2. Nhiệm vụ của đề tài
1.3.2. Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. - Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong quá trình chiết sinh vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh.
Thường thì quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường, quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi, vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau.
Ví dụ:
- Khi chiết các ancaloit, chúng ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Dragendroff và tác nhân Mayer.
- Các flavonoit thông thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozit trợ tim, phản ứng Kedde có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì mà ta lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao. Bên cạnh đó còn có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Các phƣơng pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ [11]
Phương pháp tách chất bằng sắc kí hay còn gọi là phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí
Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh.
Sắc kí gồm có pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…).
Phương pháp sắc kí dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh. Nguyên nhân của sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất bằng phương pháp sắc kí.
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) còn gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:
n = n.b.C 1+b.C
n : Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
n∞ : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó.
B : Hằng số.
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí
Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất tồn tại ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Nếu dựa vào trạng thái tập hợp của pha động người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí và sắc ký lỏng. Còn nếu dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:
1.4.3.1. Sắc ký cột (C.C)
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ vô cùng quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại. Nhưng nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm.Ngoài ra trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPLC), áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi được
gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về
Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5 - 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào
hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Có nhiều phương pháp đưa chất lên cột tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn rồi đưa lên cột. Nếu tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng vật mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải chú ý không được để xuất hiện bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không được nứt, gẫy, dò.
Bên cạnh đó, tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì nó sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
1.4.3.2. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silica
gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký, ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp
chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.
1.5. Một số phƣơng pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [12]
Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các
phương pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, các phương pháp sắc kí so sánh…
1.5.1. Phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các
nhóm hydroxyl là 3300 - 3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C = O trong khoảng
1700 - 1750 cm-1, của nhóm C = C trong vùng 1630 – 1650 cm-1, của nhóm ete
C – O – C trong vùng 1020 – 1100 cm-1,... Đặc biệt vùng dưới 700 cm-1 được
gọi là vùng vân tay, nó được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp.
Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mà lượng chất cần để thực hiện phép đo này lại cần đến 2 – 3 mg chất và khó thu
hồi lại. Vì vậy, thường đối với các hợp chất thiên nhiên thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác như phổ cộng hưởng từ hạt nhân hay phổ khối lượng.
1.5.2. Phổ khối lượng
Phổ khối lượng được dùng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ. Phổ khối lượng được chế tạo để thực hiện 3 nhiệm vụ cơ bản:
- Chuyển chất nghiên cứu thành thể khí. - Tạo ra các phân tử ion.
- Phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo tỉ lệ khối lượng trên điện tích (m/z) của chúng.
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:
- Phổ EI-MS dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV.
- Phổ ESI-MS gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với
năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
- Phổ FAB-MS là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
- Phổ khối lượng phân giải cao cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
- Hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí - khối phổ) cho các chất dễ bay hơi như tinh dầu hay LC-MS (sắc kí lỏng - khối phổ) cho các hợp chất khác. Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất.
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu khoa học có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và
cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1
H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
1.5.3.1. Phổ 1
H-NMR
Trong phổ 1
H-NMR, độ dịch chuyển hoá học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
1.5.3.2. Phổ 13
C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13
1.5.3.3. Phổ DEPT
Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên
phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3
nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ
DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH.
1.5.3.4. Phổ 2D-NMR
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số phổ chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HSQC: Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các
tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1
H-NMR, còn trục kia là
13
C-NMR. Các tương tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY): Phổ này biểu diễn các tương tác
xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
- Phổ HMBC: Đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
- Phổ NOESY: Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ hạt nhân để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng