh trưởng
MS Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog NAA α- Napthalen Axetic Axit
TB Trung bình
Bảng 1: Nồng độ BAP ảnh hưởng đến khả năng tạo chồi của cây Ngưu tất
32
Bảng 2: Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi của cây Ngưu tất
34
Bảng 3: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất
36
Bảng 4: Ảnh hưởng của Kinetin và NAA đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất
38
Bảng 5: Tổng hợp khả năng tạo chồi trên các loại môi trường 39 Bảng 6: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của cây Ngưu
tất
40
Bảng 7: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Ngưu tất
41
Bảng 8: Ảnh hưởng của IBA và Kinetin đến khả năng tạo rễ của cây Ngưu tất
42
Bảng 9: Ảnh hưởng của các chất kích thích lên quá trình tạo rễ của cây Ngưu tất
43
Bảng 10: Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ cây con sống 45
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1: Cây con vô trùng sau 25 ngày nuôi cấy 31 Hình 2: Tạo đa chồi cây Ngưu tất trên công thức môi trường
NTA3
Hình 3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất
33
Hình 4: Tạo chồi cây Ngưu tất trên công thức môi trường NTB4
34
Hình 5: Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất
35
Hình 6: Tạo chồi cây Ngưu tất trên công thức môi trường NTC4
36
Hình 7: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất
37
Hình 8: Tạo chồi cây Ngưu tất trên môi trường NTD3 38 Hình 9: Tạo rễ cây Ngưu tất trên môi trường NTE3 40 Hình 10: Tạo rễ cây Ngưu tất trên môi trường NTG2 41 Hình 11: Tạo rễ cây Ngưu tất trên công thức môi trường
NTH3
43
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU...1
PHẦN 1...3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU...3
1.1. Giới thiệu chung về cây Ngưu tất...3
1.1.1. Đặc điểm sinh học...3
1.1.2. Giá trị cây Ngưu tất...4
1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng...5
1.2.1. Lược sử phát triển...5
1.2.2. Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật...8
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro...8
1.2.4. Các phương pháp nhân giống in vitro...12
1.2.5. Phương pháp nhân đa chồi...15
1.2.6. Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật...16
1.3. Thành tựu và các phương pháp bảo tồn nguồn gen thực vật in vitro ...19
1.3.1 Thành tựu...19
1.3.2. Phương pháp bảo tồn thực vật quý hiếm...22
PHẦN 2...25
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...25
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu...25
2.2. Phương pháp nghiên cứu...25
2.2.1. Khử trùng mẫu...26
2.2.2. Nhân nhanh bằng phương pháp nhân đa chồi...26
2.2.3. Tạo cây Ngưu tất in vitro hoàn chỉnh...28
2.2.4. Trồng cây trong bầu...30
2.2.5. Thu thập và xử lý số liệu...31
Để đánh giá và tìm được môi trường tạo đa chồi, tái sinh cây tốt nhất chúng tôi sử dụng chỉ tiêu: Số chồi/mẫu...31
PHẦN 3...33
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...33
3.1. Tạo nguyên liệu vô trùng cây Ngưu tất...33
3.2. Tạo đa chồi...33
3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất...33
3.2.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất....35
3.2.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi cây Ngưu tất...36
3.2.4. Ảnh hưởng của Kineitn và NAA đến khả năng tạo chồi cây Ngưu tất...38
3.3.1. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của cây Ngưu
tất...40
3.3.3. Ảnh hưởng của tổ hợp IBA và Kinetin đến khả năng tạo rễ của cây Ngưu tất...42
3.4. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trồng trong bầu...43
PHẦN 4...45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...45
4.1. Kết luận...45
4.2. Đề nghị...45
PHỤ LỤC...47