2. Nhiệm vụ của đề tài
2.2.2.Sắc kí cột (CC)
Sắc ký cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ pha thường (Silica gel 240 - 430 mesh, Merck) hoặc pha đảo (YMC, ODS-60-14/63, Fujisilisa - Nhật Bản).
2.3. Phƣơng pháp phổ
2.3.1. Phổ khối lượng (EIS – MS)
Phổ khối lượng (EIS – MS) được đo trên máy AGILENT 1200 LC – MSD Trap, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT- NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
2.4. Dụng cụ và thiết bị
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:
- Bình chiết 5, 10, 20 lít. - Máy cô quay chân không.
- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm và 365 nm. - Micropipet.
- Tủ sấy chân không. - Máy sấy, bếp điện
- Bình sắc ký loại phân tích và điều chế. - Cột sắc ký pha ngược trung áp.
- Cột sắc ký pha thường các loại đường kính. - Máy phun dung dịch thuốc thử.
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc
- Thiết bị đo điểm nóng chảy Kofler micri-hotstage.
- Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer.
2.5. Hoá chất
- Silica gel 60 (0,04-0,063 mm) Merck.
- Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, Fujisilica Chemical Ltd).
- Bản mỏng có pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715). - Bản mỏng pha đảo RP18 F254s (Merck).
- Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
- Các loại dung môi hữu cơ như metanol, etanol, etyl axetat, cloroform, hecxan, axetone...
CHƢƠNG 3 THỰC NGHIỆM
3.1. Xử lí mẫu
Hải miên Mycale plumose tươi (20 kg) được làm sạch, thái nhỏ, phơi khô, sau cùng đem nghiền nhỏ thành bột.
3.2. Phân lập các hợp chất
Bột hải miên Mycale plumose khô được chiết 3 lần bằng metanol (ở
50oC, mỗi lần 3 giờ). Các dịch chiết được lọc qua phễu hút chân không, loại
bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được 50 gam cặn chiết metanol. Cặn chiết này được hòa tan vào 1 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần là hecxan, cloroform, etyl axetat và butanol (3 lần x 1L). Lớp dung môi hữu cơ thu được qua 3 lần chiết được loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được 7 gam cặn hecxan, 20 gam cặn cloroform, 10 gam cặn etyl axetat và 3 gam cặn butanol.
Cặn cloroform được hòa tan, tẩm bằng silica gel pha thường (tỉ lệ 1/2), cất loại dung môi dưới áp suất giảm đến khô rồi nghiền mịn. Hỗn hợp này được phân tách thô trên cột sắc ký với chất hấp thụ là silica gel pha thường, sử dụng hệ dung môi hecxan /etyl axetat (gradien từ 100/0 – 0/100, v/v) thu được 5 phân đoạn (MP1 – MP5). Phân đoạn MP5 được hòa tan bằng cloroform, tẩm bằng silica gel pha thường (tỉ lệ 1/1), cất loại dung môi đến khô rồi nghiền mịn. Hỗn hợp này được tiến hành tinh chế trên cột sắc ký pha thường với hệ dung môi rửa giải cloroform/metanol (8/1, v/v) kết hợp với sắc ký lớp mỏng điều chế thu được 2 hợp chất 1 (5 mg) và 2 (5 mg).
Hình 3.1. Sơ đồ phân lập hợp chất 1 và 2
Mẫu hải miên tươi Mycale plumose
(thái nhỏ, phơi khô, nghiền nhỏ) (20 kg) Cặn MeOH (50 g) Cặn hecxan (7 g) 9 Cặn cloroform (20 g) Cặn etyl axetat (10 g) Cặn butanol (3 g)
Chiết với MeOH x 3 lần
Chiết phân bố với các dung môi
MP3 2 (5mg) 1 (5mg) MP4 MP5 MP1 MP2
Sắc kí cột silica gel pha thường (1/1.5); Hecxan/etyl axetat (100/0 – 0/100)
Sắc ký cột silica gel pha thường; Cloroform/metanol (8/1, v/v)
3.3. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã đƣợc phân lập[3]
3.3.1. Hợp chất 1
Tên khoa học: 3β-Hydroxycholest-5-en-7-one
Tinh thể màu trắng ESI-MS m/z 423 [M+Na]+ Công thức phân tử C27H44O2 (M = 400). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 3.3.2. Hợp chất 2
Tên khoa học: 3β,5,6β-Triolcholest-7-en
Chất bột màu trắng.
ESI-MS m/z 401 [M-H2O+H]+
Công thức phân tử C27H46O3 (M = 418).
1
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1:3β-Hydroxycholest-5-en-7-one 7-one
Hợp chất 1 nhận được dưới dạng chất bột màu trắng. Vệt chất xuất hiện màu tím hồng, sau đó chuyển dần sang tím xanh trên sắc ký lớp mỏng (TLC) với thuốc thử đặc hiệu (phun dung dịch H2SO4 10% rồi hơ nóng từ từ) cho
thấy đây là một steroit. Các dữ liệu phổ 1
H-NMR, 13C-NMR và DEPT cũng
cho thấy đây là một hợp chất dạng steroit. Trên phổ proton xuất hiện tín hiệu
đặc trưng của 5 nhóm metyl cộng hưởng tại H 0,70 (s, H-18); 0,83 (3H, d, J
= 7,0 Hz, H-26), 0,86 (3H, d, J = 5,0 Hz, H-27), 0,94 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-
21), 1,21 (3H, s, H-19); 1 tín hiệu proton oximetin tại δH 3,60 (1H, m, H-3) và
1 tín hiệu proton olefinic cộng hưởng tại 5,68 (1H, s, H-6).
Hình 4.1.1. Phổ 1
Kết hợp phân tích phổ cacbon 13C và phổ DEPT cho thấy trong 27 tín
hiệu cacbon có 5 tín hiệu của các nhóm metyl tại C 11,45 (C-18), 16,73 (C-
19), 18,36 (C-21), 21,97 (C-26) và 22,22 (C-27); 10 tín hiệu cacbon metilen tại C 20,79 (C-11); 23,39 (C-23); 25,89 (C-15); 28,91 (C-16); 30,22 (C-2); 35,79 (C-22); 35,99 (C-1); 38,07 (C-12); 39.08 (C-24); 41,16 (C-4). 8 tín hiệu
cacbon metin tại C 27,56 (C-25); 35,29 (C-20); 45,06 (C-8); 49,64 (C-9; C-
14); trong đó có 1 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của nhóm oximetin tại C
69,48 (C-3) và 1 tín hiệu đặc trưng cho nối đôi thế 3 lần cộng hưởng tại C
125,07 (C-6); 4 tín hiệu cộng hưởng của cacbon bậc 4 C 38,32 (C-10); 42,78
(C-13); 167,08 (C-5) trong đó có 1 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho một nhóm cacbonyl tại C 203,00 (C-7).
Hình 4.1.2. Phổ 13
Hình 4.1.3.Phổ DETP của hợp chất 1
Kết hợp so sánh các dữ liệu thu được ở trên với số liệu phổ của hợp chất
3β-hydroxycholest-5-en-7-one thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí tương ứng
(bảng 4.1).
Qua đây ta có thể kết luận hợp chất 1 là 3β-hydroxycholest-5-en-7-one
với công thức phân tử là C27H44O2 tương ứng với số khối là 400.
Hình 4.1.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất 1
Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 C δC δCa,b DEPT δHa,c (J, Hz) 1 36,46 35,99 CH2 2 31,29 30,22 CH2 3 70,61 69,48 CH 3,60 m 4 41,90 41,16 CH2 5 165,23 167,08 C 6 126,27 125,07 CH 5,68 s 7 202,40 203,00 C 8 45,52 45,06 CH 9 50,07 49,64 CH 10 38,38 38,07 C 11 21,34 20,79 CH2 12 38,82 38,32 CH2 13 41,90 42,78 C 14 50,07 49,64 CH 15 26,41 25,89 CH2 16 28,60 28,07 CH2 17 54,91 54,45 CH 18 12,07 11,45 CH3 0,70 s 19 17,40 16,73 CH3 1,21 s 20 35,80 35,29 CH 21 18,96 18,36 CH3 0,94 d ( J = 6,0 Hz) 22 36,28 35,79 CH2 23 23,92 23,39 CH2 24 39,58 39,08 CH2 25 28,09 27,56 CH 26 22,64 21,97 CH3 0,83 d (J = 7,0 Hz) 27 22,88 22,22 CH3 0,86 d (J = 5,0 Hz)
4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2:Cholest-7-en-3β,5,6β-triol
Hợp chất 2 cũng được dự đoán là một hợp chất dạng steroit khi hiện
bằng thuốc thử axit sunfuric 10%. Kết quả phân tích phổ proton 1
H, cacbon
13C, DEPT, HSQC cũng cho thấy đây là một hợp chất steroit với 27 tín hiệu
cacbon. Phổ 1
H-NMR cho thấy tín hiệu của 5 nhóm metyl trong đó có 2 nhóm
metyl gắn với cacbon bậc 4 tại H 0,53 s (H-18); 0,89 brs (H-19) và 3 nhóm
metyl gắn với cacbon bậc 3 tại H 0,84 doublet với hằng số J =2,5 Hz (H-27);
0,85 doublet với hằng số J =2,5 Hz (H-26); 0,90 brs (H-21); tín hiệu của 2
nhóm oximetin tại H 3,37 m (H-6); 3,75 m (H-3). Ngoài ra còn xuất hiện một
tín hiệu proton của một nối đôi thế 3 lần cộng hưởng tại H 5,08 brs (H-7).
Hình 4.2.1. Phổ 1
Phổ 13
C-NMR và phổ DEPT cho thấy sự có mặt của 27 nguyên tử C trong đó có 5 nhóm metyl cộng hưởng tại C 11,78 (C-18); 17,64 (C-19); 18,63 (C-21); 22,34 (C-26); 22,62 (C-27); 10 nhóm metylen cộng hưởng tại
C 21,29 (C-15); 22,62 (C-23); 23,26 (C-11); 27,40 (C-16); 31,14 (C-1); 32,41 (C-2); 35,54 (C-22); 38,88 (C-24); 38,96 (C-4); 40,16 (C-12); 8 nhóm
metin cộng hưởng tại C 27,35 (C-25); 35,54 (C-20); 42,22 (C-9); 54,06 (C-
14); 55,54 (C-17); 119,39 (C-7) trong đó xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm
oximetin tại C 65,92 (C-3) và 72,10 (C-6). 4 tín hiệu của cacbon bậc 4 cộng
hưởng tại C 36,59 (C-10); 43,04 (C-13); 139,67 (C-8) và có một tín hiệu cacbon bậc 4 cộng hưởng tại C 74,42(C-5), sự chuyển dịch của tín hiệu cacbon này về phía vùng trường yếu hơn gợi ý sự có mặt của một nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với cacbon này. Ngoài ra còn có tín hiệu của 1 nối đôi thế 3 lần tại C 119,39 (C-7) và C 139,67 (C-8).
Hình 4.2.2. Phổ 13
Hình 4.2.3. Phổ DETP của hợp chất 2
Từ bảng số liệu nhận thấy giá trị tín hiệu cacbon từ C-20 đến C-27 của 2 khá phù hợp với các tín hiệu cacbon của 1 ở trên chứng tỏ hợp chất 1 và 2 có cùng một dạng mạch nhánh.
So sánh các dữ liệu phổ NMR của 2 với các hợp chất có cấu trúc tương tự có thể gợi ý 2 là 3β,5,6β-triolcholest-7-en. Tuy nhiên, không có tài liệu nào công bố đầy đủ các số liệu phổ NMR của hợp chất này. Do đó, kết hợp so
sánh số liệu phổ của hợp chất 2 với 2 hợp chất có phần cấu trúc tương tự là
hợp chất 1 và hợp chất 3β,5α,6β-triolcholest-7-en-24-methylene. Kết quả cho
thấy tại các phần có cấu trúc tương tự thì số liệu phổ thu được là hoàn toàn phù hợp (bảng 4.2).
Hình 4.2.4. Cấu trúc hóa học của 2 hợp chất tham khảo
Cấu trúc của hợp chất 2 được khẳng định thêm dựa trên kết quả phân
tích phổ HSQC, HMBC. Proton H-7 xuất hiện tương tác HMBC với cacbon C-6, C-9 và C-14; proton của nhóm methyl CH3-18 xuất hiện tương tác với cacbon C-12, C-13, C-14 và C-17; proton của nhóm methyl CH3-19 có sự tương tác với các tín hiệu cacbon C-1, C-5, C-9 và C-10; tín hiệu proton của
nhóm methyl CH3-21 tương tác với cacbon C-17, C-20 và C-22; proton của 2
nhóm methyl CH3-26 và CH3-27 có sự tương tác với cacbon C-24, C-25, C-26
Hình 4.2.6.Phổ HMBC của hợp chất 2
Hình 4.2.7. Các tƣơng tác HMBC chính của 2
Qua đây có thể kết luận hợp chất 2 chính là 3β,5,6β-triolcholest-7-en với công thức phân tử C27H46O3 tương ứng với số khối M = 418.
Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 và chất tham khảo C δC1 δC2 δCa. c DEPT δHc. d (J, Hz) HMBC (HC) 1 31,8 - 31,14 CH2 2 34,0 - 32,41 CH2 3 68,4 - 65,92 CH 3,75 m 4 40,9 - 38,96 CH2 5 77,0 - 74,42 C 6 74,4 - 72,10 CH 3,39 m 7 119,2 - 119,39 CH 5,08 brs 6, 9, 14 8 143,8 - 139,67 C 9 44,5 - 42,22 CH 10 38,2 - 36,59 C 11 23,0 - 23,26 CH2 12 40,6 - 40,16 CH2 13 44,9 - 43,04 C 14 55,9 - 54,06 CH 15 24,0 - 21,29 CH2 16 28,7 - 27,40 CH2 17 57,6 - 55,54 CH 18 12,4 - 11,78 CH3 0,53 s 12,13,14,17 19 18,8 - 17,64 CH3 0,89 brs 2, 5, 9, 10 20 - 35,8 35,54 CH 21 - 18,96 18,63 CH3 0,90 brs 17, 20, 22 22 - 36,28 35,54 CH2 23 - 23,92 22,62 CH2 24 - 39,58 38,88 CH2 25 - 28,09 27,35 CH 26 - 22,64 22,34 CH3 0,85 (d, J = 2,5 Hz) 24,25,27 27 - 22,88 22,62 CH3 0,84 (d, J = 2,5 Hz) 24, 25, 26
aĐo trong CDCl3&CD3OD, b125 MHz, c500 MHz,d DMSO-d6 *C 3β-hydroxycholest-5-en-7-one,
KẾT LUẬN
Khóa luận tốt nghiệp với đề tài: “Nghiên cứu phân lập các steroit của
loài hải miên Mycale plumose” đã thu được các kết quả sau:
1, Bằng phương pháp sắc ký cột nhồi chất hấp phụ Silica gel pha thường và sắc kí lớp mỏng điều chế đã phân lập được hai hợp chất steroit từ
hải miên Mycale plumose.
Hợp chất 1: 3β-Hydroxycholest-5-en-7-one
Hợp chất 2: Cholest-7-en-3β,5,6β-triol
2, Cấu trúc của các hợp chất này được xác định nhờ phương pháp phổ hiện đại, bao gồm: phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1
H-NMR, 13C-
NMR, DETP 135, DETP 90), phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HSQC, HMBC) và các dữ liệu phổ đã được công bố.
Hợp chất 1:
3β-Hydroxycholest-5-en-7-one
Hợp chất 2:
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
[1] Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Nguyễn Hải Đăng, (2007), "Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển", Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội.
[2] Phan Văn Kiệm, Phạm Hải Yến, Hoàng Lê Tuấn Anh, Châu Văn Minh, Đan Thị Thúy Hằng, Nguyễn Thị Cúc, Dương Thị Hải Yến, Dương Thị
Dung, (2012), " Các hợp chất sterol phân lập từ loài hải miên Haliclona
subarmigera", Tạp chí hóa học, T. 50(3) 365-368.
[3] Phan Văn Kiệm, Hoàng Lê Tuấn Anh, Phạm Hải Yến, Châu Văn Minh, Đan Thúy Hằng, Nguyễn Thị Cúc, Dương Thị Hải Yến, Dương Thị
Dung, Nguyễn Xuân Nhiệm, Bùi Hữu Tài, Trần Hồng
Quang, (2012), '' Các hợp chất steroit phân lập từ loài hải miên Mycale
plumose", Tạp chí hóa học, T.50(6) 737-741.
Tài liệu tiếng anh
[4] Maysayosh Arai, Shunsuke Ishida, Andi Setiawan, Motomasa Kobayashi (2009), “ Haliclonacyclamines, Tetracyclic, Alkylpiperidine, Alkaloids, as Anti-dormant, Mycobacterial substances from a marine sponge of
Haliclona sp.”, Chem. Parm. Bul, 57(10) 1136 - 1138.
[5] Ru-Ping Wang, Hou-Wen Lin, Ling-zhi Li, Pin-Yi Gao, Ying Xu, Shao-
Jiang Song (2012), “Monoindole alkaloids from a marine sponge Mycale
fibrexilis”, Biochemical Systematics and Ecology, 43(2012) 210 – 213.
[6] Liu R., Cui C. B., Duan L., Gu Q. Q., Zhu W. M. (2005), “Potent in vitro
anticancer activity of metacycloprodigiosin and undecylprodigiosin from
a sponge-derived actinomycete Saccharopolyspora sp. nov..”, Arch
[7] Mar a J. O., Eva Z., M. Carmen S., Javier S., Carballo J. L (2004),
“Structure and cytotoxicity of new metabolites from the sponge Mycale
cecilia”. Tetrahedron, 60(11), 2517-2524.
[8] Peter T. N., John W. B., Murray H. G. M (1991), “Pateamine: a potent
cytotoxin from the New Zealand Marine sponge Mycale sp.”,
Tetrahedron Letters, 32(44), 6411-6414.
[9] P. K. Agrawal (1992), “ NMR spectrosccopy in the structural elucidation of oligosaccharides and glycoside”, Phytochemistry, Vol. 31, 3307 – 3330.
[10] Dictionary of Natural Products on DVD, version 18.1, Copyright® 1982-2009 CRC Press.
[11] Cannell RJP. Natural Products Isolation (1998).
[12] Yong-Cheng Ning. Structure identification of organic compounds with
spectroscopic techniques. WILEY-VCH (2005).
[13] Maria I., Luigi M., Raffaele R. (1988), “Polar steroids from the marine scallop Patinopecten yessoensis”, Journal of Natural Products, 51(6), 1098-1103.
[14] Radhika, p.; Cabeza, M.; Bratoeff, E.; Garcia, G. (2004), “5α-Reductase inhibition activity of steroids isolated from marine soft corals”, Steroids, 69(7), 439-444.
[15] Simon A, Toth G, Liktor-Busa E, Kele Z, Takacs M, Gergely A, Bathori
M. (2007) Three new steroids from the roots of Serratula wolffii.
Steroids, 72, 751-755.
[16] Zsuzsa Szendi, Peter Forgo, Frederick Sweet (1995) “ Complete 1H and
13