2. Nhiệm vụ của đề tài
1.5.3.Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu khoa học có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và
cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1
H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
1.5.3.1. Phổ 1
H-NMR
Trong phổ 1
H-NMR, độ dịch chuyển hoá học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
1.5.3.2. Phổ 13
C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13
1.5.3.3. Phổ DEPT
Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên
phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3
nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ
DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH.
1.5.3.4. Phổ 2D-NMR
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số phổ chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HSQC: Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các
tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1
H-NMR, còn trục kia là
13
C-NMR. Các tương tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY): Phổ này biểu diễn các tương tác
xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
- Phổ HMBC: Đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
- Phổ NOESY: Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ hạt nhân để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ có cường độ mạnh hơn.
Bên cạnh đó, người ta còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơnghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Tuy nhiên phạm vi sử dụng của phổ này hạn chế vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ.
Bên cạnh việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh, kết hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính xác được chiều dài các mạch, cũng như đối với các phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi sau đó xác định bằng phương pháp so sánh LC- MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu động vật
Mẫu hải miên Mycale plumose được thu vào tháng 6 năm 2011 Cát Bà,
Hải Phòng. Tên khoa học được PGS.TS Đỗ Công Thung, Viện Tài nguyên và Môi trường biển giám định. Mẫu tiêu bản được lưu trữ tại viện Tài nguyên và Môi trường biển, Hải Phòng và Viện Hóa sinh biển.
2.2. Phƣơng pháp phân lập các chất hữu cơ
2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 và RP18 F254 (Merck-Đức). Các vệt chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là
dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến
khi hiện màu.
2.2.2. Sắc kí cột (CC)
Sắc ký cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ pha thường (Silica gel 240 - 430 mesh, Merck) hoặc pha đảo (YMC, ODS-60-14/63, Fujisilisa - Nhật Bản).
2.3. Phƣơng pháp phổ
2.3.1. Phổ khối lượng (EIS – MS)
Phổ khối lượng (EIS – MS) được đo trên máy AGILENT 1200 LC – MSD Trap, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT- NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
2.4. Dụng cụ và thiết bị
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:
- Bình chiết 5, 10, 20 lít. - Máy cô quay chân không.
- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm và 365 nm. - Micropipet.
- Tủ sấy chân không. - Máy sấy, bếp điện
- Bình sắc ký loại phân tích và điều chế. - Cột sắc ký pha ngược trung áp.
- Cột sắc ký pha thường các loại đường kính. - Máy phun dung dịch thuốc thử.
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc
- Thiết bị đo điểm nóng chảy Kofler micri-hotstage.
- Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer.
2.5. Hoá chất
- Silica gel 60 (0,04-0,063 mm) Merck.
- Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, Fujisilica Chemical Ltd).
- Bản mỏng có pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715). - Bản mỏng pha đảo RP18 F254s (Merck).
- Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
- Các loại dung môi hữu cơ như metanol, etanol, etyl axetat, cloroform, hecxan, axetone...
CHƢƠNG 3 THỰC NGHIỆM
3.1. Xử lí mẫu
Hải miên Mycale plumose tươi (20 kg) được làm sạch, thái nhỏ, phơi khô, sau cùng đem nghiền nhỏ thành bột.
3.2. Phân lập các hợp chất
Bột hải miên Mycale plumose khô được chiết 3 lần bằng metanol (ở
50oC, mỗi lần 3 giờ). Các dịch chiết được lọc qua phễu hút chân không, loại
bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được 50 gam cặn chiết metanol. Cặn chiết này được hòa tan vào 1 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần là hecxan, cloroform, etyl axetat và butanol (3 lần x 1L). Lớp dung môi hữu cơ thu được qua 3 lần chiết được loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được 7 gam cặn hecxan, 20 gam cặn cloroform, 10 gam cặn etyl axetat và 3 gam cặn butanol.
Cặn cloroform được hòa tan, tẩm bằng silica gel pha thường (tỉ lệ 1/2), cất loại dung môi dưới áp suất giảm đến khô rồi nghiền mịn. Hỗn hợp này được phân tách thô trên cột sắc ký với chất hấp thụ là silica gel pha thường, sử dụng hệ dung môi hecxan /etyl axetat (gradien từ 100/0 – 0/100, v/v) thu được 5 phân đoạn (MP1 – MP5). Phân đoạn MP5 được hòa tan bằng cloroform, tẩm bằng silica gel pha thường (tỉ lệ 1/1), cất loại dung môi đến khô rồi nghiền mịn. Hỗn hợp này được tiến hành tinh chế trên cột sắc ký pha thường với hệ dung môi rửa giải cloroform/metanol (8/1, v/v) kết hợp với sắc ký lớp mỏng điều chế thu được 2 hợp chất 1 (5 mg) và 2 (5 mg).
Hình 3.1. Sơ đồ phân lập hợp chất 1 và 2
Mẫu hải miên tươi Mycale plumose
(thái nhỏ, phơi khô, nghiền nhỏ) (20 kg) Cặn MeOH (50 g) Cặn hecxan (7 g) 9 Cặn cloroform (20 g) Cặn etyl axetat (10 g) Cặn butanol (3 g)
Chiết với MeOH x 3 lần
Chiết phân bố với các dung môi
MP3 2 (5mg) 1 (5mg) MP4 MP5 MP1 MP2
Sắc kí cột silica gel pha thường (1/1.5); Hecxan/etyl axetat (100/0 – 0/100)
Sắc ký cột silica gel pha thường; Cloroform/metanol (8/1, v/v)
3.3. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã đƣợc phân lập[3]
3.3.1. Hợp chất 1
Tên khoa học: 3β-Hydroxycholest-5-en-7-one
Tinh thể màu trắng ESI-MS m/z 423 [M+Na]+ Công thức phân tử C27H44O2 (M = 400). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 3.3.2. Hợp chất 2
Tên khoa học: 3β,5,6β-Triolcholest-7-en
Chất bột màu trắng.
ESI-MS m/z 401 [M-H2O+H]+
Công thức phân tử C27H46O3 (M = 418).
1
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1:3β-Hydroxycholest-5-en-7-one 7-one
Hợp chất 1 nhận được dưới dạng chất bột màu trắng. Vệt chất xuất hiện màu tím hồng, sau đó chuyển dần sang tím xanh trên sắc ký lớp mỏng (TLC) với thuốc thử đặc hiệu (phun dung dịch H2SO4 10% rồi hơ nóng từ từ) cho
thấy đây là một steroit. Các dữ liệu phổ 1
H-NMR, 13C-NMR và DEPT cũng
cho thấy đây là một hợp chất dạng steroit. Trên phổ proton xuất hiện tín hiệu
đặc trưng của 5 nhóm metyl cộng hưởng tại H 0,70 (s, H-18); 0,83 (3H, d, J
= 7,0 Hz, H-26), 0,86 (3H, d, J = 5,0 Hz, H-27), 0,94 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-
21), 1,21 (3H, s, H-19); 1 tín hiệu proton oximetin tại δH 3,60 (1H, m, H-3) và
1 tín hiệu proton olefinic cộng hưởng tại 5,68 (1H, s, H-6).
Hình 4.1.1. Phổ 1
Kết hợp phân tích phổ cacbon 13C và phổ DEPT cho thấy trong 27 tín
hiệu cacbon có 5 tín hiệu của các nhóm metyl tại C 11,45 (C-18), 16,73 (C-
19), 18,36 (C-21), 21,97 (C-26) và 22,22 (C-27); 10 tín hiệu cacbon metilen tại C 20,79 (C-11); 23,39 (C-23); 25,89 (C-15); 28,91 (C-16); 30,22 (C-2); 35,79 (C-22); 35,99 (C-1); 38,07 (C-12); 39.08 (C-24); 41,16 (C-4). 8 tín hiệu
cacbon metin tại C 27,56 (C-25); 35,29 (C-20); 45,06 (C-8); 49,64 (C-9; C-
14); trong đó có 1 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của nhóm oximetin tại C
69,48 (C-3) và 1 tín hiệu đặc trưng cho nối đôi thế 3 lần cộng hưởng tại C
125,07 (C-6); 4 tín hiệu cộng hưởng của cacbon bậc 4 C 38,32 (C-10); 42,78
(C-13); 167,08 (C-5) trong đó có 1 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho một nhóm cacbonyl tại C 203,00 (C-7).
Hình 4.1.2. Phổ 13
Hình 4.1.3.Phổ DETP của hợp chất 1
Kết hợp so sánh các dữ liệu thu được ở trên với số liệu phổ của hợp chất
3β-hydroxycholest-5-en-7-one thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí tương ứng
(bảng 4.1).
Qua đây ta có thể kết luận hợp chất 1 là 3β-hydroxycholest-5-en-7-one
với công thức phân tử là C27H44O2 tương ứng với số khối là 400.
Hình 4.1.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất 1
Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 C δC δCa,b DEPT δHa,c (J, Hz) 1 36,46 35,99 CH2 2 31,29 30,22 CH2 3 70,61 69,48 CH 3,60 m 4 41,90 41,16 CH2 5 165,23 167,08 C 6 126,27 125,07 CH 5,68 s 7 202,40 203,00 C 8 45,52 45,06 CH 9 50,07 49,64 CH 10 38,38 38,07 C 11 21,34 20,79 CH2 12 38,82 38,32 CH2 13 41,90 42,78 C 14 50,07 49,64 CH 15 26,41 25,89 CH2 16 28,60 28,07 CH2 17 54,91 54,45 CH 18 12,07 11,45 CH3 0,70 s 19 17,40 16,73 CH3 1,21 s 20 35,80 35,29 CH 21 18,96 18,36 CH3 0,94 d ( J = 6,0 Hz) 22 36,28 35,79 CH2 23 23,92 23,39 CH2 24 39,58 39,08 CH2 25 28,09 27,56 CH 26 22,64 21,97 CH3 0,83 d (J = 7,0 Hz) 27 22,88 22,22 CH3 0,86 d (J = 5,0 Hz)
4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2:Cholest-7-en-3β,5,6β-triol
Hợp chất 2 cũng được dự đoán là một hợp chất dạng steroit khi hiện
bằng thuốc thử axit sunfuric 10%. Kết quả phân tích phổ proton 1
H, cacbon
13C, DEPT, HSQC cũng cho thấy đây là một hợp chất steroit với 27 tín hiệu
cacbon. Phổ 1
H-NMR cho thấy tín hiệu của 5 nhóm metyl trong đó có 2 nhóm
metyl gắn với cacbon bậc 4 tại H 0,53 s (H-18); 0,89 brs (H-19) và 3 nhóm
metyl gắn với cacbon bậc 3 tại H 0,84 doublet với hằng số J =2,5 Hz (H-27);
0,85 doublet với hằng số J =2,5 Hz (H-26); 0,90 brs (H-21); tín hiệu của 2
nhóm oximetin tại H 3,37 m (H-6); 3,75 m (H-3). Ngoài ra còn xuất hiện một
tín hiệu proton của một nối đôi thế 3 lần cộng hưởng tại H 5,08 brs (H-7).
Hình 4.2.1. Phổ 1
Phổ 13
C-NMR và phổ DEPT cho thấy sự có mặt của 27 nguyên tử C trong đó có 5 nhóm metyl cộng hưởng tại C 11,78 (C-18); 17,64 (C-19); 18,63 (C-21); 22,34 (C-26); 22,62 (C-27); 10 nhóm metylen cộng hưởng tại
C 21,29 (C-15); 22,62 (C-23); 23,26 (C-11); 27,40 (C-16); 31,14 (C-1); 32,41 (C-2); 35,54 (C-22); 38,88 (C-24); 38,96 (C-4); 40,16 (C-12); 8 nhóm
metin cộng hưởng tại C 27,35 (C-25); 35,54 (C-20); 42,22 (C-9); 54,06 (C-
14); 55,54 (C-17); 119,39 (C-7) trong đó xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm
oximetin tại C 65,92 (C-3) và 72,10 (C-6). 4 tín hiệu của cacbon bậc 4 cộng
hưởng tại C 36,59 (C-10); 43,04 (C-13); 139,67 (C-8) và có một tín hiệu cacbon bậc 4 cộng hưởng tại C 74,42(C-5), sự chuyển dịch của tín hiệu cacbon này về phía vùng trường yếu hơn gợi ý sự có mặt của một nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với cacbon này. Ngoài ra còn có tín hiệu của 1 nối đôi thế 3 lần tại C 119,39 (C-7) và C 139,67 (C-8).
Hình 4.2.2. Phổ 13
Hình 4.2.3. Phổ DETP của hợp chất 2
Từ bảng số liệu nhận thấy giá trị tín hiệu cacbon từ C-20 đến C-27 của 2 khá phù hợp với các tín hiệu cacbon của 1 ở trên chứng tỏ hợp chất 1 và 2 có cùng một dạng mạch nhánh.
So sánh các dữ liệu phổ NMR của 2 với các hợp chất có cấu trúc tương tự có thể gợi ý 2 là 3β,5,6β-triolcholest-7-en. Tuy nhiên, không có tài liệu nào công bố đầy đủ các số liệu phổ NMR của hợp chất này. Do đó, kết hợp so
sánh số liệu phổ của hợp chất 2 với 2 hợp chất có phần cấu trúc tương tự là
hợp chất 1 và hợp chất 3β,5α,6β-triolcholest-7-en-24-methylene. Kết quả cho
thấy tại các phần có cấu trúc tương tự thì số liệu phổ thu được là hoàn toàn phù hợp (bảng 4.2).
Hình 4.2.4. Cấu trúc hóa học của 2 hợp chất tham khảo
Cấu trúc của hợp chất 2 được khẳng định thêm dựa trên kết quả phân
tích phổ HSQC, HMBC. Proton H-7 xuất hiện tương tác HMBC với cacbon C-6, C-9 và C-14; proton của nhóm methyl CH3-18 xuất hiện tương tác với cacbon C-12, C-13, C-14 và C-17; proton của nhóm methyl CH3-19 có sự tương tác với các tín hiệu cacbon C-1, C-5, C-9 và C-10; tín hiệu proton của
nhóm methyl CH3-21 tương tác với cacbon C-17, C-20 và C-22; proton của 2
nhóm methyl CH3-26 và CH3-27 có sự tương tác với cacbon C-24, C-25, C-26
Hình 4.2.6.Phổ HMBC của hợp chất 2
Hình 4.2.7. Các tƣơng tác HMBC chính của 2
Qua đây có thể kết luận hợp chất 2 chính là 3β,5,6β-triolcholest-7-en với công thức phân tử C27H46O3 tương ứng với số khối M = 418.
Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 và chất tham khảo C δC1 δC2 δCa. c DEPT δHc. d (J, Hz) HMBC (HC) 1 31,8 - 31,14 CH2 2 34,0 - 32,41 CH2 3 68,4 - 65,92 CH 3,75 m 4 40,9 - 38,96 CH2 5 77,0 - 74,42 C 6 74,4 - 72,10 CH 3,39 m 7 119,2 - 119,39 CH 5,08 brs 6, 9, 14 8 143,8 - 139,67 C 9 44,5 - 42,22 CH 10 38,2 - 36,59 C 11 23,0 - 23,26 CH2