Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào trần từ lá cây tắc Tắc (Fotunella japonica) in vitro

TÓM TẮT Ứng dụng công nghệ sinh học trong việc tạo giống cây trồng mới đã được các nhà khoa học trên thế giới thực hiện rất thành công, một trong những ứng dụng này là việc nuôi cấy-dung

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin gởi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Bách Khoa – Đại Quốc Gia Tp HCM đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Xin cảm ơn cha mẹ đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi có thể học tập tốt và an tâm hoàn thành tốt luận văn

Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam đã tạo điều kiện cho tôi được nghiên cứu và thực hiện luận văn tốt nghiệp tại Viện

Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thanh Bình đã tận tình

hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị thuộc phòng Công nghệ sinh học – Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam đã động viên tinh thần và nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiên để tôi thực hiện tốt luận văn

Các bạn sinh viên lớp HC06BSH đã cùng tôi học tập trao đổi kiến thức giúp tôi học tập tốt

TÓM TẮT

Ứng dụng công nghệ sinh học trong việc tạo giống cây trồng mới đã được các nhà khoa học trên thế giới thực hiện rất thành công, một trong những ứng dụng này là việc nuôi cấy-dung hợp tế bào trần tạo được nhiều giống cây trồng mới có năng suất và chất lượng cao góp phần đa dạng di truyền nguồn gene cây trồng trên toàn thế giới

Các ứng dụng này trên các giống loài cây có múi khác nhau cũng được các nhà khoa học trên thế giới thành công rất nhiều, do đó việc ứng dụng này để cải thiện các giống cam quýt của Việt Nam là cần thiết đặc biệt là các giống bưởi, quít ngon của Việt Nam còn nhiều đặc tính cần cải thiện như nhiều hạt và mẫn cảm với nhiều loại bệnh hại đặc biệt là bệnh VLG

Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào trần từ lá cây tắc Tắc (Fotunella japonica) in vitro, bao gồm hai nội dung chính là 1 Nghiên cứu Xác định nồng độ

các loại enzyme và thời gian xử lý nhằm phân lập tế bào trần từ lá cây tắc có hiệu quả cao nhất, và xác định quy trình ly tâm tinh sạch tế bào trần và 2 Thử nghiệm nuôi cấy tế bào trần cây tắc trên các môi trường nhằm tái sinh tế bào trần thành mô sẹo

Sử dụng phương pháp phân lập tế bào trần qua 2 bước với việc áp dụng các enzyme phân giải vách tế bào là cellualse (2%) và pectinase (0,2 – 0,3%) đã được áp dụng để phân lập tế bào trần từ lá cây Tắc đạt được số lượng tế bào trần nguyên vẹn rất cao 5,51 x 107 tế bào/1 g lá sau 16 giờ ủ trong dung dịch enzyme và tinh sạch qua dung dịch rửa và ly tâm 850 vòng/phút trong 10 phút Đã nuôi cấy thành công tế bào trần cây tắc tạo mô sẹo trên môi trường MT (Murashige and Tucker 1969) cơ bản không có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng

MỤC LỤC

CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu cần đạt 3

1.3 Nội dung nghiên cứu 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Phân loại và nguồn gốc cây có múi 4

2.1.1 Phân loại 4

2.1.2 Nguồn gốc cây có múi 4

2.1.3 Tổng quan về bệnh VLG trên cây có múi 5

2.1.4 Các nghiên cứu về cây có múi 7

2.2 Thành phần và cấu trúc vách tế bào thực vật 11

2.2.1 Cellulose 12

2.2.2 Hemicellulose 12

2.2.3 Pectin 12

2.2.4 Lignin 12

2.3 Tế bào trần 13

2.3.1 Định nghĩa 13

2.3.3 Ứng dụng của tế bào trần 14

2.4 Phân lập tế bào trần 14

2.4.1 Nguyên liệu dùng để phân lập tế bào trần 14

2.4.2 Tạo mô sẹo và huyền phù tế bào làm nguyên liệu phân lập tế bào trần 15

2.4.3 Enzyme dùng để tách tế bào trần 18

2.4.4 Phương pháp chung phân lập tế bào trần 21

2.5 Cấy tế bào trần 24

2.5.1 Môi trường nuôi cấy tế bào trần 24

2.5.2 Các phương pháp nuôi cấy tế bào trần 25

2.6 Sơ lược một số thành tựu của kỹ thuật tế bào trần trên cây có múi 26

2.7 Giới thiệu một quy trình phân lập và nuôi cấy tế bào trần cây tắc [10] 29

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 31

3.2 Vật liệu và dụng cụ 31

3.2.1 Vật liệu 31

3.2.2 Dụng cụ 31

3.2.3 Hóa chất và thiết bị 32

3.3 Các bước thực hiện 33

3.3.1 Chuẩn bị dung dịch phân lập tế bào trần 33

3.3.2 Chuẩn bị mẫu lá tắc 35

3.4 Phương pháp 36

3.4.1 Phương pháp phân lập tế bào trần từ mô lá tắc 36

3.4.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào trần thu được từ lá tắc 37

3.4.3 Bố trí thí nghiệm 37

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42

4.1 Ảnh hưởng các nồng độ enzyme lên tổng số tế bào trần thu được từ mô lá cây tắc sau khi phân lập 42

4.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme lên số TBT thịt lá cây tắc sau khi phân lập 43

4.3 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm lên số tế bào trần thịt lá cây tắc 43

4.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự hình thành dòng mô sẹo từ tế bào trần cây tắc in vitro 44

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Đề nghị 46

Phương pháp phân lập tế bào trần từ mô lá tắc 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 53

CÁC TỪ VIẾT TẮT

IAA : 3-indolyl-acetic acid BAP : 6-benzynlaminopurine MES : 2(N-morpholino) ethanol sulfonic acid

MS : (Murashige và Skoog, 1962)

MT : (Murashige và Tucker, 1969) NAA : 1-naphthalene acetic acid TBT : Tế bào trần

VLG : Vàng lá Greening CCM : Cây có múi

RCC : Rầy chổng cánh

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Một số loại cây có múi 4

Bảng 2.1 Các giống và loài cây có múi được tái sinh trong phòng thí nghiệm 28

Bảng 3.1 Dung dịch A (DD Enzyme) 34

Bảng 3.2 Dung dịch B (DD rửa) 34

Bảng 3.3 Dung dịch C (ly tâm thu nhận TBT) 34

Bảng 3.4 Dung dịch D (ly tâm thu nhận TBT) 35

Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm 1 38

Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm 2 39

Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm 3 40

Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm 4 41

Bảng 4.1: Ảnh hưởng các nồng độ enzyme lên tổng số tế bào trần thu được từ mô lá cây tắc (tế bào x 107/g) 42

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme lên số TBT thịt lá cây tắc (tế bào x 107/g) 43

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm lên số tế bào trần thịt lá cây tắc (tế bào x 106/g) 44

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc tế bào thực vật 11

Hình 2.2 Cấu trúc vách tế bào thực vật 11

Hình 2.3 Vị trí phân cắt của enzyme cellualase 18

Hình 2.4 Một số loại enzyme thông dụng phân lặp tế bào trần 19

Hình 3.1 Enzyme cellulase 32

Hình 3.2 Enzyme pectinase 33

Hình 3.3 Mẫu lá cắt thành mảnh vuông 35

Hình 3.4 Mẫu lá cắt dọc theo gân chính 35

Hình 4.1 Tế bào trần lá tắc (vật kính 40X) 42

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cây có múi thuộc họ Rutaceae và có khoảng 150 chi, 1600 loài được trồng ở vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới Họ Rutaceae được chia ra thành bảy họ

phụ gồm 93 chi (Enger, 1931) Cây có múi có nguồn gốc ở chân núi Hy Mã Lạp Sơn ở miền đông bắc Ấn Độ và được trồng ở rất nhiều vùng trên thế giới (FAO,

1998 ) Ở Việt Nam, cây có múi được trồng từ Bắc tới Nam, diện tích tập trung chủ yếu ở 3 vùng trọng điểm: đồng bằng sông Cửu Long (trên 80% tổng diện tích), vùng trung du miền núi phía Bắc (khoảng 17%) và Bắc Trung bộ (khoảng 12%) (Vũ Mạnh Hải, 1999) Ở miền Bắc nhiều giống cây có múi đặc sản nổi tiếng như Bưởi Diễn, Cam Canh Hà Nội, Cam Sành Hà Giang, cam Xã Đoài Riêng ĐBSCL, cây có múi tập trung ở các tỉnh Tiền Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp và Cần Thơ với các chủng loại đặc sản như bưởi Năm Roi, bưởi Da Xanh, quýt Tiều, quýt Đường, cam Mật, cam Sành, v.v Tuy đem lại nguồn kinh tế cao nhưng cây có múi nhiễm không ít bệnh nguy hiểm và ngành trồng cây có múi vẫn đang đứng trước những thách thức rất lớn

Bệnh Greening là một trong những bệnh hại quan trọng trên cây có múi Bệnh được ghi nhận đầu tiên tại Nam Phi vào năm 1947 và hiện nay bệnh này đã và đang lan rộng trên 50 quốc gia, gây thiệt hại cho ngành sản xuất cây ăn quả có múi trên toàn thế giới (Bar Joseph at al., 1989) Ở Việt Nam, bệnh được ghi nhận từ năm 1960 và hiện nay nhiều vườn cây đã bị chặt bỏ hoàn toàn chỉ sau vài năm trồng do người dân chiết hoặc ghép từ cây đã bị nhiễm bệnh

Kết quả điều tra đã ghi nhận hầu hết các vườn trồng cây có múi ở các tỉnh phía Bắc - Việt Nam như Hà Giang, Tuyên Quang, Nghệ An đều có tỷ lệ cây

diện tích trồng cam Sành có năng suất thấp, bị bệnh đã bị người nông dân phá bỏ để trồng lúa hoặc thay thế bằng cây trồng khác.(Hà Minh Trung, 2008) Bệnh lây lan nhanh trên đồng ruộng thông qua nhân giống vô tính và môi giới truyền

bệnh là rầy chổng cánh (Diaphorina citri)

Để hạn chế bệnh lây lan trên đồng ruộng nhiều giải pháp đã được đề xuất như trồng mới bằng cây giống sạch bệnh, phòng trừ tổng hợp vector truyền bệnh VLG trong đó chú ý biện pháp quản lý cây giống sạch bệnh trước khi trồng, thời điểm trồng và biện pháp trồng xen cây giống sạch bệnh trong vườn ổi Nghiên cứu giống kháng hoặc chống chịu bệnh VLG cũng được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm đầu tư nghiên cứu chọn tạo giống kháng/chống chịu đối với bệnh này Trong một báo cáo gần đây, Toru Iwanami, 2010 báo cáo xác định

được giống quít Unzoki (C keraji hort ex Tanaka var unzoki hort ex Tanaka)

có khả năng chống chịu tốt bệnh VLG, cây quít này sau hai năm nhiễm bệnh VLG (phản ứng dương tính khi chẩn đoán bằng PCR) có khả năng sinh trưởng tốt không kém so với cây không bị nhiễm bệnh (số liệu chưa công bố) Do Việt Nam là một trong những quốc gia vùng lãnh thổ nằm trong khu vực khởi nguyên nguồn gốc cây có múi với tập quán trồng từ hạt có từ rất nhiều năm trước đây, vì vậy, Cây có múi Việt Nam có một sự đa dạng di truyền rất lớn và có ý nghĩa khoa học trong việc chọn lọc giống cây có múi có khả năng kháng hoặc chống chịu tốt với bệnh này Việc điều tra, thu thập và đánh giá nguồn gene cây có múi Việt Nam có tính chống chịu bệnh VLG là một công việc cấp thiết, tạo tiền đề cho việc chọn tạo giống kháng/chống chịu bệnh VLG để phát triển ngành công nghiệp CCM Việt Nam Một trong những kết quả đạt được gần đây mà các tác giả đã báo cáo cây Tắc (còn gọi là cây Quất) có khả năng chống chịu tốt với bệnh VLG và đang được các nhà khoa học trên thế giới chú ý đến công tác lai tạo giống mới tạo ra giống có khả năng kháng hay chống chịu với bệnh này, do

vậy, đề tài Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào trần từ lá cây Tắc

(Fotunella japonica) in vitro được thực hiện nhằm đáp ứng việc nghiên cứu cơ

bản, tạo tiền đề cho những nghiên cứu lai tạo giống mới bằng dung hợp tế bào trần tạo giống kháng bệnh VLG hoặc có những đặc tính mong muốn

1.2 Mục tiêu cần đạt

Hoàn thiện quy trình phân lập tế bào trần từ lá cây tắc và bước đầu xác định môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo từ tế bào trần cây tắc

1.3 Nội dung nghiên cứu

Bao gồm 2 nội dung chính:

Xác định nồng độ các loại enzyme và thời gian xử lý nhằm phân lập tế bào trần từ lá cây tắc có hiệu quả cao nhất, và xác định quy trình ly tâm tinh sạch tế bào trần

Thử nghiệm nuôi cấy tế bào trần cây tắc trên các môi trường nhằm tái sinh tế bào trần thành mô sẹo

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Phân loại và nguồn gốc cây có múi

2.1.1 Phân loại

Cây có múi (Citrus) có vị trí phân loại là:

Ngành Angiospermae (hạt kín)

Lớp dicotyledones (hai lá mầm)

Bộ Rutales (cam)

Họ Rutaceae (cam)

Bảng 2.1 Một số loại cây có múi

Tên Tiếng Anh Tên La Tinh Tên Việt Nam

Calamondin Citrofortunella mitis Tắc, quất

2.1.2 Nguồn gốc cây có múi

Hầu hết các loại thuộc cây có múi có nguôn gốc ở vùng nhiệt đới châu Á, từ những vùng này phổ biến đến các khu vực khác trên thế giới Theo Viện Tài

Nguyên Di Truyền Thực Vật Thế Giới (IBPGR, 1986) chỉ có chanh giấy (Citrus rantifalia Swingle) là một trong những loài thuộc nhóm cây có múi còn được tìm

au-thấy mọc hoang dại, còn việc xác định nguồn gốc nguyên thủy của hầu hết các loài

khác trong nhóm này đều rất giới hạn Cũng theo IBPGR(1986), cam mật (Citrus sinensis Osbeck) có thể có nguồn gốc từ miền nam Trung Quốc, Đông Dương hoặc miền nam Việt Nam, cam chua (Citrus aurantium L.) có thể có nguồn gốc từ các nước Đông Nam Á, quýt (Citrus reticulata Blanco) có thể khởi thủy từ Philippine hoặc vùng Đông Dương, chanh giấy (Citrus aurantifolia Swingle) hoang dại ở vùng

bắc Ấn Độ và vùng quần đảo Malayxia có thể cho thấy những vùng này là khởi nguyên của chúng

Cây bưởi (Citrus maxima Merr.) và chanh tây (Citrus limon Burn.) cả hai có

thể có nguồn gốc từ vùng Đông Nam Á Khu vực phía đông của Hy Mã Lạp Sơn thuộc vùng Bắc Miến Điện và miền nam Trung Quốc được xem như vùng khởi

thủy của loài chanh tây Bưởi chùm (Citrus paradise Macf.) xuất hiện khá gần đây,

giống này có thể có nguồn gốc từ sự biến dị của bưởi hoặc do sự giao phấn của bưởi và cam mật vào khoảng trước năm 1750 trong vùng quần đảo Tây Ấn [2]

2.1.3 Tổng quan về bệnh VLG trên cây có múi

VLG là bệnh gây thiệt hại nặng nề cho nền sản xuất CCM trên thế giới, nhất là ở Châu Phi và Châu Á Bệnh được gọi bằng nhiều tên khác nhau ở mỗi quốc gia: Huanglongbing hay vàng đọt (Trung Quốc), Likubin (Đài Loan), Vàng đốm lá (Phi-lippine),Vàng chết nhanh (Ấn Độ)

Bệnh VLG xuất hiện từ năm 1894 tại Trung Quốc, vào năm 1919 Reinking đã có bài báo cáo về bệnh và 1947 một lần nữa bệnh được báo cáo tại Nam Phi mặc dù trước

1929 bệnh đã xuất hiện rộng rãi Bệnh VLG đã lan rộng trên 50 quốc gia ảnh hưởng nghiêm trọng đến các nước thuộc khu vực Châu Phi, Châu Á Hiện chưa có báo cáo chính thức về thiệt hại do bệnh gây ra tuy nhiên với thông số điển hình như ở Thái Lan 95% CCM thuộc khu vực phía Bắc và Đông nhiễm bệnh, ở Philippines mức độ nhiễm

bệnh lên đến 7 triệu CCM và nhìn chung hơn 60 triệu CCM đã bị tàn phá ở 2 châu lục này

Tại Việt Nam dịch bệnh VLG đã tàn phá nặng nề các vườn CCM từ Nam chí Bắc vào những thập niên 1970-1980, tuy đã xác định được nguyên nhân gây bệnh

1975 nhưng hướng giải quyết còn nhiểu khó khăn, thế nên ước tính mỗi năm chỉ riêng ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long thiệt hại khoảng 180 tỷ đồng

Hiện cả trong, ngoài nước đã có nhiều nghiên cứu về bệnh và xác định bệnh lây truyền qua 2 con đường là mắt ghép và côn trùng truyền bệnh Theo báo cáo Gar-nier và cộng tác viên tác nhân gây bệnh VLG là vi khuẩn Gram âm hiện diện trong mô libe Đặc tính của dòng khuẩn này được xác định thông qua việc định vị chuỗi gene 16S ribosome DNA và protein trong ribosome

Có 2 loài vi khuẩn gây bệnh VLG trên CCM: 1.dòng khuẩn gây hại ở Châu Phi

Candidatus Liberibacter africanus do rầy chổng cánh Trioza erytreae là môi giới truyền

bệnh, dòng vi khuẩn này mẫn cảm với khí hậu nóng, thể hiện triệu chứng bệnh ở nhiệt độ khoảng 22-240C 2.dòng khuẩn Châu Á (có Việt Nam) Candidatus Liberibacter asia-

ticus do rầy chổng cánh Diaphorina citri là môi giới truyền bệnh ( Aubert và

Quili-ci,1984; Bové và cộng sự, 1980) Dòng khuẩn này được xếp vào nhóm chống chịu với khí hậu nóng nhiệt độ thích hợp thể hiện triệu chứng bệnh từ 27-320C

Rầy chổng cánh thuộc loại côn trùng chích hút, biến thái không hoàn toàn.RCC có kích thước 3,2 – 3,5 mm, màu nâu xám, có 9-10 đốt râu màu nâu đỏ, đầu có 2 mảnh nhọn nhô ra phía trước, cánh xếp thành hình mái nhà.Chúng thích hợp với điều kiện nhiệt độ 30,90C, ẩm độ 73,7%

Cây bị bệnh VLG: lá có triệu chứng gân lá sưng phù do sự phân chia tế bào luôn xảy ra, mô kế cận bị vàng sau đó vàng toàn lá gân lá sần sùi lên vàng rụng sớm giống như triệu chứng thiếu kẽm; quả nhỏ bị lệch tâm và biến chất từ ngọt sang chua vị đắng độ đường thấp hơn bình thường Nguyên nhân dẫn đến tình trạng

trên do mô libe bị tắc nghẽn Ngoài ra có giả thuyết cho rằng mật số vi khuẩn tăng sẽ làm rối loạn hoạt động sinh lý của cây, gây xáo trộn dinh dưỡng, tắc nghẽn con đường vận chuyển chất dinh dưỡng gây thiếu: Zn, Mn, Bo, Mg…Rễ cây bị bệnh cũng bị nghẽn mạch dẫn, không nuôi được rễ tơ nên hầu hết bộ rễ sẽ bị huỷ hoại theo thời gian và cây sẽ chết sau 2-5 năm tuỳ mức độ nhiễm (Aubert,1988)

Theo Lê Thị Thu Hồng (2000) bệnh VLG có thể giám định tương đối qua mắt thường bằng cách nhận diện tổng hợp triệu chứng trên lá và trái ở ngoài đồng Hiện tại VNCCAQMN đã có bộ kit Iod dựa trên nghiên cứu các viện cho phép chuẩn đoán nhanh bệnh VLG

2.1.4 Các nghiên cứu về cây có múi

- Môi trường và điều kiện nuôi cấy

Năm 1969, Murashige và Tucker đưa ra một số yếu tố môi trường cần thiết cho sự phát triển của mô cây có múi Ngày nay môi trường Murashige và Tucker (MT) thường được dùng như môi trường cơ bản của nuôi cấy mô cây có múi [22] Moore (1986) sử dụng môi trường MT với 5% sucrose, 0,8% agar bổ sung

thêm BAP, NAA Trong nuôi cấy đoạn thân ở 3 giống citrus: C aurantium, C nensis x P trifoliata, C.reshni [23]

si-Sim và cộng sự (1989) sử dụng môi trường MS + 2% sucrose và BA, NAA, 2,4-D, IBA hoặc sử dụng kết hợp chúng với nhau Với pH 5.7 ở 26-280C , chu kỳ

sáng 14 giờ hoặc 7 giờ, trên giống C.mitis cv Blanco [31]

Duran-Vila và công sự (1989) sử dụng môi trường MS+ 3% sucrose và NAA,

BAP Trong nuôi cấy đoạn thân của 4 giống Citrus : C.sinensis, C.aurantifolia, C.medica, C.jambhiri Với pH 5,7 ở nhiệt độ 25-270C, ẩm độ 60% [6]

Dias và Rogers (1992) đã nghiên cứu về loại mảnh cấy và định hướng trong

việc tái sinh thân và rễ của giống Swingle citrusmelo (C.paradisi x Poncitrus

trifo-liata) mảnh cấy được lấy từ hạt nẩy mầm được gieo trong môi trường shocker

(pulsed) với 10, 6, 2 hoặc 0 mg/l BAP trong 48 giờ và chuyển sang môi trường MT có bổ sung thêm 2g/l gelrite [27]

Môi trường thường được sử dụng trong nuôi cấy mô cây có múi là MS và Skoog,1962), MT (Murashigevà Tucker) và Gamborg (B5) Parthasarathy và

(Murashige-Nagaraju (1996) đã thu được chồi từ phôi nẩy mầm của 7 giống cây có múi : Citrus reticulata, C madurensis, C reshni, C volkameriama, C taiwanica, C sinensis cvs và C limon trên môi trường MS và B5 được bổ sung thêm BAP Hầu hết các giống

đều phát triển tốt trên môi trường MS chỉ trừ C reshni [27]

Kordan (1959) lần đầu tiên trình bày về tiềm năng phát triển của nuôi cấy mô có thể thu được mô sẹo từ con tép của quả chanh Ông ta sử dụng môi trường lỏng chỉ chứa đường và khoáng chất [20]

Nuôi cấy invitro cây có múi

Ranga Swamy (1961) nuôi cấy phôi và phôi tâm của C microcarpa trong môi

trường Ranga Swamy II (1961) bổ sung 1mg/l IAA tạo được mô sẹo và phôi Khi cấy chuyền sang môi trường có bổ sung GA3 (1mg/l) và kinetin (0,01mg/l), phôi sẽ tăng trưởng tạo chồi con [28]

Năm 1972, Kochba và cộng tác viên đã thành công trong việc nuôi cấy mô

sẹo có phôi tạo ra từ phôi tâm của cam mật ‘Shamouti’ (C sinensis Osb.) bằng

cách nuôi cấy noãn chưa phát triển Trong khi đó, Grinblat sử dụng các vật liệu

khác nhau như đoạn thân, mảnh lá của giống Citrus madurensis L để tái tạo cây

con [19] Nồng độ cytokinin được sử dụng trong các thí nghiệm thường ở khoảng 0,5-30 mg/l, tuy nhiên khi nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy quá cao sẽ tạo nhiều chồi bất định nhưng chồi không phát triển Nhóm auxin kích thích tạo rễ thường được dùng ở nồng độ 0,1-5 mg/l hoặc phối hợp với cytokinins ở nồng độ 0,1-1 mg/l, auxin có tác dụng kích thích nhân chồi Để tạo mô sẹo người ta thường

bổ sung vào môi trường 2,4D hoặc auxin ở nồng độ cao và cytokinins ở nồng độ thấp (10 : 0,25 mg/l) [6]

Wang và Chang (1978) thành công trong việc tạo phôi của bưởi (Citrus dis) bằng cách nuôi cấy nội nhũ (endosperm) trên môi trường MT có bổ sung

gran-2mg/l 2,4D + 5 mg/l BA + 1000 mg/l CH trong điều kiện tối ở nhiệt độ 28oC để tạo mô sẹo Sau đó tạo phôi trên môi trường MT có bổ sung 2-15 mg/l GA3 và 0,02 mg/l kinetin Để tạo chồi chuyển sang môi trường MT có bổ sung 2-15 mg/l GA3

[35]

Năm 1981, Navarro và cộng tác viên đã sử dụng đỉnh sinh trưởng có kích thước từ 0,2-0,4 mm, đã tạo được hơn 90 mẫu sạch bệnh từ các vật liệu nhiễm virus

Tristeza, Stubbom spiroplasma [24]

Kitto S.L.và Young M.J (1981) đã thử nghiệm nhân giống 3 loại quýt trong

điều kiện in vitro là Citrus aurantium, Carrizo citrange và Cleopatra mandarin nhưng chỉ thành công khi nhân chồi đỉnh của Carrizo citrange trên môi trường

khoáng đa lượng Knop với thành phần khoáng vi lượng MS có bổ sung thêm 5 mg/l

BA, 3-4% sucrose và chiếu sáng ở điều kiện 2200 lux Số chồi ra trung bình là 3,1 công trình không có nghi nhận nào về tác động của kinetin, 2iP, nồng độ agar, sự bổ sung nước cam hay nguồn nitrogen đến việc tạo chồi Chồi tái sinh sau đó được xử lý ra rễ trong môi trường MT có bổ sung 1 mg/l NAA và 0,5% agar [18]

Moore (1986) cấy lóng thân của C.aurantium trong môi trường MT có bổ sung

5 mg/l BAP và 1 mg/l NAA tạo đuợc chồi bất định, các chồi này sau đó được xử lí

cho ra rễ trong môi trường có bổ sung 1 mg/l NAA [23]

Naima Beloualy (1990) cấy phôi của 3 loài: Citrus aurantium, Poncitrus liata và Carrizo citrange (C sinensis x Poncitrus trifoliata) trong môi trường MT có

trifo-bổ sung 2,4 D (2 mg/l), BAP (5 mg/l), sucrose (50 g/l) Phôi tạo mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy trong tối Cấy chuyền mô sẹo vào môi trường MT có NAA (1 mg/l) và BA

(5 mg/l) trên mô sẹo sẽ xuất hiện phôi hình cầu và chồi bất định nhiều nhất trên 2

loài Poncitrus trifoliata và Carrizo citrange, trong khi mô sẹo của Citrus aurantium

không phản ứng với môi trường trên mà lại tạo chồi và phôi mạnh nhất trên môi trường có NAA (1 mg/l) và BA (10 mg/l) Chồi của 3 loại được tạo rễ trong môi trường MT có bổ sung NAA (1 mg/l) và phôi hình cầu sẽ nẩy mầm và tạo thân rễ với môi trường MT có bổ sung GA3 (1 mg/l) [25]

Ling (1990), Kunitake (1991) đã tạo mô sẹo có phôi bằng cách nuôi cấy noãn chưa phát triển của quít Satsuma Trong khi Rangan (1993) sử dụng kỹ thuật nuôi

cấy mô sẹo có phôi (embryogenesis callus) ở C sinensis [21]

Eugenio Pérez-Molphe-Balch (1997) tạo chồi bằng cách nuôi cấy lóng thân

cây con gieo trong ống nghiệm của 2 loài Mexican Lime (C.auranfolia) và rin (C.reticulata) trên môi trường MS có bổ sung 33,3 µmg BA và 5,4 µM NAA, vi-

Manda-tamin B5, 5% đường Mẫu cấy được nuôi trong điều kiện 25±10C, trong tối 21 ngày, sau đó chuyển ra chiếu sáng ở 16h sáng 8h tối trong 29 ngày Kết quả 96% mẫu tạo trung bình 7,8 chồi đối với Mexican Lime và 88% mẫu tạo trung bình đối với Man-darin, 70% mẫu tạo rễ trên môi trường có bổ sung NAA (2,7-5,4 µM), IBA (2,5-4,9

Hearn (1986) đã xử lý mầm ngủ của giống bưởi chùm Foster để tạo ra giống với sự giảm số lượng hạt (không hạt thương mại), kết quả đã chọn lọc được 4 dòng với sự giảm số lượng hột/quả ổn định qua 4 năm [14]

Tại trường Đại học California, Mỹ, một trong hai tiến trình chính đang được thực hiện trong chọn tạo giống cây có múi là tạo giống không hạt từ giống thương phẩm hiện có bằng xử lý mầm ngủ với tia gama Trong vài năm qua, họ đã xử lý 4.500 mầm ngủ của các giống Encore, Kinnow, Fairchild, W Murcott, Murcott, Lee, Kara, Fremont, Ortanique, Fallglo, Daisy, Fortune, Dancy, Nova, Sue Linda Temple, Sunburst, các con lai quýt tuyển chọn và Valencia; khoảng 50% các cây được tạo ra, đánh giá khởi đầu trong sự trồng hỗn hợp, tuyển chọn các dòng có tri-ển vọng cho khảo nghiệm đồng ruộng, 20 cá thể có số hạt/quả thấp được tuyển chọn và được đánh giá ở 4-5 vị trí khác nhau Dù các cá thể xử lý đột biến chỉ cho trái vài trăm cá thể nhưng họ đã chọn được một số cá thể có triển vọng với số lượng hạt/quả thấp có nguồn gốc từ giống Encore, W Murcott và Kinnow [29]

2.2 Thành phần và cấu trúc vách tế bào thực vật

Hình 2.1 Cấu trúc tế bào thực vật [38] Hình 2.2 Cấu trúc vách tế bào thực vật [38]

Thành phần chính của vách tế bào là các polysaccharide có cấu trúc phức tạp được tạo nên từ các monosaccharide đơn giản Có 11 loại monosaccharide phổ biến cấu tạo nên các loại polysaccharide, trong đó có glucose và galactose Có nhiều thành phần khác nhau cấu tạo nên vách tế bào như cellulose, hemicellulose, pectin, lignin …[39]

2.2.1 Cellulose

Cellulose là thành phần có tỉ lệ cao nhất trong thành tế bào thực vật [17]

Một loại polysaccharide được tạo nên bởi đơn phân là các phân tử đường glucose bởi liên kết β-1,4-D-glucoside

2.2.2 Hemicellulose

Hemicellulose là nhóm các polysaccharide liên kết với nhau theo dạng nhánh Được đặc trưng bởi sự hòa tan trong kiềm mạnh Hai loại hemicellulose phổ biến trong tế bào thực vật là xyloglucan và glucuronoxylan Ngoài ra còn có các loại hemicellulose khác ít phổ biến hơn được tìm thấy trong vách thứ cấp (secondary wall) là glucomannan, galactoglucomannan, và galactomannan [39]

2.2.3 Pectin

Là nhóm có chứa đa dạng các polysaccharide và đặc biệt rất giàu acid pectic Pectin có nhiều trong vách chính (primary wall) và phiến giữa hai vách tế bào liền nhau (middle lamella) Các loại pectin bao gồm: galacturunan (homogalacturonan, substituted galacturonans, rhamnogalacturonan-II) và rhamnogalacturonan–I[17]

2.2.4 Lignin

Là polymer của phenolics, đặc biệt là phenylpropanoids

Lignin là thành phần rất phổ biến trong gỗ và là thành phần chiếm tỉ lệ trung bình lớn thứ hai về khối lượng (sau cellulose) trong toàn bộ sinh khối thực vật Các

loại thực vật khác nhau có thành phần lignin khác nhau và thay đổi trong khoảng một đến ba phần tư trọng lượng khô [4]

Cùng với cellulose, hemicellulose và pectin, lignin có mặt ở vách tế bào thực vật và đặc biệt là trong vách các loại quản bào và cương bào mô mộc Lignin lấp đầy khoảng trống giữa các sợi và tạo liên kết ngang giữa 3 thành phần polysac-charide trên, làm tăng tính cứng cơ học cho vách tế bào, từ đó định nên cấu trúc cứng cáp của thực vật [4, 13]

2.3 Tế bào trần

2.3.1 Định nghĩa [1]

Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào Lúc này nguyên sinh chất và các bào quan chỉ được bao bọc bởi lớp màng nguyên sinh chất

2.3.2 Đặc điểm của tế bào trần [1]

Tế bào trần có khả năng tiếp nhận một đoạn DNA hoặc toàn bộ DNA lạ Đặc tính này chỉ thấy ở tế bào vi khuẩn Các tế bào nguyên thủy trong mô thực vật không có đặc tính này Khi tế bào thực vật và tế bào nắm men được tách bỏ thành tế để tạo ra tế bào trần thì lúc này tế bào trần có khả năng tiếp nhận vật liệu di truyền giống như tế bào vi khuẩn

Khi đưa vào môi trường đủ chất dinh dưỡng thích hợp thì tế bào trần có khả năng tái sinh thành tế bào Đây là đặc tính hết sức đặc biệt của tế bào trần Nhờ đó tế bào trần mới phục hồi được toàn bộ chức năng của một tế bào nguyên thủy Khi tế bào trần tái tạo được thành tế bào và trở lại thành tế bào nguyên thủy, chúng có khả năng phát triển và phân chia hoàn toàn giống như tế bào bình thường

2.3.3 Ứng dụng của tế bào trần [1]

Khi tạo ra được tế bào trần, các nhà khoa học cho thấy khả năng vô cùng lớn của nó trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất Những ứng dụng của tế bào trần được liệt kê như sau:

Các nhà khoa học sử dụng tế bào trần như một đối tượng sinh học trong công tác nhân giống Chúng ta hoàn toàn có thể sử dụng các tế bào trần cùng loài để tiến hành lai giống Khi đó vật chất di truyền của các cá thể trong cùng một loài có thể trao đổi với nhau Kết quả là chúng ta thu nhận được tính trạng mới trong mỗi loài Phương pháp này giống như hiện tượng tiếp hợp ở vi khuẩn Ngoài ra các nhà khoa học còn dựa vào khả năng tiếp nhận không chọn lọc các vật chất di truyền của tế bào trần để tiến hành lai khác loài và từ đó tạo ra tính đa dạng sinh học

Các nhà khoa học còn sử dụng tế bào trần như cơ thể nhận các vật liệu di truyền từ các giới sinh vật khác nhờ đặc tính tiếp nhận không chọn lọc của tế bào trần Đây là bước đột phá của rất quan trọng trong công nghệ sinh học Từ đó các nhà khoa học sẽ có khả năng tạo ra những giống mới không chỉ có đặc tính của một loài, khác loài mà còn khác cả giới sinh vật Việc tái sinh tế bào trần thành một cây hoàn chỉnh đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất

Các nhà khoa học cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng các tế bào trần để sản xuất các sản phẩm thứ cấp giống như phương pháp nuôi cấy tế bào đơn

2.4 Phân lập tế bào trần

2.4.1 Nguyên liệu dùng để phân lập tế bào trần

Mô và cơ quan dùng tách tế bào trần rất đa dạng như là: lá, chồi ngọn, bao lá mầm, cánh hoa, quả, rễ, mắt rễ, lông hút, tế bào mẹ hạt phấn, ống phấn, hạt phấn Mặt khác, mô thịt lá là nguồn nguyên liệu chung nhất của việc tác phần lớn tế bào trần bởi vì dễ dàng có được [27] Mẫu lá lấy từ cây gieo bằng hạt trong phòng thí

nghiệm thường được sử dụng để tách tế bào trần vì không cần qua giai đoạn khử trùng

Tế bào trần còn được tách từ mô sẹo invitro và huyền phù tế bào Mô sẹo và huyền phù tế bào là nguồn tách tế bào trần được chuộng hơn bởi vì tốc độ phát tri-ển nhanh, màng tế bào mỏng và mức độ đồng đều cao Việc tạo lập và duy trì huyền phù tế bào đòi hỏi điều kiện rất nghiêm ngặt Tuy nhiên, tế bào trần tách từ tế bào được nuôi cấy có những thuận lợi là được phát triển trong điều kiện vô trùng và môi trường dinh dưỡng Tế bào trần từ các mô có nguồn gốc khác nhau có khả năng tái sinh rất khác nhau [27]

2.4.2 Tạo mô sẹo và huyền phù tế bào làm nguyên liệu phân lập tế bào trần

2.3.2.1 Tạo mô sẹo [1]

- Vật liệu nuôi cấy

Mô sẹo có thể hình thành từ tất cả các mô thực vật một lá mầm và hai lá mầm Các mô thường được sử dụng để tạo mô sẹo là: tượng tầng libe mộc, cơ quan dự trữ, trụ bì rễ, phôi nhũ, tử diệp, tế bào diệp nhục lá và mô tiền tượng tầng

- Khử trùng vật liệu

Mặt ngoài của thực vật mọc ngoài tự nhiên, trong nhà kính hoặc trong phòng tăng trưởng thường bị nhiễm bởi các bào tử nấm, vi khuẩn Mô bên trong thường không bị nhiễm mầm bệnh Tuy nhiên, mô mạch thường bị nhiễm bởi các loại nấm sống trong hệ thống mạch mà không gây ra bất kỳ triệu chứng nào Vì vậy, việc lựa chọn mô sạch bệnh để nuôi cấy là hết sức quan trọng Trước khi mẫu cấy được đưa vào nuôi cấy cần loại hết tất cả các nguồn gây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy

- Chuẩn bị mẫu cấy

Kích thước và hình dạng ban đầu của mẫu cấy thường không khắt khe lắm

kích thước cần thiết Nói chung những mẫu cấy tương đối lớn thường được sử dụng bởi vì một lượng lớn tế bào hiện diện làm tăng cơ hội thu được những mẫu cấy có thể sống được Lá, thân, hoa, bao phấn, trái cây, hạt, vùng chồi ngọn, rễ đều có thể sử dụng để nuôi cấy tế bào

- Môi trường nuôi cấy

Sự đáp ứng của những mẫu cấy, việc cung cấp tất cả các nguyên tố khác ở mức độ tối thích phụ thuộc phần lớn vào nồng độ auxin và cytokinin Sự đáp ứng của mẫu phụ thuộc vào cả hai lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh và ngoại sinh Auxin thường được sử dụng để khởi đầu và duy trì mô sẹo gồm IAA (10-10–10-5M) và NAA (10-10–10-5M) Một vài mô không thể tạo được mô sẹo khi chỉ có tác dụng của auxin và đòi hỏi cần có cả sự có mặt của cytokinin

Để duy trì mô sẹo đòi hỏi phải có sự hiện diện của các amino acid khác nhau trong môi trường nuôi cấy Các amino acid được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là glycine, arginine, hoặc hỗn hợp các amino acid như trong casein hydrolase Mô sẹo thường được tăng trưởng trên môi trường đặc, còn trong môi trường lỏng thì đôi khi cũng được sử dụng Agar là chất làm đặc môi trường thông dụng nhất và được sử dụng với nồng độ 6–10 g/l Agar sẽ lỏng ra ở 1000C và đặc lại ở

450C Đặc biệt agar không tác dụng với các thành phần của môi trường dinh dưỡng và không bị phân hủy bởi enzyme

- Cấy chuyền

Mô sẹo thường được chuyển sang môi trường dinh dưỡng mới theo từng giai đoạn Sự tăng trưởng của mẫu cấy sẽ làm tích tụ các sản phẩm, cạn kiệt nguồn dinh dưỡng và môi trường bị khô nước Mẫu được nuôi ở 250C thì nên được cấy chuyền mỗi 4 – 6 tuần Hầu hết mô sẹo nuôi cấy đều đòi hỏi phải được phân cắt thường xuyên và đặt mặt úp trên môi trường dinh dưỡng Các mẫu sẹo tốt không nên cắt ra

quá nhỏ, nếu không thì nó không thể sống được khi chuyển sang môi trường mới Mô sẹo có khả năng tạo phôi sẽ tăng trưởng chậm hơn mô sẹo không có khả năng sinh phôi Đây là những mô chắc và dễ tái sinh hơn mô không sinh phôi

2.3.2.2 Tạo huyền phù tế bào [1]

Huyền phù tế bào được tạo ra từ những mảnh mô sẹo trong một môi trường lỏng được lắc liên tục, tương tự huyền phù tế bào nào cũng được tạo ra từ cây mạ hay phôi Đối với huyền phù tế bào được tạo ra từ mô sẹo thì muốn huyền phù tế bào được tốt, phải tạo được mô sẹo tốt tức là mô sẹo phải bao gồm các tế bào có khả năng sinh phôi Mô sẹo khi phát triển đến một lúc nào đó trên môi trường đặc phải được chuyển sang môi trường lỏng trong các bình tam giác và được lắc liên tục trên một máy lắc vòng với tốc độ lắc thích hợp Trong quá trình tạo huyền phù tế bào, những điều kiện sinh trưởng như môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ hay thành phần các chất kích thích cũng tương tự như lúc tạo mô sẹo hoặc nếu có thay đổi thì chỉ thay đổi rất ít

Trong môi trường lỏng, từ mô sẹo có thể phóng thích ra những tế bào riêng lẻ hay những cụm tế bào gồm vài đến vài chục tế bào có khi đến cả trăm tế bào dính với nhau giúp tăng diện tích tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng Ngoài ra hoạt động lắc tròn của máy lắc giúp sự tăng sinh bình thường của mô sẹo, đồng thời giúp sự trao đổi khí giữa môi trường và tế bào được thuận lợi hơn Tuy nhiên khả năng hình thành huyền phù tế bào phụ thuộc rất nhiều vào kiểu gen cũng như kiểu tế bào Sau vài tháng nuôi cấy (tùy theo vật liệu) trong môi trường nuôi cấy lỏng, người ta sẽ nhận được một huyền phù tế bào ổn định gồm những tế bào cô lập hay nhóm nhỏ tế bào có thể sử dụng cho những thí nghiệm về sự tái sinh thực vật hay các kỹ thuật ở mức tế bào Một huyền phù tế bào được cho là lý tưởng khi nó là một dịch mịn, hầu như bao gồm những yếu tố có khả năng sinh phôi, nói cách khác những tế bào cô lập hay họp thành từng nhóm nhỏ từ vài đến khoảng hai mươi tế

bào, có khả năng duy trì tính toàn năng và tiến hóa thành phôi soma trên một môi trường tái sinh trong các điều kiện thích hợp

2.4.3 Enzyme dùng để tách tế bào trần

Không giống như tế bào động vật, tế bào thực vật có một vách cellulose cứng và các tế bào gần kề nhau được kết dính với nhau bởi mạng lưới giàu pectin Mặc dù một số ít tế bào trần có thể được tách bằng phương pháp cơ học Nhưng chỉ có thể tách tế bào trần số lượng lớn khi dùng enzyme thủy phân Một trong những người đi đầu trong việc dùng enzyme để tách tế bào trần là Cocking(1960) Ông ấy dùng enzyme thô lấy từ Myrothecium verrucaria để tách tế bào trần từ rễ cà chua [5] Những nghiên cứu sau đó và có sự sửa đổi cách thức làm cho phương pháp trên hiệu quả trong việc tách tế bào trần từ các loại mô khác nhau

Ngày nay, trong kỹ thuật tế bào trần, người ta không phá vỡ thành tế bào bằng phương pháp cơ học hay hóa học vì cần đảm bảo hoạt tính sinh học của tế bào Vì vậy, người ta thường sử dụng enzyme để tách thành tế bào ra khỏi tế bào

Một số loại enzyme được sử dụng là cellulase (β-1,4–glucanase) từ nấm

Tricoder-ma viridae; Tricoder-macerozyme (exo–polygaracturonase) từ Rhyzopus giàu proteinase và hemicellulase; và driselase từ Basidiomycete giàu cellulase và pectinase Enzyme

cellulase tham gia phân cắt cellulose có rất nhiều ở thành tế bào mà không ảnh hưởng đến màng tế bào và các thành phần khác trong tế bào thực vật [27]

Hình 2.3 Vị trí phân cắt của enzyme cellualase [37]

Gần đây, Pectolyase Y23 (chứa endo-polygaracturonase và endo-ectinlyase) loại enzyme rất hiệu quả, được sử dụng với một lượng rất nhỏ [37]

Ngày nay, trong chế phẩm enzyme có mặt trên thị trường này đều có chứa enzyme cellulase Ngoài enzyme cellulase, trong các chế phẩm enzyme còn chứa nhiều loại enzyme khác như hemicellulase, pectinase, lignase [1]

Hình 2.4 Một số loại enzyme thông dụng phân lặp tế bào trần

Bảng 2.1 Một số loại enzyme thông dụng [27]

Enzyme Nguồn Nhà cung cấp

Cellulase

Cellulase R-10 Trichoderma viride Yakult Pharmaceuticals 1-1-19,

Higashi-Shinbashi, Minato-ku, Tokyo-105, Japan Cellulase RS như trên

Macerozyme R-10 Rhizopus sp như trên

Driselase Ipex lactes Kyokwa Hakko Kogyo Co.Ltd., Tokyo

St.Louis, MO 63178, USA

Pectinases

Pectinas (purified) Aspergilus niger

Pectolyase Y23 Aspergilus japonicus Seishin Co, 4-13 Koamicho Nihonbashi,

Chuoku, Tokyo, Japan

Khi sử dụng các chế phẩm enzyme, người ta có thế sử dụng riềng rẽ từng loại chế phẩm , hoặc có thể dùng hỗn hợp các chế phẩm theo một tỉ lệ nhất định Một số hỗn hợp thường được sử dụng bao gồm: [1]

- Chế phẩm Hemerocallis

Cellulysin (1%) Rhozyme (1%) Macerase (0,5%) Tổng cộng 2,5% so với tổng sinh khối tế bào

- Chế phẩm Pisum sativum

Onozuka R–10 (2%) Driselase (2%)

Rhozyme (2%) Pectinase (1%) Tổng cộng 7% so với tổng sinh khối la.ù

- Chế phẩm solanum

Onozuka R – 10 (1%) Macerozyme R – 10 Pectolyase Y 23 (0,013%) Tổng cộng 1,013% so với tổng sinh khối lá

- Chế phẩm Medicago

Meicelase (4%) Rhozyme (2%) Macerozyme R–10 (0,03%)

Tổng cộng 6,03% so với tổng sinh khối lá

Thông thường, vách tế bào bảo vệ tế bào trước sự thay đổi của áp suất thẩm thấu Khi không còn vách tế bào thì tế bào trần có thể bì tổn thương trước sự thay đổi của áp suất thẩm thấu Cho nên, tế bào trần phải được bảo vệ chống lại sự thay đổi của áp suất thẩm thấu Thường thì người ta dùng 0,4–0,8 M Mannitol hoặc sor-bitol cùng với một ít calcium có thể giúp ổn định màng tế bào [27]

Tuy nhiên, việc sử dụng sorbitol làm chất cân bằng áp suất thẩm thấu đã giảm

bớt hiệu quả tạo vách tế bào của hầu hết các loại tế bào trần citrus [33]

Sau khi enzyme phân giải vách tế bào, tế bào trần cần được làm sạch khỏi những vụn còn sót lại và loại bỏ enzyme Chúng thường được loại bằng màng lọc nylon hoặc rây bằng thép không gỉ và rửa 3–4 lần bằng dung dịch muối cân bằng áp suất thẩm thấu như là CPW chứa 13% mannitol và ly tâm ở 80–100 g Loại bỏ enzyme sau khi tách tế bào trần là rất quan trọng, như là viêc tái tạo lại vách tế bào thường không tốt khi còn lại enzyme [27]

Sau khi làm sạch tế bào trần cần kiểm tra khả năng sống của tế bào Cách tốt nhất để kiểm tra khả năng sống của tế bào dựa trên sự tái tạo vách tế bào hoặc bắt đầu phân chia Sự hoạt động của các dòng tế bào chất còn là dấu hiệu tốt cho khả năng sống của tế bào Các loại thuốc nhuộm như: Evans blue hoặc Fluorescein di-acetate được dùng rộng rãi để xác định khả năng sống của tế bào [34]

2.4.4 Phương pháp chung phân lập tế bào trần

2.4.4.1 Phương pháp phân lập tế bào trần từ lá [1]

Để tách tế bào trần từ lá các bước tiến hành như sau: (1) khử trùng mẫu lá, (2) lột bỏ lớp biểu bì mặt dưới lá, (3) xử lý enzyme trong điều kiện áp suất thẩm thấu thích hợp và (4) cô lập tế bào trần bằng cách lọc và ly tâm

Mẫu lá được lấy từ cây còn non được rửa sạch bằng nước máy Khử trùng sơ bộ bằng cồn 700 trong thời gian 1-5 phút , sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần Lá non được khử trùng bằng hypochlorite calcium và thường khử trùng trong 7-

15 phút (các thao tác này được thực hiện trong điều kiện vô trùng) Rửa sạch mẫu lá bằng nước cất vô trùng 3 lần Mẫu sau khi khử trùng sẽ được đem vào tách tế bào trần Sau đó tách lớp biểu bì mặt dưới lá(mặt tiếp xúc với dịch) để enzyme có thể ngấm sâu vào nhu mô thịt lá Lá được cắt thành từng mảnh nhỏ Để tránh tình trạng màng tế bào bị rách cần ngâm mẫu lá trong mannitol, sorbitol, glucose 8 – 20% hoặc trong dung dịch muối vô cơ (0,3-0,5 M) trong thời gian 45- 60 phút để tế bào co nguyên sinh chất giúp ổn định màng tế bào Sử dụng khoảng 1g lá tươi ngâm vào dung dịch enzyme chứa trong đĩa petri sau khi đã làm co nguyên sinh Dung dịch enzyme được khử trùng bằng màng lọc 0,2 µm và được sử dụng riêng lẻ hay phối hợp với nhau ở pH thích hợp (5,4–5,7) và có áp suất thẩm thấu thích hợp

Phương pháp cô lập 1 bước

Các mẫu lá được ngâm trong 10ml dung dịch enzyme trong các đĩa petri (chứa

1 loại hoặc hỗn hợp enzyme) Đĩa petri đựng mẫu được để trong tối qua đêm (12–

18 giờ) ở 250C sẽ thu được hỗn hợp tế bào trần Hỗn hợp tế bào trần sẽ được loại bỏ bã (như các mô không bị enzyme thủy phân hoàn toàn, cụm tế bào) bằng cách hút ra bằng ống hút có chia độ Sau đó các tế bào được lọc qua phin lọc có kích thước lỗ 63–69 µm để loại các vụn lá còn lại Dịch tế bào được ly tâm với tốc độ

100 vòng /phút Các tế bào trần khi đó sẽ dính lại thành 1 cụm dưới đáy ống ly tâm Phần nổi lên mặt sẽ được loại bỏ Tế bào trần còn lại ở đáy sẽ được rửa 3 lần bằng môi trường nuôi cấy có áp suất thẩm thấu thích hợp Trong lần cuối rửa cần thay thế chất duy trì áp suất thẩm thấu bằng dung dịch sucrose 20% và ly tâm với tốc độ 200 vòng/ phút trong 1 phút khi đó các tế bào trần nổi trên mặt sẽ được hút

ra ngoài bằng ống hút chia độ

Phương pháp cô lập 2 bước

Trong phương pháp này các mẫu lá sau khi được loại bỏ lớp biểu bì mặt dưới sẽ được ngâm trong dung dịch pectinase 0,5–2% và có áp suất thẩm thấu thích hợp,

pH 5,8 Các bước tiếp theo tương tự phần trên nhưng dịch tế bào được ngâm trong dung dịch enzyme lần thứ 2 để thu nhận hoàn toàn các tế bào nhu mô giậu

2.4.4.2 Phương pháp phân lập tế bào trần từ mô sẹo

Mô sẹo đang trong giai đoạn tăng trưởng tích cực là nguồn nguyên liệu lý tưởng để có thể cô lập tế bào trần Phương pháp cô lập cũng tương tự như đối với lá Tuy nhiên, một nồng độ enzyme thích hợp đặc biệt là cellualase có thể thấp hơn là khi sử dụng để cô lập tế bào trần từ lá Thời gian ủ đối với mô sẹo là 4–6 giờ Nhiệt độ trong suốt quá trình ủ là 30–320C Các mô sẹo đã được nuôi cấy lâu ngày thì khó có thể tách tế bào trần hơn là các mô sẹo mới vì vách tế bào dày hơn Vì vậy nên sử dụng mô sẹo mới để tách tế bào trần và thời gian giữa hai lần cấy chuyền không nên kéo dài

2.4.4.3 Phân lập tế bào trần từ huyền phù tế bào [1]

Huyền phù tế bào mới được nuôi cấy trong trạng thái tăng trưởng mạnh cũng là nguồn cung cấp nguyên liệu tốt để cô lập tế bào trần Một phương pháp điển hình để cô lập tế bào trần là 5ml huyền phù tế bào có mật độ tế bào cao được hút cho vào ống ly tâm hình nón và ly tâm tốc độ 100 vòng trong 2 phút Sau khi những thành phần nổi trên mạt bị loại bỏ thì phần tế bào còn lại được cho vào môi trường khoáng dùng cho nuôi cấy để rửa và ly tâm lại Tế bào thu được đem xử lý với en-zyme khoảng 5ml dung dịch enzyme 1–4% cellulase + 0,2–0,5% pectinase và rót vào đĩa petri Đĩa petri được hàn kín bằng paraphin, đặt trên máy lắc 75 vòng/phút và ủ trong thời gian 2–4 giờ

2.5 Cấy tế bào trần

Ngày nay, người ta đã tái sinh được cây từ tế bào trần của rất nhiều giống,

loài cây ăn quả có múi (Citrus) Các giống cây có múi khác nhau có khả năng tái sinh cây rất khác nhau từ tế bào trần, trong đó giống cam ngọt Citrus sinensis là

loại có khả năng tái sinh cao nhất Nhìn chung mô sẹo phôi hóa có nguồn gốc từ nuôi cấy mô noãn, huyền phù tế bào là nguồn cung cấp tế bào có khả năng tái sinh

2.5.1 Môi trường nuôi cấy tế bào trần

Thành phần môi trường dinh dưỡng dùng để nuôi cấy tế bào trần tương tự như nuôi cấy mô và tế bào Sự mất đi của vách tế bào làm cho tế bào trần hấp thu dinh dưỡng tốt hơn trong môi trường nuôi cấy Tế bào trần được nuôi cấy thành công

trên môi trường đơn giản như MT và Gamborg et al (1968) hoặc trên môi trường

phức tạp hơn như Kao và Michayluk (1975) và Kao (1977) Môi trường nuôi cấy phức tạp thường được dùng cho các loài khó tái sinh hoặc nuôi cấy tế bào sau khi dung hợp [27] Môi trường BH3 được khuyến cáo rửa các loại tế bào trần và nuôi cấy những loại có kiểu gen khó tái sinh [11]

Đối với cây trồng khác nhau người ta xác định được nồng độ sucrose và nitol khác nhau Thành phần môi trường có bổ sung sucrose nồng độ 0,3M và man-nitol 0,3M [33] hoặc sử dụng môi trường kết hợp 0,15M sucrose và 0,45M mannitol cho các loài citrus [11]

man-Các loại đường glucose, sucrose, mannitol không chỉ là nguồn cung cấp bon mà còn là chất tạo áp suất thẩm thấu được sử dụng trong các môi trường nuôi cấy khác nhau và có ảnh hưởng quyết định đối với tách nuôi tế bào trần và tái sinh cây Môi trường nuôi cấy tế bào trần thành công nhất có sử dụng kết hợp cả su-crose và mannitol Tuy nhiên, sau khi tế bào đã tái tạo được vách, cần giảm nồng độ các chất thẩm thấu nhằm duy trì sự phân chia tế bào [27]

cac-Tế bào trần được nuôi cấy với mật độ khác nhau tùy theo loài thực vật [27]

Mật độ tế bào được xác định hoặc điều chỉnh bằng hồng cầu kế

2.5.2 Các phương pháp nuôi cấy tế bào trần

a Nuôi cấy trong môi trường lỏng

Lúc đầu, tế bào trần được nuôi cấy trong môi trường lỏng với mật độ 1x103–1x105 /ml dàn thành một lớp mỏng (2 ml) trong bình 25–50 ml được giữ yên hoặc

được lắc với tốc độ rất thấp Sau đó, Kao et al (1971) đã thay đổi phương pháp trên

thành phương pháp nuôi cấy giọt lỏng Vài giọt nhỏ của tế bào trần được cấy trong đĩa petri và sau đó bọc kín lại bằng paraphin

b Nuôi cấy trong môi trường rắn

Tế bào trần đã được làm sạch và được giữ trong môi trường nuôi cấy lỏng với nồng độ các thành phần dinh dưỡng gấp đôi và được phối trộn với cùng thể tích dung dịch agar nồng độ gấp đôi lượng cần thiết với dung dịch agar được duy trì ở

450C trong bể điều nhiệt Hiện nay agar được thay thế bằng agarose vì không có các thành phần gây độc cho tế bào có mặt trong agar Hỗn hợp hòa trộn được đổ ra đĩa petri thành lớp mỏng (1–1,5 ml trong đĩa petri có đường kính 2,5 mm) hoặc thành những giọt nhỏ (trong đĩa petri đường kính 5,5 mm) Đĩa petri được bọc kín bằng paraphin

Thông thường sau 6–16 tuần kể từ khi bắt đầu nuôi cấy tế bào trần, các phôi soma được hình thành Vardi và Galun(1988) khuyến cáo có thể làm to các phôi soma nhỏ trong môi trường EME 1500 [33] Các phôi soma hình trứng to có thể được nảy mầm trực tiếp trên môi trường đĩa petri 100 mm x 20 mm hoặc bất kì bình nuôi cấy mô sâu lòng nào Các phôi soma lớn đòi hỏi phải kéo dài trụ thân hơn nữa nên được cấy chuyền vào môi trường B có bổ sung 0,02 g/l NAA để thúc đẩy kéo dài thân, rễ phát triển và phôi nảy mầm Những mô sẹo không hình thành phôi có