NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC FLAVONOID TỪ LOÀI BÙM BỤP Mallotus apelta (Lour.) Muell. – Arg.

Điều kiện tự nhiên và khí hậu đặc trưng và đa dạng giữa vùng miền, đã đem lại cho đất nước Việt Nam một hệ sinh thái thực vật phong phú. Bên cạnh đó, Việt Nam cũng là một trong những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiều loại thảo dược trong điều trị bệnh và tăng cường sức khoẻ. Theo các nhà khoa học, Việt Nam có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao. Trong đó, hơn 4.000 loài được sử dụng làm dược liệu và thuốc chữa bệnh 1. Vai trò của nguồn tài nguyên cây thuốc ngày càng được nâng cao do có tiềm năng to lớn trong việc nghiên cứu phát triển các loại thuốc trong điều trị bệnh. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), việc sử dụng các loại thuốc thảo dược truyền thống đã trở nên quan trọng hơn, ngay cả trong y học phương Tây 27. Hướng nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các cây thuốc truyền thống đang là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học quan tâm. Đó là những nghiên cứu cơ bản về xác định thành phần hóa học và tìm ra hoạt chất thể hiện hoạt tính tác dụng chữa bệnh và nâng cao sức khỏe con người. Cho đến nay, trên thế giới đã tìm ra nhiều hợp chất có nguồn gốc tự nhiên sử dụng làm thuốc để điều trị và nâng cao sức khỏe. Chi Ba bét (Mallotus) là một chi khá lớn, gồm khoảng 150 loài, phân bố tại các khu vực từ Ấn Độ, Sri Lanka đến các nước Đông Nam Á.Trên thế giới, một số loài thuộc chi Mallotus được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các loại bệnh khác nhau. Ở Trung Quốc, loài bục núi cao M. japonicus được sử dụng để chữa bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng và điều hòa các chức phận của bộ máy tiêu hóa nói chung. Loài bục trườn M. repandus được sử dụng tại Thái Lan để chữa bệnh viêm dạ dày, viêm đau gan, viêm đau khớp và chữa rắn độc cắn. Ở nước ta, loài bai bái M. contubernalis làm thuốc chữa các bệnh thấp khớp, u phong, mụn nhọt và ngứa...5. Các nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy các loài thuộc chi Mallotus chứa nhiều hợp chất nhóm flavonoid có hoạt tính tốt như: kháng nấm, kháng ký sinh trùng, gây độc tế bào, chống oxy hóa,…24. Xuất phát từ các cơ sở trên, việc nghiên cứu và khai thác các chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong lĩnh vực YDược từ các nguồn dược liệu ở Việt Nam là rất cần thiết và có ý nghĩa về mặt khoa học cũng như thực tiễn. Vì vậy, em đã lựa chọn loài M. apelta thuộc chi Mallotus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài: “Nghiên cứu phân lập các hợp chất flavonoid từ loài Bùm bụp Mallotus apelta (Lour.) Muell. –Arg.”. Với mục đích nghiên cứu thành phần 2 flavonoid có trong loài Bùm bụp và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã được phân lập. Nội dung của khóa luận tốt nghiệp bao gồm: 1. Chiết xuất, phân lập một số hợp chất flavonoid từ loài M. apelta bằng các phương pháp sắc ký; 2. Xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập được bằng các phương pháp vật lý và hóa học.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  NGUYỄN THỊ SINH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC FLAVONOID TỪ LỒI BÙM BỤP [Mallotus apelta (Lour.) Muell – Arg.] KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  NGUYỄN THỊ SINH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC FLAVONOID TỪ LOÀI BÙM BỤP [Mallotus apelta (Lour.) Muell – Arg.] KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH2015.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN XUÂN NHIỆM ThS HÀ THỊ THANH HƯƠNG HÀ NỘI- 2020 LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp hồn thành phịng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trong trình nghiên cứu, em nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô, nhà khoa học, bạn bè gia đình Em xin trân trọng bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển tập thể cán Viện quan tâm, ủng hộ to lớn tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dạy bảo em suốt trình học tập trường hồn thiện khóa luận Em xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành, cảm phục kính trọng tới PGS.TS Nguyễn Xuân Nhiệm ThS Hà Thị Thanh Hương - người Thầy tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Em trân trọng biết ơn sâu sắc tới tất người gia đình, bạn bè động viên, khích lệ giúp em q trình học tập làm khóa luận Trong q trình làm khóa luận tốt nghiệp này, cố gắng chắn cịn có thiếu sót Vì vậy, em kính mong nhận đóng góp ý kiến quý thầy, bạn để khóa luận em hồn chỉnh Em xin chân thành cảm cảm ơn! Hà Nội, tháng 06 năm 2020 Sinh viên Sinh Nguyễn Thị Sinh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu 13 Tiếng Anh Diễn giải C-NMR Carbon -13 nuclear resonance spectroscopy H-NMR magnetic Phổ cô ̣ng hưởng từ ̣t nhân carbon 13 Proton nuclear magnetic resonance Phổ cô ̣ng hưởng từ ̣t nhân spectroscopy proton Virut viêm gan B vịt D-HBV Duck hepatitis B virus DMSO Dimethyl sulfoxid ESI-MS Electrospray spectrum Glc Glucose HepG2 Hepatocyte carcinoma cell Tế bào ung thư gan HL-60 Human promyelocytic leukemia cell Tế bào ung thư máu người HMBC Heteronuclear correlation bond Phổ tương tác di ̣ ̣t nhân qua nhiề u liên kế t HSQC Heteronuclear correlation quantum Phổ tương tác di ̣ hạt nhân qua liên kế t IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm KB Human epidmoid carcinoma Tế bào ung thư biể u mô người ionization mass mutiple single Phở khối lượng ion hóa phun mù điê ̣n tử Kí hiệu KH NF-B Nuclear factor-kappa B ́ u tớ nhân kappa B MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu RP18 Reversed-phase C18 Pha đảo C18 RD Rhabdosarcoma Ung thư màng tim TLC Thin layer chromatography Sắ c ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………1 CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Giới thiệu chi Mallotus 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Tình hình sử dụng y học cổ truyền loài thuộc chi Mallotus 1.2 Giới thiệu loài M apelta 1.2.1 Đặc điểm thực vật 1.2.2 Sinh thái phân bố 1.2.3 Thành phần hóa học 1.2.3.1 Các hợp chất diterpen 1.2.3.2 Các hợp chất coumarinolignoid 1.2.3.3 Các hợp chất benzopyran .8 1.2.3.4 Các hợp chất flavonoid 11 1.2.3.5 Các hợp chất alcaloid 12 1.2.3.6 Các hợp chất steroid 12 1.2.3.7 Các hợp chất triterpenoid 13 1.2.4 Tác dụng sinh học 14 1.2.4.1 Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư .14 1.2.4.2 Hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn 15 1.2.4.3 Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, ức chế miến dịch 15 1.2.5 Công dụng 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Mẫu thực vật .17 2.2 Phương pháp nghiên cứu .17 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất 17 2.2.1.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 17 2.2.1.2 Sắc ký cột (CC) 17 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc 17 2.2.2.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 17 2.2.2.2 Điểm nóng chảy (Mp) 18 2.2.3 .Dụng cụ thiết bị tách chiết 18 2.2.4 Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc hóa học hợp chất 18 2.3 Hóa chất 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết chiết xuất phân lập hợp chất .20 3.1.1 Chiết xuất cao toàn phần phân đoạn 20 3.1.1 Phân lập hợp chất 20 3.2 Kết xác định cấu trúc hợp chất phân lập 21 3.2.1 Hợp chất MA1: Vitexin 21 3.2.2 Hợp chất MA2: apigenin-7-O-β-D-glucosid 23 3.2.3 Hợp chất MA3: apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid 25 3.3 Thảo luận kết 27 3.3.1 Vitexin……………………………………………………………………………… 27 3.3.2 Apigenin-7-O-β-D-glucosid 28 3.3.3 Apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Mallotus đặc hữu Việt Nam Bảng 1.2 Các hợp chất diterpen (1-5) từ loài M apelta Bảng 1.3 Các hợp chất coumarinolignoid (6-12) từ loài M apelta .7 Bảng 1.4 Các hợp chất benzopyran (13-24) từ loài M apelta .8 Bảng 1.5 Các hợp chất flavonoid (25-26) 11 Bảng 1.6 Các hợp chất alcaloid (27-28) .12 Bảng 1.7 Các hợp chất steroid (29-32) .12 Bảng 1.8 Các hợp chất triterpenoid (33-35) .13 Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR hợp chất MA1 hợp chất tham khảo .22 Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR chất MA2 chất tham khảo .24 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR chất MA3 chất tham khảo .25 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh lồi M apelta Hình 1.2 Cấu trúc hợp chất diterpen (1-5) .7 Hình 1.3 Cấu trúc hợp chất coumarinolignoid (6-12) .8 Hình 1.4 Cấu trúc hợp chất benzopyran (13-24) 11 Hình 1.5 Cấu trúc hợp chất flavonoid (25-26) .11 Hình 1.6 Cấu trúc hợp chất alcaloid (27-28) 12 Hình 1.7 Cấu trúc hợp chất steroid (29-32) 13 Hình 1.8 Cấu trúc hợp chất triterpenoid (33-35) 14 Hình 3.1 Sơ đồ chiết, phân lập hợp chất từ loài M apelta 21 Hình 3.2 Cấu trúc tương tác HMBC hợp chất MA1 22 Hình 3.3 Cấu trúc hóa học hợp chất MA2 24 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học hợp chất MA3 25 MỞ ĐẦU Điều kiện tự nhiên khí hậu đặc trưng đa dạng vùng miền, đem lại cho đất nước Việt Nam hệ sinh thái thực vật phong phú Bên cạnh đó, Việt Nam quốc gia có y học cở truyền lâu đời sử dụng nhiều loại thảo dược điều trị bệnh tăng cường sức khoẻ Theo nhà khoa học, Việt Nam có khoảng 12.000 lồi thực vật bậc cao Trong đó, 4.000 lồi sử dụng làm dược liệu thuốc chữa bệnh [1] Vai trò nguồn tài nguyên thuốc ngày nâng cao có tiềm to lớn việc nghiên cứu phát triển loại thuốc điều trị bệnh Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), việc sử dụng loại thuốc thảo dược truyền thống trở nên quan trọng hơn, y học phương Tây [27] Hướng nghiên cứu tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học từ thuốc truyền thống lĩnh vực nhiều nhà khoa học quan tâm Đó nghiên cứu xác định thành phần hóa học tìm hoạt chất thể hoạt tính tác dụng chữa bệnh nâng cao sức khỏe người Cho đến nay, giới tìm nhiều hợp chất có nguồn gốc tự nhiên sử dụng làm thuốc để điều trị nâng cao sức khỏe Chi Ba bét (Mallotus) chi lớn, gồm khoảng 150 loài, phân bố khu vực từ Ấn Độ, Sri Lanka đến nước Đơng Nam Á.Trên giới, số lồi thuộc chi Mallotus sử dụng y học cổ truyền để điều trị loại bệnh khác Ở Trung Quốc, loài bục núi cao M japonicus sử dụng để chữa bệnh viêm loét dày, tá tràng điều hòa chức phận máy tiêu hóa nói chung Lồi bục trườn M repandus sử dụng Thái Lan để chữa bệnh viêm dày, viêm đau gan, viêm đau khớp chữa rắn độc cắn Ở nước ta, loài bai bái M contubernalis làm thuốc chữa bệnh thấp khớp, u phong, mụn nhọt ngứa [5] Các nghiên cứu dược lý đại cho thấy loài thuộc chi Mallotus chứa nhiều hợp chất nhóm flavonoid có hoạt tính tốt như: kháng nấm, kháng ký sinh trùng, gây độc tế bào, chống oxy hóa,…[24] Xuất phát từ sở trên, việc nghiên cứu khai thác chất có hoạt tính sinh học ứng dụng lĩnh vực Y-Dược từ nguồn dược liệu Việt Nam cần thiết có ý nghĩa mặt khoa học thực tiễn Vì vậy, em lựa chọn lồi M apelta thuộc chi Mallotus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài: “Nghiên cứu phân lập hợp chất flavonoid từ loài Bùm bụp [Mallotus apelta (Lour.) Muell –Arg.]” Với mục đích nghiên cứu thành phần flavonoid có lồi Bùm bụp xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Nội dung khóa luận tốt nghiệp bao gồm: Chiết xuất, phân lập số hợp chất flavonoid từ loài M apelta phương pháp sắc ký; Xác định cấu trúc hợp chất phân lập phương pháp vật lý hóa học quan sát thấy tín hiệu proton anome δH 4,69 (1H, d, J =10,0 Hz, H-1'') gợi ý MA1 có mặt gốc đường Các proton cấu tử đường phát vùng tín hiệu δH 3,26 – 4,69 ppm Đặc biệt, giá trị số tương tác J proton gắn vào cacbon anome có giá trị cao (J =10,0 Hz) so với giá trị tương ứng trường hợp nối qua liên kết O-glycosid Điều gợi ý có mặt cấu tử đường nối C-C vào aglycon Trên phổ 13C-NMR MA1 xuất tín hiệu 21 nguyên tử cacbon Trong có tín hiệu δC 73,36 (C-1′′), 70,84 (C-2′′), 78,65 (C-3′′), 70,54 (C4′′), 81,80 (C-5′′), 61,28 (C-6′′) khẳng định có mặt gốc đường glucose tín hiệu 15 nguyên tử cacbon δC 163,92 (C-2), 102,41 (C-3), 182,04 (C-4), 160,38 (C5), 98,14 (C-6), 162,68 (C-7), 104,59 (C-8), 155,98 (C-9), 104,59 (C-10), 121,59 (C-1′), 129,00 (C-2′, 6′), 115,00 (C-3′, 5′), 161,3 (C-4′) thuộc vào khung flavonoid có vịng B para So sánh số liệu phở NMR MA1 với hợp chất vitexin [18] cho thấy tương đồng vị trí tương ứng Ngồi ra, việc ghi phổ HSQC HMBC thực để gán cách xác giá trị độ dịch chuyển hóa học vị trí tương ứng Tương tác HMBC H-1''glc với C-7, C-8 C-9 khẳng định có mặt liên kết C-C vị trí liên kết với C-8 Tương tác HMBC H-6 (δH 6,26) với C-8, C-10 tương tác H-3 (δH 6,76) với C-10, C-1' khẳng định có mặt nhóm hydroxyl C-5 C-7, nối đơi C2/C3 Thêm vào đó, tương tác HMBC rõ proton 5-OH (δH 13,15) với C-5 (δC 160,38) tương tác H-1''glc với C-9 (δC 155,98) khẳng định δC C-9 phải 155,98 C-5 phải 160,38 Từ liệu cho phép xác định hợp chất MA1 vitexin 3.2.2 Hợp chất MA2: apigenin-7-O-β-D-glucosid Chất bột vơ định hình màu vàng Nhiệt độ nóng chảy: tnc = 218 – 220 ˚C Công thức phân tử C21H20O10, M = 432 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.2 23 Hình 3.3 Cấu trúc hóa học hợp chất MA2 Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR chất MA2 chất tham khảo # C δC 164.2 δC a,b a,c δH (Mult, J = Hz) 164.3 - 103.0 103.0 6.84 (1H, s) 181.6 182.0 - 161.0 161.6 - 99.6 99.6 6.43 (1H, d, 1.5) 162.8 162.9 - 94.9 94.9 6.82 (1H, d, 1.5) 156.8 156.9 - 10 105.3 105.3 - 1′ 121.1 120.9 - 2′, 6′ 128.1 128.6 7.94 (1H, d, 8.5) 3′, 5′ 115.8 116.1 6.92 (1H, d, 8.5) 4′ 160.9 161.1 - 1′′ 100.3 99.9 5.06 (1H, d, 7.5) 2′′ 73.1 73.1 3.26 (1H, dd, 7.5, 9.0) 3′′ 77.0 77.2 3.45 (1H, t, 9.0) 4′′ 69.9 69.6 3.19 (1H, t, 9.0) 5′′ 76.4 76.5 3.29 (1H, m) 6′′ 60.8 60.6 3.71 (1H, d, 11.5) 3.50 (1H, dd, 6.0, 11.5) a Đo DMSO-d6, b125 MHz, c500 MHz, # δC apigenin-7-O-β-D-glucosid [19] Hợp chất MA2 thu dạng bột vơ định hình màu vàng Trên phở 1H-NMR hợp chất MA2 thấy có xuất cặp tín hiệu doublet δH 6,43 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6) 6,82 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8) điển hình cho hai proton vị trí C-6 C- 24 vịng A proton thơm δH 6,84 (1H, s, H-3) hợp chất flavonoid Hai cặp tín hiệu doublet khác δH 6,92 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′) 7,94 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′) đặc trưng cho vòng thơm B para, cho phép dự đoán hợp chất flavonoid dạng apigenin Ngồi ra, phở quan sát thấy tín hiệu proton anome δH 5,06 (1H, d, J =7,5 Hz, H-1'') gợi ý MA2 có mặt gốc đường Phổ 13C-NMR HSQC của hợp chấ t MA2 xuất tín hiệu cộng hưởng 21 ngun tử cacbon Trong có tín hiệu δC 99,9 (C-1′′), 73,1 (C-2′′), 77,2 (C-3′′), 69,6 (C-4′′), 76,5 (C-5′′), 60,6 (C-6′′) khẳng định có mặt gốc đường glucose tín hiệu 15 nguyên tử cacbon δC 164,3 (C-2), 103,0 (C-3), 182,0 (C-4), 161,6 (C-5), 99,6 (C-6), 162,9 (C-7), 94,9 (C-8), 156,9 (C-9), 105,3 (C-10), 120,9 (C-1′), 128,6 (C-2′, 6′), 116,1 (C-3′, 5′), 161,1 (C-4′) thuộc vào khung flavonoid có vịng B para Các kiện phổ 1H, 13C-NMR MA2 gợi ý flavonoid dạng apigenin gắn với đường glucose So sánh liệu phổ NMR MA2 với hợp chất apigenin-7-O-β-D-glucosid cơng bố từ lồi S tenuifolia [19] cho thấy tương đồng vị trí tương ứng Như vậy, từ liệu khẳng định hợp chất MA2 apigenin-7-O-β-D-glucosid 3.2.3 Hợp chất MA3: apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid Chất bột vơ định hình màu vàng Nhiệt độ nóng chảy: tnc = 297 - 298 ˚C Công thức phân tử C26H28O14, M = 564 Số liệu phở 1H- 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.3 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học hợp chất MA3 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR chất MA3 chất tham khảo C # δC 167.0 δC a,b a,c 167.1 δH (mult., J=Hz) - 25 104.2 103.6 6.61 (1H, s) 184.0 184.2 - 163.1 164.5 - 101.1 101.0 6.46 (1H, d, 1.5) 164.8 164.8 - 96.2 95.8 6,77 (1H, d, 1.5) 159.1 158.9 - 10 107.2 107.0 - 1′ 123.1 121.9 - 2′,6′ 129.8 129.7 7.85 (2H, d, 8.5) 3′, 5′ 117.2 117.6 6.90 (2H, d, 8.5) 4′ 163.2 164.5 - 1′′ 100.2 100.2 5.15 (1H, d, 8.0) 2′′ 78.9 78.7 3.71 (1H, dd, 8.0, 9.0) 3′′ 78.6 78.4 3.69 (1H, t, 9.0) 4′′ 71.5 71.3 3.45 (1H, t, 9.0) 5′′ 78.4 78.7 3.71 (1H, m) 6′′ 62.7 62.5 3.95 (1H, dd, 2.0, 12.0) 3.74 (1H, dd, 5.0, 12.0) 1′′′ 111.1 110.9 5.48 (1H, d, 1.5) 2′′′ 78.3 78.1 3.99 (1H, d, 1.5) 3′′′ 80.8 80.7 - 4′′′ 75.6 75.4 4.07 (1H, d, 9.5) 3.84 (1H, d, 9.5) 66.0 65.9 Glu Apio 5′′′ a # 3.58 (2H, br s) Đo CD3OD, 125 MHz, c500 MHz, b δC apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1->2)- β-D- glucopyranosid [15] Hợp chất MA3 phân lập dạng bột vơ định hình, màu vàng Trên phở H-NMR hợp chất MA3 thấy có xuất cặp tín hiệu doublet δH 6,46 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6) 6,77 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8) đặc trưng cho hai proton vị trí C-6 C-8 vòng A proton thơm δH 6,61(1H, s, H-3) hợp 26 chất flavonoid Cặp hai tín hiệu doublet khác δH 6,90 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, 5′) 7,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′) đặc trưng cho vòng thơm B para Tín hiệu proton anome δH 5,15 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′) 5,48 (1H, d, J = 1,5 Hz, H1′′′) gợi ý hợp chất MA3 có mặt gốc đường Phở 13 C-NMR HSQC của hợp chấ t MA3 xuất tín hiệu cộng hưởng 26 nguyên tử cacbon Tín hiệu 15 nguyên tử cacbon δC 167,1 (C-2), 103,6 (C-3), 184,2 (C-4), 164,5 (C-5), 101,0 (C-6), 164,8 (C-7), 95,8 (C-8), 158,9 (C-9), 107,0 (C-10), 121,9 (C-1′), 129,7 (C-2′, 6′), 117,6 (C-3′, 5′) 164,5 (C-4′) thuộc khung flavonoid có vịng B para tương tự hợp chất MA2 Sự khác biệt có thêm phân tử đường Độ chuyển dịch hóa học C-2 tăng nhẹ (73,1 lên 78,7) gợi ý xuất liên kết glycosid C-2 đường glucose So sánh liệu phổ NMR hợp chất MA3 với hợp chất apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)β-D-glucopyranosid thấy phù hợp hồn tồn [15] Như vậy, khẳng định hợp chất MA3 apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid 3.3 Thảo luận kết Từ phân lớp nước thu hợp chất flavonoid dạng flavon Các howph chất thuộc nhóm flavon, số dẫn xuất tổng hợp chúng, chứng minh thể số hoạt động sinh học, bao gồm chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, chống nhiễm độc gen, chống dị ứng, bảo vệ thần kinh, bảo vệ tim mạch kháng khuẩn 3.3.1 Vitexin Hợp chất MA1 (vitexin) có mặt nhiều loại thực vật có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Từ phân đoạn EtOAc Gừa, kỹ thuật sắc ký kết hợp với phương pháp phổ NMR, MS phân lập xác định hợp chất polyphenol vitexin với độ tinh khiết cao dùng làm chất đối chiếu định tính, định lượng Trong đó, vitexin lần báo cáo có Gừa Đã sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa in vitro mơ hình DPPH phân đoạn ethyl acetat, vitexin cho thấy mẫu thử có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Lá Gừa nguồn nguyên liệu rấ t có tiềm sản xuất thuốc chống oxy hóa [3] 27 3.3.2 Apigenin-7-O-β-D-glucosid Hợp chất có mặt nhiều lồi thực vật Hương nhu Hải Châu (E splendens), Kinh giới rách (S tenuifolia), Cùm sọc (K Striata,… có hoạt tính chống oxy hóa [10], chống HIV IC50 > 100 µg/ml EC50 = 1,8 µg/ml [26] chống ung thư [17] Apigenin-7-O-β-D-glucosid thể hoạt động chống tăng sinh chống oxy hóa mạnh loại oxy phản ứng (ROS) ống nghiệm theo cách phụ thuộc nồng độ Nghiên cứu in vitro thể hoạt động chống tăng sinh đáng kể chống lại tế bào khối u ác tính B16F10 sau 24 48 ủ Apigenin-7-O-β-D-glucosid tăng cường tổng hợp melanogenesis hoạt động tyrosinas tế bào u ác tính B16F10, đặc biệt gây biệt hóa tế bào CD34 + dòng hồng cầu ức chế biệt hóa tủy 3.3.3 Apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid Hợp chất apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid có mặt nhiều lồi thực vật Crotalaria anagyroides, Kochujang,…và có hoạt tính chống oxy hóa [15] chống Hepatitis B virus (HBV) [30] Nhằm cung cấp kiến thức nguyên liệu Bùm bụp góp phần ứng dụng chăm sóc sức khỏe, đề tài nghiên cứu phân lập hợp chất trên, ta thấy nguồn dược liệu hữu ích, cần nghiên cứu, phát triển để Bùm bụp sử dụng rộng rãi cộng đồng 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Sau trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận: “Nghiên cứu phân lập hợp chất flavonoid từ loài Bùm bụp [Mallotus apelta (Lour.) Muell – Arg.]” thu số kết sau: + Bằng kỹ thuật sắc ký phân lập hợp chất flavonoid từ dịch chiết methanol Bùm bụp (Mallotus apelta) + Kết hợp với phương pháp phổ phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, 13C-NMR) hai chiều (HMBC, HSQC) xác định cấu trúc hợp chất lầ n lươ ̣t vitexin (MA1), apigenin-7-O-β-D-glucosid (MA2) apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid (MA3) Kiến nghị: Qua nguồn tài liệu tham khảo trước thấy lồi thuộc chi Mallotus chứa nhiều hợp chất thuốc nhóm flavonoid có hoạt tính sinh học tốt cho sức khỏe người Do đó, em đề nghị tiếp tục nghiên cứu phân lập thêm hợp chất có Mallotus apelta, đưa thêm chất vào kho tàng liệu hợp chất thiên nhiên đánh giá hoạt tính hợp chất phân lập 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Như, Nguyễn Tập &Trần Toàn; (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Võ Văn Chi; (2001), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Công nghệ, Hà Nội Huỳnh Anh Duy &Huỳnh Ngọc Thụy; (2015), "Phân lập catechin, vitexin xây dựng quy trình định lượng vitexin từ gừa (Ficus microcarpa Lf)", Tạp chí Dược học, 55 (4), 50-53 Đỗ Tất Lợi; (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Công nghệ, Hà Nội Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Lã Đình Mỡi, Phạm Quốc Long, Nguyễn Thị Kim Thanh, Nguyễn Xuân Cường &Nguyễn Hoài Nam; (2009), Chi Mallotus hóa học, hoạt tính sinh học sắc ký fingerprint, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Lê Ngọc Tân, Đỗ Mạnh Dũng &Phạm Văn Hiển; (2019), "Đinh ̣ lươ ̣ng đồ ng thời astilbin và emodin bài thuố c GK1 bằ ng phương pháp HPLC", Tạp chí Dược học,59 (6), 16-21 Nguyễn Nghĩa Thìn; (2003), Danh lục lồi thực vật Việt Nam NXB Nông nghiệp, Hà Nội Tiếng Anh T An, L Hu, X Cheng &Z Chen (2001), "Benzopyran derivatives from Mallotus apelta", Phytochemistry, 57 (2), 273-278 Tian-Ying An, Li-Hong Hu, Xiao-Fang Cheng &Zhong-Liang Chen (2003), "Two new benzopyran derivatives from Mallotus apelta", Nat Prod Res., 17 (5), 325-328 10 Zaixing Chen, Xixiang Ying, Shu Meng, Xu Zhu, Hong Jiang, Qishen Cao, Xuying Li &Fanhao; Meng (2011), "High-performance liquid chromatographic determination and pharmacokinetic study of apigenin-7-O- 11 12 13 14 β-D-glucoside in rat plasma after intravenous administration", Arch Pharm Res, 34 (5), 741 X F Cheng &Z L Chen (2000), "Coumarinolignoids of Mallotus apelta", Fitoterapia, 71 (3), 341-342 Xiao-Fang Cheng &Zhong-Liang Chen (1999), "Three new diterpenoids from Mallotus apelta Muell Arg", J Asian Nat Prod Res., (4), 319-325 Xiao-Fang Cheng, Zhongliang Chen &Zeng-Mu Meng (1999), "Two new diterpenoids from Mallotus apelta Muell Arg", J Asian Nat Prod Res., (3), 163-168 Xiao-Fang Cheng, Zeng-Mu Meng &Zhong-Liang Chen (1998), "A pyridinetype alkaloid from Mallotus Apelta", Phytochemistry, 49 (7), 2193-2194 15 Jin Ho Chung, Heung-Chule Shin, Jeong-Yong Cho, Seong-Koo Kang, Hyoung Jae Lee, Soo-Cheol Shin, Keun-Hyung Park &Jae-Hak Moon (2009), "Isolation and structural determination of free radical scavenging compounds from Korean fermented red pepper paste (Kochujang)", Food Science Biotechnology,18 (2), 463-470 16 Phan Van Kiem, Nguyen Hai Dang, Ha Viet Bao, Hoang Thanh Huong, Chau Van Minh, Le Mai Huong, Jung Joon Lee &Young Ho Kim (2005), "New cytotoxic benzopyrans from the leaves of Mallotus apelta", Arch Pharmacal Res., 28 (10), 1131-1134 17 Masao Kikuchi &Noriko Matsuda (1996), "Flavone glycosides from Lonicera gracilipes var glandulosa", Journal of natural products,59 (3), 314-315 18 Jin Hwa Kim, Bum Chun Lee, Jin Hui Kim, Gwan Sub Sim, Dong Hwan Lee, Kyung Eun Lee, Yeo Pyo Yun &Hyeong Bae Pyo (2005), "The isolation and antioxidative effects of vitexin fromAcer palmatum", Archives of pharmacal research,28 (2), 195 19 Masayoshi Kubo, Hiroshi Sasaki, Tohru Endo, HEIHACHIRO TAGUCHI &ITIRO YOSIOKA (1986), "The Constituents of Schizonepeta tenuifolia BRIQ II.: Structure of a New Monoterpene Glucoside, Schizonepetoside C", Chemical pharmaceutical bulletin, 34 (8), 3097-3101 20 Phung Ngan Le, Dinh Chuong Pham, Dai Hai Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Vladimir Dimitrov, Petko Ivanov, Cuong Nguyen Xuan, Hoai Nam Nguyen &Cuu Khoa Nguyen (2017), "Poly (N-isopropylacrylamide)-functionalized dendrimer as a thermosensitive nanoplatform for delivering malloapelta B against HepG2 cancer cell proliferation", Adv Nat Sci.: Nanosci Nanotechnol., (2), 025014/1-025014/7 21 Xin Chao Liu, Xu Bo Chen &Zhi Long Liu (2014), "Gas chromatography-mass spectrometric analysis and insecticidal activity of essential oil of aerial parts of Mallotus apelta (Lour.) Muell.-Arg (Euphorbiaceae)", Trop J Pharm Res., 13 (9), 1515-1520 22 Tailiang Lu, Shengping Deng, Chen Li, Liangdeng Wu, Ruiyun Yang &Jun Li (2014), "A new chromone from the twig of Mallotus apelta", Nat Prod Res., 28 (21), 1864-1868 23 Hoai Nam Nguyen, Hai Dang Nguyen, Van Kiem Phan, Van Chinh Luu, Thi Binh Phan, Dinh Moi La &Van Minh Chau (2007), "Study on benzopyrans and other isolated compounds from Mallotus apelta", Tap Chi Hoa Hoc, 45 (DB), 111-121 24 C Riviere, V Nguyen Thi Hong, Q Tran Hong, G Chataigne, N Nguyen Hoai, B Dejaegher, C Tistaert, T Nguyen Thi Kim, Y Vander Heyden, M Chau Van &J Quetin-Leclercq (2010), "Mallotus species from Vietnamese mountainous areas: phytochemistry and pharmacological activities", Phytochem Rev., (2), 217-253 25 XQ Shan, LB Feng &CS Wu (1985), "Chemical constituents of the roots of Mallotus apelt a (Lour.) Muell.-Arg", Zhiwu Xuebao, (27), 192-195 26 Renjiu Tang, Ke Chen, Mark Cosentino &Kuo-Hsiung Lee (1994), "Apigenin7-O-β-D-glucopyranoside, an anti-HIV principle from Kummerowia striata", Bioorg.Med.Chem.Lett, (3), 455-458 27 J Viaene, M Goodarzi, B Dejaegher, C Tistaert, A Hoang Le Tuan, N Nguyen Hoai, M Chau Van, J Quetin-Leclercq &Y Vander Heyden (2015), "Discrimination and classification techniques applied on Mallotus and Phyllanthus high performance liquid chromatography fingerprints", Anal Chim Acta, 877 41-50 28 Jian-Fu Xu, Zi-Ming Feng, Jian Liu &Pei-Cheng Zhang (2008), "New hepatoprotective coumarinolignoids from Mallotus apelta", Chem Biodiversity, (4), 591-597 29 Shu Xu, Zhi-Ping Lü, Hong-Bing Cai, Xiao-Gang Zhang, Qiang Liu &Yan Tan (2006), "Inhibiting effects of root of Mallotus apelta on duck hepatitis B virus", Taylor & Francis, (3), 285-288 30 Bo Zhang, Ling Lai, Yanjun Tan, Qiuyun Liang, Facheng Bai, Wanting Mai, Qiujie Huang &Yong Ye (2020), "Hepatoprotective effect of total flavonoids of Mallotus apelta (Lour.) Muell Arg leaf against carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in rats via modulation of TGF-β1/Smad and NF-κB signaling pathways", Journal of Ethnopharmacology, 254 112714 PHỤ LỤC DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT MA1 (vitexin) Hình Phổ 1H-NMR hợp chất MA1 Hình Phổ 13C-NMR hợp chất MA1 Hình Phổ HSQC hợp chất MA1 Hình Phổ HMBC hợp chất MA1 DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT MA2 (apigenin-7-O-β-D-glucosid) Hình Phổ 1H - NMR hợp chất MA2 Hình Phổ 13C - NMR hợp chất MA2 Hình 7.Phổ HSQC hợp chất MA2 DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT MA3 (apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid) Hình Phổ 1H-NMR hợp chất MA3 Hình Phổ 13C-NMR hợp chất MA3 Hình 10.Phổ HSQC hợp chất MA3 ... Mallotus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài: ? ?Nghiên cứu phân lập hợp chất flavonoid từ loài Bùm bụp [Mallotus apelta (Lour.) Muell ? ?Arg.] ” Với mục đích nghiên cứu. .. trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận: ? ?Nghiên cứu phân lập hợp chất flavonoid từ loài Bùm bụp [Mallotus apelta (Lour.) Muell – Arg.] ” thu số kết sau: + Bằng kỹ thuật sắc ký phân lập hợp...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  NGUYỄN THỊ SINH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC FLAVONOID TỪ LỒI BÙM BỤP [Mallotus apelta (Lour.) Muell – Arg.] KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: