Nghiên cứu phân lập các steroit của loài hải miên mycale plumose

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC VŨ THỊ XUÂN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC STEROIT CỦA LOÀI HẢI MIÊN MYCALE PLUMOSE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. HOÀNG LÊ TUẤN ANH HÀ NỘI - 2014 Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Xuân K36B-Khoa Hóa Học LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Nghiên cứu Cấu trúc, Viện Hóa sinh biển-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với sự hỗ trợ kết quả từ đề tài nghiên cứu cơ bản định hướng ứng dụng “Nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình phân lập các chất có hoạt tính kháng ung thư của một số loài hải miên ở Việt Nam” do PGS. TS Phan Văn Kiệm làm chủ nhiệm. Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn TS. Hoàng Lê Tuấn Anh và các anh chị hướng dẫn trong Viện Hóa sinh biển-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Với tất cả lòng kính trọng và lòng biết ơn chân thành, em xin cảm ơn thầy giáo PGS-TS. Nguyễn Văn Bằng người đã tận tình, chu đáo dạy bảo em trong suốt những năm học ở trường và hoàn thiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa Học-Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ, dạy dỗ em trong quá trình học tập tại trường. Xin cảm ơn tất cả các bạn bè đã động viên giúp đỡ em trong quá trình học tập và làm khóa luận. Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy em kính mong nhận được ý kiến đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2014 Sinh viên Vũ Thị Xuân Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Xuân K36B-Khoa Hóa Học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận: “Nghiên cứu phân lập các steroit của loài hải miên Mycale plumose”, dưới sự hướng dẫn của TS. Hoàng Lê Tuấn Anh là hoàn toàn trung thực và không trùng với kết quả của tác giả khác. Sinh viên Vũ Thị Xuân Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Xuân K36B-Khoa Hóa Học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) 1 H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic Resonance Spectroscopy) 1 H- 1 H COSY 1 H- 1 H Chemical Shift Correlation Spectroscopy 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (Two-Dimensional NMR) CC Sắc ký cột (Column Chromatography) DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron (Electron Impact Mass Spectroscopy) FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh (Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao (High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MS Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy) NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Xuân K36B-Khoa Hóa Học DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1. Một số loài hải miên 2 Hình 1.2. Hải miên chi Mycale 6 Hình 1.3. Hải miên Mycale plumose 7 Hình 3.1. Sơ đồ phân lập hợp chất 1 và 2 34 Hình 4.1.1. Phổ 1 H-NMR của hợp chất 1 36 Hình 4.1.2. Phổ 13 C-NMR của hợp chất 1 37 Hình 4.1.3. Phổ DEPT của hợp chất 1 38 Hình 4.1.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 38 Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 39 Hình 4.2.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 40 Hình 4.2.2. Phổ 13 C-NMR của hợp chất 2 41 Hình 4.2.3. Phổ DEPT của hợp chất 2 42 Hình 4.2.4. Cấu trúc hóa học của 2 hợp chất tham khảo 43 Hình 4.2.5. Phổ HSQC của hợp chất 2 43 Hình 4.2.6. Phổ HMBC của hợp chất 2 44 Hình 4.2.7. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 2 44 Hình 4.2.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 45 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 và chất tham khảo 46 Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Xuân K36B-Khoa Hóa Học MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Nhiệm vụ của đề tài 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về hải miên 2 1.1.1. Khái quát về hải miên 2 1.1.2. Hải miên ở Việt Nam 5 1.1.3. Hải miên chi Mycale 5 1.2. Tổng quan về Steroit 7 1.2.1. Giới thiệu chung 7 1.2.2. Một số steroit cơ bản 8 1.3. Các phương pháp chiết mẫu sinh vật 19 1.3.1. Chọn dung môi chiết 19 1.3.2. Quá trình chiết 21 1.4. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ 22 1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí 22 1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí. 23 1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí 24 1.5. Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 26 1.5.1. Phổ hồng ngoại 26 1.5.2. Phổ khối lượng 27 1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 28 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Mẫu động vật 31 2.2. Phương pháp phân lập các chất hữu cơ 31 2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (TLC) 31 Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Xuân K36B-Khoa Hóa Học 2.2.2. Sắc kí cột (CC) 31 2.3. Phương pháp phổ 31 2.3.1. Phổ khối lượng (EIS – MS) 31 2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 31 2.4. Dụng cụ và thiết bị 32 2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết 32 2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc 32 2.5. Hoá chất 32 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 33 3.1. Xử lí mẫu 33 3.2. Phân lập các hợp chất 33 3.3. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đã được phân lập…… 35 3.3.1. Hợp chất 1…………………………………………………… 35 3.3.2. Hợp chất 2….………………………………………………… 35 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1: 3β-Hydroxycholest-5-en- 7-one 36 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2: Cholest-7-en-3β,5,6β-triol 40 KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Xuân 1 K36B-Khoa Hóa Học MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới cận xích đạo, có khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều, độ ẩm cao (khoảng trên 80%), nên nước ta được thiên nhiên ban tặng một hệ động thực vật đa dạng và phong phú với hàng ngàn loài khác nhau. Nước ta có bờ biển trải dài, có khí hậu thuận lợi tạo điều kiện phát triển cho nhiều loài hải miên. Các loài hải miên có vai trò rất quan trọng trong các ngành nghiên cứu khoa học. Nhiều loài có các chất có hoạt tính sinh học giá trị làm thuốc chữa bệnh như ung thư, kháng khuẩn, khử độc…. Gần đây, loài sinh vật biển này đặc biệt được chú ý trong các ngành khoa học vật liệu và công nghệ sinh học nano. Người ta có thể sản xuất nguyên liệu thay thế xương, để trám răng,… từ hải miên. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nhiều nghiên cứu về hải miên ở Việt Nam. Trên thế giới, các nhà khoa học đã rất chú ý đến hải miên và coi đây là một đối tượng nghiên cứu thú vị với nhiều hoạt chất sinh học được phát hiện. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi chọn đề tài khóa luận tốt nghiệp là: “Nghiên cứu phân lập các steroit của loài hải miên Mycale plumose”. Với mục đích nghiên cứu các thành phần steroit có trong hải miên Mycale plumose và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất được phân lập. Từ đó tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các hoạt chất có thể ứng dụng vào thực tế cuộc sống. Đây là yếu tố quan trọng có ý nghĩa thực tiễn đối với sự phát triển của nền y học Việt Nam. 2. Nhiệm vụ của đề tài - Xây dựng quy trình phân lập các hợp chất steroit có trong hải miên Mycale plumose. - Xác định cấu trúc của hợp chất được phân lập bằng các phương pháp phổ. Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Xuân 2 K36B-Khoa Hóa Học CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về hải miên 1.1.1. Khái quát về hải miên Hải miên hay động vật thân lỗ (porifera) là một ngành động vật đa bào nguyên thủy có cấu trúc tế bào tách biệt và phần lớn sinh sống ở biển. Đây là ngành động vật đơn giản và nguyên thủy nhất, có những mô khác nhau nhưng không có cơ, hệ thần kinh, cơ quan bên trong, hay khả năng vận động. Hải miên thường ăn bằng cách hút nước qua các lỗ chân lông. Do hải miên không có hệ tuần hoàn, hệ thần kinh, hệ tiêu hóa nên hầu hết chúng dựa vào việc duy trì một dòng chảy liên tục qua cơ thể để lấy thức ăn, oxy và loại bỏ chất thải. Hình 1.1. Một số loài hải miên Ailochroia crassa Mycale laevis Haliclona sp. (Blue Sponge) Halichondria melanodocia Micha Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Xuân 3 K36B-Khoa Hóa Học Các nhà khoa học đã tìm thấy khoảng hơn 10.000 loài hải miên. Mặc dù có một số loài hải miên sống trong hệ sinh thái nước ngọt nhưng đa phần hải miên là các loài động vật biển, phân bố rộng khắp các vùng nhiệt đới, ôn đới, và vùng cực, từ vùng triều cho tới tận độ sâu 8.800m. Hải miên được biết đến như một nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú nhận được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên toàn thế giới bởi sự đa dạng về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của chúng. Cho đến nay có trên 5300 hợp chất được phân lập, và hàng trăm hợp chất mới được tìm thấy mỗi năm. Các hoạt chất phân lập được chủ yếu là các nhóm chất nucleosit không điển hình, các tecpenoit, các steroit, các peptit vòng, alcaloit, axít béo và các dẫn xuất của axít amin [1-2]. Cho đến năm 1951, các nhà khoa học đã phát hiện ra một nucleosit từ Cryptotethya crypta, tiền chất tổng hợp nên Ara-C, dược chất điều trị bệnh bạch cầu phổ biến ngày nay thì lúc này các ứng dụng dược học của hải miên mới thực sự được quan tâm. Ngay sau đó, lần lượt là các công bố về thành phần axít béo, sterol và các thành phần khác phân lập từ hải miên đã chứng minh tính đa dạng của hợp chất biển. Đã có hơn 500 loài hải miên trên thế giới đã được nghiên cứu về hóa học và hoạt tính. Tuy nhiên con số này vẫn rất là nhỏ so với 10.000 loài đã được tìm thấy. [...]... đối với dòng tế bào ung thư cao gấp 60 lần các tế bào bình thường khác.[2] 1.1.2 Hải miên ở Việt Nam Hải miên ở vùng biển của nước ta đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 70 của thế kỷ 20 tuy nhiên những nghiên cứu về hải miên hầu như chưa được công bố Những nghiên cứu điều tra gần đây của Viện tài nguyên và Môi trường biển và Viện Hải dương học cho thấy hải miên ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng,... thuộc chi Mycale Theo các nghiên cứu đã được công bố thì có 128 hợp chất phân lập được từ chi Mycale Thành phần hóa học chủ yếu là các sterol, alcaloit, amin, mycalazal (các dẫn xuất pyrrole – 2 – cacbadehyde), hợp chất chứa brom… Vũ Thị Xuân 5 K36B-Khoa Hóa Học Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Mycale fistulifer Khóa Luận Tốt Nghiệp Mycale adhaerens Hình 1.2 .Hải miên chi Mycale Các loài trong chi Mycale. .. ung thư người P388 Theo phân loại, hải miên Mycale plumose thuộc họ Mycalidae, chi Mycale Vũ Thị Xuân 6 K36B-Khoa Hóa Học Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hình 1.3 Hải miên Mycale plumose 1.2 Tổng quan về Steroit [9,10,13-16] 1.2.1 Giới thiệu chung 1.2.1.1 Khái niệm Steroit có nhiều trong tự nhiên, là este phức tạp của rượu đa vòng sterol với các axit béo cao phân tử và là một nhóm... diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau - Phổ HMBC: Đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc - Phổ NOESY: Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton... là P388, HL60, A-549, BEL-7402 và SPCA4 [6] Các dẫn xuất mycalazal, dạng pyrrole-2-cacbadehyde có chứa mạnh nhánh khác nhau ở cacbon C-5, được phân lập từ loài hải miên Mycale cecilia có khả năng ức chế sự sinh trưởng của một số dòng tế bào ung thư người, đặc biệt là dòng LNcaP (tuyến tiền liệt) [7] Hợp chất Pateamine [8], được phân lập từ loài hải miên Mycale sp thu tại New Zealand, thể hiện hoạt... một số loài như: Dysidea cinerea, Haliclona subarmigera, Mycale plumose, Petrosia nigricans, Clathria vulpina, Niphates sp, Ianthellabasta,v.v Các loài này được phân bố chủ yếu trong các rạn san hô, nằm dọc ven biển và xung quanh các vùng đảo như Cát Bà, Hạ Long, Trường Sa, Hoàng Sa, vịnh Nha Trang, Phú Quốc, v.v… ở Việt Nam 1.1.3 Hải miên chi Mycale Các nhà khoa học đã tìm thấy khoảng hơn 500 loài thuộc... Tốt Nghiệp steroit thiên nhiên, nên tổng số đồng phân lý thuyết giảm đi rất nhiều; và thường hay có nhóm metyl ở vị trí cis và C19 1.2.1.3 Tính chất của Steroit Đa số các steroit khi đun nóng với Selen ở 3600C tạo ra hợp chất Diel có công thức phân tử C18H16 1.2.1.4 Phân loại Steroit Steroit tồn tại nhiều trong thiên nhiên và chúng tạo thành một nhóm hợp chất phân phối rộng khắp Chúng gồm các loại quan... quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết 1.4 Các phƣơng pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ [11] Phương pháp tách chất bằng sắc kí hay còn gọi là phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp... điện tích (m/z) của chúng Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau: - Phổ EI-MS dựa vào sự phân mảnh ion... chất khác Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất 1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu khoa học có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử Nguyên . là: Nghiên cứu phân lập các steroit của loài hải miên Mycale plumose . Với mục đích nghiên cứu các thành phần steroit có trong hải miên Mycale plumose và xác định cấu trúc hóa học của các. Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận: Nghiên cứu phân lập các steroit của loài hải miên Mycale plumose , dưới sự hướng dẫn của TS. Hoàng Lê Tuấn. của nền y học Việt Nam. 2. Nhiệm vụ của đề tài - Xây dựng quy trình phân lập các hợp chất steroit có trong hải miên Mycale plumose. - Xác định cấu trúc của hợp chất được phân lập bằng các