Nghiên cứu phân lập các steroit từ cây ngưu tất (achyranthes bidentata)

Các nhà khoa học tiến hành nghiên cứu, tìm kiếm, tách chiết các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên bằng các phương pháp thử hoạt tính sinh học hiện đại đã tìm ra những chất có hoạt tính s

Trang 1

Đào Thị Thu Lan 1 K35C-Khoa Hóa Học

MỞ ĐẦU

Lãnh thổ Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có khí hậu

nóng ẩm, mưa nhiều, độ ẩm cao (khoảng trên 80%), nên nước ta có hệ thực

vật rất phong phú và đa dạng với khoảng 13000 loài thực vật bậc cao có

mạch; trong đó có tới hơn 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược

Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá và có ý nghĩa to lớn cho

sự phát triển của ngành y tế, ngành hóa học và một số ngành khác Là nguồn

tài nguyên có thể tái sinh được và hệ thực vật phong phú đã tạo tiền đề quan

trọng cho sự phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta

Hiện nay, với sự phát triển mạnh mẽ của nền y học, các sản phẩm có

nguồn gốc từ thiên nhiên có vai trò quan trọng trong việc phát hiện và phát

triển các dược phẩm mới và làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp như

công nghiệp thực phẩm, chất bảo vệ thực vật… do đặc tính ít độc, ít tác dụng

phụ và không làm ảnh hưởng tới môi trường

Các nhà khoa học tiến hành nghiên cứu, tìm kiếm, tách chiết các hợp

chất có nguồn gốc thiên nhiên bằng các phương pháp thử hoạt tính sinh học

hiện đại đã tìm ra những chất có hoạt tính sinh học và chuyển hóa chúng

thành những hoạt chất có khả năng trị bệnh rất cao có ứng dụng trong y học,

nông nghiệp và các ngành khác phục vụ cho đời sống của con người

Cây Ngưu tất (Achyranthes bidentata Blume) thuộc họ Rau dền

(Amaranthaceae), là một cây đã được sử dụng từ lâu trong dân gian để làm

thuốc chữa một số bệnh như: trị cổ họng sưng đau, ung nhọt, chấn thương tụ

máu, bế kinh, trị đau lưng, mỏi gối, chân tay co quắp hoặc bại liệt… Trong y

học cổ truyền, rễ Ngưu tất được dùng làm thuốc phục hồi sức lực, lợi tiểu,

chữa bế kinh, đau kinh, tăng huyết áp, thấp khớp, sỏi đường tiết niệu, viêm

họng, viêm amiđan Đây là cây thuốc quý, cần được nghiên cứu để giải thích

tác dụng chữa bệnh của cây, tạo cơ sở để tìm kiếm dược phẩm điều trị bệnh

Trang 2

Trên cơ sở kiến thức của y học cổ truyền và các nghiên cứu của các nhà

khoa học về hoạt tính sinh học của cây Ngưu tất… cây thuốc này đã được lựa

chọn làm đối tượng nghiên cứu Mục đích của khóa luận là “Nghiên cứu

thành phần steroid từ cây Ngưu tất – Achyranthes bidentata Blume” để

tìm tác dụng của cây

Luận văn này nghiên cứu thành phần steroid của cây Ngưu tất, bao gồm

những nội dung chính sau:

1 Thu mẫu cây Ngưu tất (Achyranthes bidentata), xử lí mẫu và tạo dịch

chiết metanol

2 Tách chiết các hợp chất Steroid

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã tách chiết được

Trang 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây Ngưu Tất [1]

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Achyranthes bidentata Blume

Tên tiếng việt: Ngưu tất

Ngoài ra cây còn có tên: Hoài Ngưu tất, Ngưu tất bắc

lục hoặc màu tía Cành thường mọc

hướng lên gần như thẳng đứng

Lá mọc đối, hình bầu dục hoặc hình

mác, dài 5 – 10 cm, rộng 1 – 4 cm,

gốc thuôn hẹp, đầu rất nhọn, hai mặt

nhẵn, mép nguyên đôi khi uốn lượn,

gân lá mặt trên thường có màu tía;

cuống dài 1 – 1,5 cm

Hình 1.1.1 Cây Ngưu tất

(Achyranthes bidentata Blume)

Cụm hoa mọc ở ngọn thân và kẽ lá đầu cành thành bông; dài 2 – 5 cm;

hoa thường gấp xuống, sát vào cuống của cụm hoa; lá bắc dài 3 mm, lá dài 5,

gần bằng nhau; nhị 5, chỉ nhị đính với nhau và đính với cả nhị lép; nhị lép có

răng rất nhỏ; bao quanh phấn hình mắt chim; bầu hình trứng

Quả hình bầu dục, có 1 hạt

Mùa hoa quả: tháng 5 – 7

1.1.2 Phân bố, sinh thái

Trang 4

Ngưu tất có nguồn gốc ở Trung Quốc hoặc Nhật Bản Cây được thuần

hóa và trồng từ lâu đời ở những nước này Ngưu tất được nhập từ Trung Quốc

vào Việt Nam, năm 1960 Lúc đầu, cây được trồng để thuần hóa ở Sa Pa, sau

đó chuyển sang Sìn Hồ (Lai Châu) rồi về trại thuốc Tam Đảo (Vĩnh Phúc) và

trại thuốc Văn Điển (Hà Nội) cách đây khoảng 30 năm

Ngưu tất đã được trồng dưới dạng sản xuất dược liệu ở vùng ngoại

thành Hà Nội và các tỉnh thuộc đồng bằng Bắc Bộ Có thể coi Ngưu tất là một

ví dụ điển hình về một cây thuốc có nguồn gốc ôn đới, qua quá trình nghiên

cứu di thực đã có thể trồng thành công cả ở vùng đồng bằng có khí hậu nhiệt

đới gió mùa Điều đó cho thấy Ngưu tất là cây có biên độ sinh thái tương đối

rộng, mặc dù thời vụ trồng chủ yếu vẫn ở thời kì có biên độ thấp trong năm

1.1.3 Bộ phận dùng

Rễ thu hái khi phần trên mặt đất tàn lụi Loại bỏ rễ con, rửa sạch rồi

phơi sấy khô Có thể dùng ở dạng sống (cách này thường dùng) hoặc tẩm

rượu hoặc muối tùy theo từng trường hợp, rồi phơi hay sấy khô

1.1.4 Thành phần hóa học

Các công trình nghiên cứu đã được công bố cho thấy: Thành phần hóa

học chính của cây Ngưu tất là các hợp chất steroid dạng khung ecdysterol và

các hợp chất oleanan saponin

Năm 2007, một hợp chất ecdysteroit mới là (20R, 22R)-2β, 3β, 20, 22,

26-pentahydroxy-cholestan-7,12-dien-6-one được công bố từ cây ngưu tất [2]

Đến năm 2011, ba hợp chất ecdysteroit mới là niuxixinsterone A-C tiếp

tục được công bố từ loài này [3] Gần đây nhất, hai hợp chất mới là (25S)-20,

22-O-(R-ethylidene)inokosterone và

20,(R-3-methoxycarbonyl)-propylidene-20-hydroxyecdysone cùng với sáu hợp chất đã biết là 20,

22-O-(R-ethylidene)-20-hydroxyecdysone,

Trang 5

20-hydroxyecdysone-20,22-Đào Thị Thu Lan 5 K35C-Khoa Hóa Học

monoacetonide, 20-hydroxyecdysone, (25R)-inokosterone và (25S)

inokosterone tiếp tục được công bố từ loài này vào năm 2012 [4]

Trang 6

Năm 2001, hai hợp chất tritecpen saponin mới là bidentatoside II và

chikusetsusaponin V methyl ester được công bố từ cây Ngưu tất [5] Đến năm

2005, năm hợp chất tritecpen saponin mới là ester tiếp tục được công bố từ

Gần đây, hai hợp chất saponin mới là sulfachyranthoside B và

sulfachyranthoside D cùng với achyranthoside D tiếp tục được công bố từ cây

này vào năm 2013 [7]

Trang 7

1.1.5 Tính vị, công năng

Ngưu tất có vị đắng chua, tính bình, không độc, vào hai kinh can và

thận Dạng sống có tác dụng hành huyết tán ứ, tiêu ung lợi thấp Dạng chín có

tác dụng bổ can, ích thận, cường gân tráng cốt

1.1.6 Công dụng

Ngưu tất dạng sống chữa cổ họng sưng đau, mụn nhọt, đái rát buốt,

đái ra máu hoặc sỏi, bế kinh, bụng dưới kết hòn cục, đẻ khó hoặc khi đẻ rau

thai không ra; sau khi đẻ ứ huyết gây đau bụng, chấn thương, ứ máu bầm,

đầu gối nhức mỏi

Ngưu tất sao tẩm chữa can thận hư, ù tai, đau lưng, mỏi gối, tay chân

co quắp hoặc bại liệt

Ngày dùng 6 – 12g, dạng thuốc sắc hoặc bột

Trang 8

Kiêng kỵ: Phụ nữ có thai, băng huyết không nên dùng Ngưu tất Trong

y học Trung Quốc, rễ Ngưu tất với liều 5 – 12g dưới dạng nước sắc được sử

dụng làm thuốc phục hồi sức lực, lợi tiểu, chữa bế kinh, đau kinh, tăng huyết

áp, thấp khớp, sỏi đường tiết liệu, viêm họng, viêm amiđan Ngoài ra nó còn

được dùng làm thuốc kích thích tình dục, tráng dương, chữa liệt dương, gây

sẩy thai Dùng ngoài, nước sắc 20% Ngưu tất chữa các bệnh về da chân và

các móng (bệnh nấm biểu bì) Hạt được dùng làm thuốc chống độc, chữa rắn

cắn, thấp khớp, hen phế quản (phối hợp với một số dược liệu khác) Phụ nữ

có thai không nên dùng

1.1.7 Một số bài thuốc từ cây Ngưu tất

 Chữa co giật, bại liệt, phong thấp teo cơ, xơ vữa mạch máu:

Ngưu tất 10 – 15g, sắc uống

 Chữa phong thấp, thấp khớp:

Ngưu tất 12g, hy thiêm 16g, thổ phục linh 16g, lá lốt 10g Dạng thuốc

viên, ngày uống 3 lần, mỗi lần 10 – 15g

 Chữa viêm đa khớp dạng thấp:

Ngưu tất 12g, độc hoạt 12g, tang ký sinh 12g, phòng phong 12g, tục

đoạn 12g, xuyên quy 10g, thục địa 12g, bạch thược 12g, đảng sân 12g, ý dĩ

12g, tần giao 10g, quế chi 8g, xuyên khung 8g, cam thảo 6g, tế tân 6g Sắc

uống ngày một thang

1.2 Tổng quan về Steroid [8], [9]

1.2.1 Giới thiệu chung

1.2.1.1 Khái niệm

Steroid là este phức tạp của rượu đa vòng sterol với các axit béo cao

phân tử, là một nhóm hợp chất tương tự nhau có trong động vật và thực vật

1.2.1.2 Cấu trúc khung cơ bản của Steroid

Trang 9

Steroid là những hợp chất có thể được coi như bộ khung cơ bản của 4

hệ vòng steran hay gonan: pehiđroxiclopentanophenatren

Pehiđroxiclopentanophenatren

Sườn này có 6 nguyên tử Cacbon bất đối ở các vị trí 5, 8, 9, 10, 13 và

14 Do đó có tối đa 26 = 64 đồng phân lập thể Tuy nhiên, vì lí do lập thể, chỉ

có vài kiểu dung hợp các vòng A và B, B và C, C và D, có thể tồn tại trong

các steroid thiên nhiên, nên tổng số đồng phân lý thuyết giảm đi rất nhiều; và

thường hay có nhóm metyl ở vị trí cis và C19

1.2.1.3 Tính chất của Steroid

Đa số các steroid khi đun nóng với Selen ở 3600C tạo ra hợp chất Diel

có công thức phân tử C18H16

3’ – metyl – 1, 2 – xiclopentanopenan Steroid còn được đĩnh nghĩa như bất kì một chất nào đó khi chưng cất

với Selen ở nhiệt độ cao sẽ cho được chất Hiđrocacbon Diel

1.2.1.4 Phân loại Steroid

Steroid có nhiều trong thiên nhiên và chúng tạo thành một nhóm hợp

chất phân phối rộng khắp Chúng gồm các loại quan trọng như:

 Sterol (cholesterol, ergosterol, vitamin D, strigmasterol)

1 2 3 4

5

8

9 10 11

12 13

16 17

Trang 10

 Hormon steroid (hormon giới tính, hormon vỏ tuyến thượng thận)

 Axit mật (axit cholic, axit chenodoxycholic,…)

 Ancaloit steroid (conesin, solanidin,…)

 Glucozit trợ tim (digitoxigenin, stophantidin)

Do tác dụng sinh lí của steroid nên nó không những là mối quan tâm

khoa học quan trọng mà còn có ý nghĩa quan trọng trong việc sử dụng dược

học

1.2.2 Một số steroid cơ bản

1.2.2.1 Sterol

Sterol còn được gọi là rượu steroid; có trong mỡ động vật và dầu thực

vật, là những chất kết tinh Trong phân tử chỉ chứa chức ancol

Sterol tồn tại ở dạng tự do hoặc dạng este với các axit béo cao phân tử

Khung cơ bản của sterol:

- Nhóm sterol thực vật (phytosterol): ergosterol, stigmasterol

- Nhóm sterol được tạc ra từ nấm, mốc gọi là sterol vi sinh

a Cholesterol

Cholesterol là một chất có dạng sáp màu trắng, được tìm thấy trong một

số thức ăn của chúng ta Nó được sản sinh ra bởi tất cả các tế bào của cơ thể,

1 2 3

4 5 6 7

8 9

10

11 12 13

16 17

Trang 11

nhưng đáng kể nhất là tế bào gan Một số cholesterol là tối thiểu cần thiết cho

sức khỏe tốt Cholesterol không chỉ là thành phần quan trọng trong các tế bào,

nó cũng còn là thiết yếu trong việc tạo ra một số hormon nhất định Đối với

hầu hết mọi người thì khoảng 70% - 75% cholesterol trong máu được sản sinh

bởi tế bào gan, từ 25% - 30% còn lại được lấy từ thực phẩm ăn vào

Tuy nhiên, việc có quá nhiều cholesterol trong máu lại gây xơ vữa động

mạch và có thể gây tai biến chết người Người có hàm lượng cholesterol trong

máu cao thường có nguy cơ đau tim hơn những người bình thường và thấp

Cao cholesterol có thể do di truyền, nhưng thường ngăn ngừa và điều trị được

 Khái quát về Cholesterol

Thuật ngữ tên gọi này có nguồn gốc từ chữ Latinh “chole” là mật Lần

đầu tiên cholesterol được tách ra từ sỏi mật (sỏi mật chứa 90% là cholesterol)

Cholesterol có nhiều trong mô bào động vật như ở mật, máu, não, sữa,

cơ quan sinh dục nam nữ

Trong tự nhiên, cholesterol ở dạng tự do hay đã este hóa (cholesterid)

với axit béo

Ở thực vật, cholesterol có hàm lượng thấp hơn, thường có trong rong

đỏ, vỏ chanh, khoai tây, lá mầm đậu nành, dầu đậu nành, tảo,…

Công thức phân tử: C27H46O

Công thức cấu tạo: Cấu dạng

11 12 13

14 15 16 17 18

Trang 12

 Vai trò của Cholesterol

- Giữ vai trò quan trọng trong sự hình thành cấu trúc tế bào và các kích

thích tố (hormon)

- Cholesterol kém tan trong nước, nó không thể tan và di chuyển ở dạng

tự do trong máu Thay vào đó, nó được vận chuyển trong máu bởi các

lipoprotein, đó là các vali-phân tử tan trong nước và bên trong mang theo

cholesterreol và mỡ

- Các protein tham gia cấu tạo bề mặt của mỗi loại hạt lipoprotein quy

định cholesterol sẽ được lấy khỏi tế bào nào và sẽ được cung cấp cho nơi đâu

Hai phần tử quan trọng là:

+ Lipoprotein có mật độ thấp (LDL): chuyên chở phần lớn lượng

cholesterol có trong máu, cung cấp cholesterol cho tế bào, nó là cholesterol có

ảnh hưởng xấu đến con người

+ Lipoprotein có mật độ cao (HLP): được tổng hợp và chuyển hóa ở

gan và ruột, có tác dụng tốt cho sức khỏe, do nó vận chuyển cholesterol về

gan để bài tiết ra ngoài

 Tổng hợp cholesterol:

Có thể chia 3 giai đoạn chủ yếu sau:

- Giai đoạn chuyển Axetyl-Coenzim A thành axit mevalonic

- Giai đoạn tổng hợp squalen

- Giai đoạn chuyển squalen thành cholesterol

b Vitamin D

 Công thức và tính chất:

- Là dẫn xuất của sterol, trong cơ thể mới đầu là provitamin D và khi

được chiếu sáng bằng tia tử ngoại sẽ trở thành vitamin D

- Vitamin D có nhiều trong dầu, gan, cá biển, lòng đỏ trứng, dầu thực

vật, rau xanh

Trang 13

Hai vitamin quan trọng nhất là: vitamin D2, vitamin D

 Tác dụng của vitamin D:

- Tăng cường sự hấp thu canxi và photpho ở màng ruột

- Điều chỉnh photphat của thận

- Thiếu vitamin D gây nên bệnh còi xương ở trẻ em và bệnh loãng

xương ở người lớn

c Một số sterol khác

 Ergosterol:

- Chất này có trong nấm, lá, quả và rễ của nhiều loại cây

- Công thức phân tử: C28H44O

Công thức cấu tạo: Cấu dạng:

Trang 14

- Là sterol thực vật, cô lập từ dầu đậu nành và nhiều loại thực vật khác

- Công thức phân tử: C29H48O

Công thức cấu tạo: Cấu dạng:

1.2.2.2 Axit mật

a Khái quát:

- Axit mật có trong túi mật của động vật, hình thành bởi sự oxi hóa

cholesterol

- Axit mật thường ở dạng amit của axit cholic, axit allocholic với glyxin

(NH2-CH2-COOH) hoặc với taurin (NH2-CH2-CH2SO3H)

- Các axit mật thường được giữ lại trong cơ thể dạng phức mật tự do và

tiếp tục tham gia tạo phức với các axit hữu cơ có ở thành ruột

- Chức năng quan trọng của axit mật: tiêu thụ dầu mỡ Chúng tồn tại

dưới dạng muối kiềm, có chức năng nhũ hóa để chất béo thấm vào thành ruột

b Các axit mật thường gặp

 Axit cholic:

- Axit cholic là một axit mật, không màu, trong suốt, không tan trong

nước (tan trong cồn và trong axit axetic), nhiệt độ nóng chảy 200-2010C

- Trong mật cũng như trong ruột tồn tại một lượng axit cholic tự do, do

sự thủy phân glycocholic và taurocholic dưới tác dụng của vi khuẩn

HO

C 10 H 19

HO

Trang 15

 Axit chenodeoxycholic:

- Axit chenodeoxycholic trong suốt,

không tan trong nước (tan trong cồn và trong

axit axetic)

- Axit chenodeoxycholic được tổng hợp

từ cholesterol

- Muối của nó được gọi là chenodeoxycholates

- Axit chenodeoxycholic và axit cholic là những axit mật quan trọng

nhất của con người

 Axit deoxycholic:

- Axit deoxycholic hòa tan được

trong cồn và axit axetic Nó ở dạng tinh

khiết, không màu trong suốt

- Trong cơ thể, chúng có tác dụng

nhũ tương hóa, được ứng dụng làm thuốc

thông mật, ngăn ngừa, hòa tan sỏi mật

H

Trang 16

Cấu trúc: trong phân tử nhóm setrogen có 1 vòng benzen, chứa nhóm

OH axit, chứa xeton và 1 nhóm metyl

Các chất tiêu biểu thuộc nhóm này như: estron, estrion, estradiol

+ Estron:

Công thức phân tử: C18H22O2

Công thức cấu tạo:

Phân bố ở hầu hết các cơ quan của cơ thể

+ Estrion:

+ Estradiol:

 estradiol  estradiol

18

HO

1 2

3 4

5 6 7 8 9 10

Trang 17

- Estradiol được phân bố rộng ở khắp nơi trong cơ thể, estradiol chuyển

hóa nhiều ở gan, bài tiết qua nước tiểu, một lượng nhỏ qua phân

- Sự giảm estradiol gây rối loạn quá trình điều nhiệt

 Progesteron:

Progesteron có bản chất hóa học là hợp chất steroid được tổng hợp từ

cholesterol hoặc từ axetyl-coenzim A

 Hormon sinh dục nam: được gọi với tên chung là androgen, gồm:

andosterol, testosterol, dehydroepiandosteron, dehydrotestosteron

 Andosterol:

 Testosterol:

b Hormon tuyến thượng thận:

- Hormon vỏ thượng thận costicosteroid có 21 cacbon, phân tử có một

Trang 18

- Các hormon này điều tiết sự trao đổi chất khoáng, nước, gluxit trong

cơ thể

- Các chất tiêu biểu của nhóm này là: hydrocortizon và coztizon

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT MẪU THỰC VẬT [10]

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng

chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có

độ phân cực trung bình…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.3.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực

khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan

tâm Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn

thận

Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá

thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng

với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc

Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả

và chất lượng của quá trình chiết Vì vậy những dung môi này nên được

chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Thường có một số chất

dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và

tributylphosphat Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình

sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút

đậy bằng nhựa

O

O OH

Hydrocortizon

O

O OH

Cortizon

Trang 19

Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat

[di-(2-etylhexyl)-phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-[di-(2-etylhexyl)-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân

lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử

nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chlrofrom, metylen

clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình

chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…

Những tạp chất của chlorofrom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản

ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản

phẩm khác Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl)

cũng có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các

hợp chất khác Chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi

làm việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát

và phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn

chlorofrom

Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các

hiđrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ

thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ

thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại, khả năng phân cực

của chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các

ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất

phân cực trung bình và thấp Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này

cũng bị hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có những

đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng

methanol trong suốt quá trình chiết Thí dụ trechlonolide A thu được từ

trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình

Trang 20

phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum

novogranatense được chiết trong methanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà

thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol

Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ

bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ

nổ Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không có

khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Tiếp đến là axeton cũng có thể

tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quá trình

chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân

tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo

thành những sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp

trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp

cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình

tạo thành chất mong muốn

Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ

không quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt

độ cao hơn

1.3.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi

nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và

Trang 21

thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy

để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dung

môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn Trước

đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể

dùng bình thuỷ tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương

pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết

khoảng 24 giờ rồi chất chiết được lấy ra Thông thường quá trình chiết một

mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa

những chất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một

vài cách khác nhau

Ví dụ:

- Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất

này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân

Đragendroff và tác nhân Maye

- Các flavonoid thường là những hợp chất màu Vì vậy, khi dịch chiết

chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn

chiết

- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra

và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá

trình chiết

- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde

có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với

aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể

biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn

dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu

Trang 22

quả cao Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của

các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết

1.4 Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ [10]

Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phổ biến

và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các

hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí

Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự

khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai

pha: pha động và pha tĩnh

Sắc kí gồm có pha động và pha tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất

của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…)

Phương pháp sắc kí dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các

chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh Nguyên nhân

của sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau

hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở

pha tĩnh

Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh

Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh

này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp

phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn

qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này Nhờ đặc

điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa

pha động và pha tĩnh Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ

Trang 23

thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch

(hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc kí

Trong phương pháp sắc kí: pha động là các chất ở trạng thái khí hay

lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn

 Theo bản chất của hai pha sử dụng

+ Pha động là chất khí: thí dụ trong kỹ thuật sắc ký khí Trong truờng

hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vectơ

+ Pha động là chất lỏng: thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp

mỏng, sắc ký cột

 Phân loại sắc ký theo bản chất của hiện tựợng xảy ra trong quá trình phân

tách chất

- Sắc ký phân chia (partition chromatography)

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)

Trang 24

+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng

này đuợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn

- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography)

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí

+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ,

được nhồi trong một cái ống Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử

dụng là những hạt silica gel hoặc alumin

- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography)

+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng

+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học

là polymer nên gọi là hạt nhựa Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học

ở dạng ion Có hai loại hạt nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation

- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography), gel filtration

chromatography)

+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng

+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề

mặt có nhiều lỗ rỗng

- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)

+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong

cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị Một protein có ái lực

với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở

+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi

trong việc tinh sạch protein

- Sắc ký lỏng cao áp

+ Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký

cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể Bản thân vật liệu

tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tuơng tác

Trang 25

dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể Bởi vì cột được làm từ vật

liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ

chảy thích hợp

 Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration)

- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper thin – layer chromatography)

Trong sắc ký giấy:

+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos

+ Pha động: là chất lỏng

Trong sắc ký lớp mỏng

+ Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel, là loại

pha tĩnh với tính chất rất phân cực

+ Pha động: luôn luôn là chất lỏng

- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)

+ Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống

hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa

+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ Mẫu cần tách được đặt lên

trên bề mặt của pha tĩnh

+ Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột

 Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai

nhóm lớn: sắc kí lỏng và sắc kí khí

 Dựa vào cách tiến hành sắc kí, người ta chia sắc kí thành các nhóm nhỏ:

sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng

1.4.3.1 Sắc kí cột (C.C)

Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ

là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường

và pha đảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể

bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	1,49 MB