2. Nhiệm vụ của đề tài
1.4.3.Phân loại các phương pháp sắc kí
Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất tồn tại ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Nếu dựa vào trạng thái tập hợp của pha động người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí và sắc ký lỏng. Còn nếu dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:
1.4.3.1. Sắc ký cột (C.C)
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ vô cùng quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại. Nhưng nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm.Ngoài ra trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPLC), áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi được
gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về
Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5 - 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào
hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Có nhiều phương pháp đưa chất lên cột tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn rồi đưa lên cột. Nếu tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng vật mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải chú ý không được để xuất hiện bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không được nứt, gẫy, dò.
Bên cạnh đó, tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì nó sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
1.4.3.2. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silica
gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký, ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp
chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.
1.5. Một số phƣơng pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [12]
Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các
phương pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, các phương pháp sắc kí so sánh…
1.5.1. Phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các
nhóm hydroxyl là 3300 - 3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C = O trong khoảng
1700 - 1750 cm-1, của nhóm C = C trong vùng 1630 – 1650 cm-1, của nhóm ete
C – O – C trong vùng 1020 – 1100 cm-1,... Đặc biệt vùng dưới 700 cm-1 được
gọi là vùng vân tay, nó được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp.
Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mà lượng chất cần để thực hiện phép đo này lại cần đến 2 – 3 mg chất và khó thu
hồi lại. Vì vậy, thường đối với các hợp chất thiên nhiên thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác như phổ cộng hưởng từ hạt nhân hay phổ khối lượng.
1.5.2. Phổ khối lượng
Phổ khối lượng được dùng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ. Phổ khối lượng được chế tạo để thực hiện 3 nhiệm vụ cơ bản:
- Chuyển chất nghiên cứu thành thể khí. - Tạo ra các phân tử ion.
- Phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo tỉ lệ khối lượng trên điện tích (m/z) của chúng.
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:
- Phổ EI-MS dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV.
- Phổ ESI-MS gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với
năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
- Phổ FAB-MS là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
- Phổ khối lượng phân giải cao cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
- Hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí - khối phổ) cho các chất dễ bay hơi như tinh dầu hay LC-MS (sắc kí lỏng - khối phổ) cho các hợp chất khác. Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất.
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu khoa học có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và
cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1
H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
1.5.3.1. Phổ 1
H-NMR
Trong phổ 1
H-NMR, độ dịch chuyển hoá học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
1.5.3.2. Phổ 13
C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13
1.5.3.3. Phổ DEPT
Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên
phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3
nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ
DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH.
1.5.3.4. Phổ 2D-NMR
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số phổ chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HSQC: Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các
tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1
H-NMR, còn trục kia là
13
C-NMR. Các tương tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY): Phổ này biểu diễn các tương tác
xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
- Phổ HMBC: Đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
- Phổ NOESY: Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ hạt nhân để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ có cường độ mạnh hơn.
Bên cạnh đó, người ta còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơnghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Tuy nhiên phạm vi sử dụng của phổ này hạn chế vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ.
Bên cạnh việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh, kết hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính xác được chiều dài các mạch, cũng như đối với các phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi sau đó xác định bằng phương pháp so sánh LC- MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu động vật
Mẫu hải miên Mycale plumose được thu vào tháng 6 năm 2011 Cát Bà,
Hải Phòng. Tên khoa học được PGS.TS Đỗ Công Thung, Viện Tài nguyên và Môi trường biển giám định. Mẫu tiêu bản được lưu trữ tại viện Tài nguyên và Môi trường biển, Hải Phòng và Viện Hóa sinh biển.
2.2. Phƣơng pháp phân lập các chất hữu cơ
2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 và RP18 F254 (Merck-Đức). Các vệt chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là
dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến
khi hiện màu.
2.2.2. Sắc kí cột (CC)
Sắc ký cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ pha thường (Silica gel 240 - 430 mesh, Merck) hoặc pha đảo (YMC, ODS-60-14/63, Fujisilisa - Nhật Bản).
2.3. Phƣơng pháp phổ
2.3.1. Phổ khối lượng (EIS – MS)
Phổ khối lượng (EIS – MS) được đo trên máy AGILENT 1200 LC – MSD Trap, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT- NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
2.4. Dụng cụ và thiết bị
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:
- Bình chiết 5, 10, 20 lít. - Máy cô quay chân không.
- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm và 365 nm. - Micropipet.
- Tủ sấy chân không. - Máy sấy, bếp điện
- Bình sắc ký loại phân tích và điều chế. - Cột sắc ký pha ngược trung áp.
- Cột sắc ký pha thường các loại đường kính. - Máy phun dung dịch thuốc thử.
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc
- Thiết bị đo điểm nóng chảy Kofler micri-hotstage.
- Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer.
2.5. Hoá chất
- Silica gel 60 (0,04-0,063 mm) Merck.
- Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, Fujisilica Chemical Ltd).
- Bản mỏng có pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715). - Bản mỏng pha đảo RP18 F254s (Merck).
- Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
- Các loại dung môi hữu cơ như metanol, etanol, etyl axetat, cloroform, hecxan, axetone...
CHƢƠNG 3 THỰC NGHIỆM
3.1. Xử lí mẫu
Hải miên Mycale plumose tươi (20 kg) được làm sạch, thái nhỏ, phơi khô, sau cùng đem nghiền nhỏ thành bột.
3.2. Phân lập các hợp chất
Bột hải miên Mycale plumose khô được chiết 3 lần bằng metanol (ở
50oC, mỗi lần 3 giờ). Các dịch chiết được lọc qua phễu hút chân không, loại
bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được 50 gam cặn chiết metanol. Cặn chiết này được hòa tan vào 1 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần là hecxan, cloroform, etyl axetat và butanol (3 lần x 1L). Lớp dung môi hữu cơ thu được qua 3 lần chiết được loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được 7 gam cặn hecxan, 20 gam cặn cloroform, 10 gam cặn etyl axetat và 3 gam cặn butanol.
Cặn cloroform được hòa tan, tẩm bằng silica gel pha thường (tỉ lệ 1/2), cất loại dung môi dưới áp suất giảm đến khô rồi nghiền mịn. Hỗn hợp này được phân tách thô trên cột sắc ký với chất hấp thụ là silica gel pha thường, sử