Nghiên cứu, phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc mỡ định hướng ghép tự thân trong điều trị vết thương mạn tính

Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỊCH THỊ KIM HƢƠNG NGHIÊN CỨU, PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TĂNG SINH TẾ BÀO GỐC MỠ ĐỊNH HƢỚNG GHÉP TỰ THÂN TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG MẠN TÍNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỊCH THỊ KIM HƢƠNG NGHIÊN CỨU, PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TĂNG SINH TẾ BÀO GỐC MỠ ĐỊNH HƢỚNG GHÉP TỰ THÂN TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG MẠN TÍNH Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS.BS Đinh Văn Hân PGS TS Nguyễn Lai Thành Hà Nội - 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.BS Đinh Văn Hân PGS TS Nguyễn Lai Thành – người thầy tận tâm, nhiệt tình bảo, hướng dẫn động viên, cổ vũ tinh thần cho em suốt trình thực đề tài luận văn thạc sĩ Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô giáo giảng dạy em năm qua, kiến thức tảng mà thầy cô nhiệt tâm truyền lại hành trang giúp em vững bước tương lai Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh học Tế bào - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi tối đa cho em hoàn thành khóa học Xin chân thành cảm ơn cô chú, anh, chị, em Khoa Labo nghiên cứu ứng dụng điều trị Bỏng, khoa Liền vết thương – Viện Bỏng Quốc Gia quan tâm, hỗ trợ, tạo điều kiện để em thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè tất người thân yêu động viên, khích lệ, giúp đỡ em trình học tập để em hoàn thành luận văn này! Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2016 Học viên Địch Thị Kim Hương Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tế bào gốc 1.1.1 Khái niệm tế bào gốc 1.1.2 Phân loại tế bào gốc 1.2 Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSCs) tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 1.3 Vết thương yếu tố tham gia liền vết thương 1.3.1 Diễn biến trình liền vết thương 1.3.2 Các thành phần tế bào chủ yếu tham gia liền vết thương 11 1.4 Vết thương mạn tính 12 1.4.1 Các đặc điểm vết thương mạn tính 12 1.4.2 Một số loại vết thương mạn tính điển hình 13 1.4.3 Nguyên nhân điều trị vết thương mạn tính 15 1.5 Vai trò tế bào gốc liền vết thương 18 1.6 Một số ứng dụng tiêu biểu tế bào gốc trung mô lâm sàng 20 1.6.1 Ứng dụng điều trị tổn thương mạn tính xạ trị 20 1.6.2 Ứng dụng điều trị vết loét mạn tính tiểu đường 2021 1.7 Đánh giá an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh 221 1.7.1 Đánh giá tính an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua nhiễm sắc thể đồ 223 1.7.2 Đánh giá an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua định lượng enzyme telomerase 245 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng, nguyên - vật liệu nghiên cứu 28 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.2.2 Hóa chất cho nghiên cứu 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 299 2.2.1 Thu mô mỡ phân lập tế bào 299 2.2.2 Nuôi cấy tăng sinh tế bào ASCs 30 2.2.3 Xác định số lượng tế bào 30 2.2.4 Bảo quản phục hồi tế bào sau bảo quản 31 2.2.5 Xác định đặc điểm hình thái tế bào nuôi cấy tăng sinh 32 Footer Page of 126 Header Page of 126 2.2.6 Xác định khả tạo dòng tế bào 32 2.2.7 Lập kiểu nhân tế bào 32 2.2.8 Tách chiết định lượng enzyme telomerase tế bào sau nuôi cấy tăng sinh 33 2.2.9 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng tế bào gốc mô mỡ đến nguyên bào sợi in vitro 34 2.2.10 Theo dõi bệnh nhân có vết thương mạn tính ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 35 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 377 3.1 Phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 377 3.2 Đặc điểm phân lập hình thái tế bào 38 3.3 Khả tạo colony tế bào gốc mỡ 40 3.4 Nuôi cấy tăng sinh nhân rộng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 444 3.5 Về việc đánh giá tính an toàn ASCs sau nuôi cấy tăng sinh 455 3.6 Tác động tế bào gốc mỡ bệnh nhân lên nguyên bào sợi da in vitro 51 3.7 Theo dõi trình liền vết thương ca sau ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 52 KẾT LUẬN 56 KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết xử lý mẫu mô mỡ test mycoplasma 36 Bảng 3.2 Số lượng tế bào thu từ mô sau xử lý collagenase 38 Bảng 3.3 Tỷ lệ tạo colony hỗn dịch tế bào thu từ mô mỡ …… …41 Bảng 3.4 Khả tạo CFU-F theo hệ tế bào 44 Bảng 3.5 Thời gian đạt trạng thái cận che phủ hoàn toàn tế bào gốc mô mỡ 46 Bảng 3.6 Nồng độ Telomerase hệ tế bào nuôi cấy tăng sinh 49 Bảng 3.7 Số lượng tế bào mẫu nghiên cứu đối chứng 51 Bảng 3.8 Tỷ lệ sống nguyên bào sợi sau trypsin 52 Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vết thương nhiễm trùng 11 Hình 1.2 Vết thương sau xạ trị 12 Hình 1.3 Vết loét mạch máu 13 Hình 1.4 Vết loét chi bệnh tiểu đường 13 Hình 1.5 Vết loét tì đè 14 Hình 1.6 Cấu trúc vùng T-loop telomere 24 Hình 1.7 Chiều dài telomere hoạt tính telomerase dòng tế bào ung thư phổi 26 Hình 3.1 Hình thái tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy 39 Hình 3.2 Các đĩa colony sau nhuộm giemsa (mẫu số 1) 42 Hình 3.3 Các đĩa colony sau nhuộm giemsa (mẫu số 15) 42 Hình 3.4 Hình thái colony mẫu nghiên cứu theo thời gian 43 Hình 3.5 Đường cong tăng trưởng tế bào gốc mỡ 44 Hình 3.6 Bộ nhiễm sắc thể tế bào gốc mỡ định dạng theo nhiễm sắc thể 47 Hình 3.7 Bộ nhiễm sắc thể tế bào gốc mỡ lần cấy truyền thứ (P5) 48 Hình 3.8 Chiều dài telomere biểu telomerase số dòng tế bào 50 Hình 3.9 Vết thương sau ghép thời điểm theo dõi 53 Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AB Antibiotic/Antimycotic - Kháng sinh ASCs Adipose-derived Stem Cells - Tế bào gốc mỡ bFGF Basic fibroblast growth factor – Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi D’MEM Dubeco’s Modified Eagle Medium – Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM EGF Epidermal Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng biểu bì FBS Fetal Bovine Serum - Huyết bào thai bò FGF Fibroblasts Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi MSCs Mesenchymal stem cells - Tế bào gốc trung mô P Passage- Cấy truyền PBS Phosphat Buffer Saline - Dung dịch đệm phosphate TNF – β Tumor Necrosis Factor – β – Nhân tố gây hoại tử khối u β TB Tế bào VEGF Vessle Endothelial Growth Factor – Nhân tố tăng trưởng tế bào nội mô Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU Ứng dụng tế bào gốc tạo tiềm lớn cho y học tái tạo nhờ khả trì đặc tính gốc thời gian dài với đặc tính biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác điều kiện định Tế bào gốc có khả thay tế bào bị hư hỏng nhờ có khả điều trị bệnh Đặc tính thay sử dụng điều trị bỏng sâu, rộng; khôi phục hệ thống máu bệnh nhân bị bệnh rối loạn máu; chữa trị tổn thương gan não Đồng thời, mở triển vọng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Tế bào gốc công cụ quan trọng nghiên cứu bệnh tật có tiềm lớn để sử dụng lâm sàng Cho đến nay, loại tế bào gốc tế bào gốc phôi ứng dụng y học thành công tiềm chúng nhiều bị hạn chế so với tế bào gốc phôi Loại tế bào gốc sử dụng cho điều trị bao gồm nhóm chính: Tế bào gốc tạo máu; Tế bào gốc trung mô Tế bào gốc biểu mô Trong số nhóm nói trên, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (Adipose Derived Stem Cells – ASCs) quan tâm nhiều tiềm to lớn ứng dụng điều trị Thứ nhất, mô phổ biến, có nhiều thể người, dễ dàng thu nhận mà không gây xâm hại lớn tới thể tủy xương Điều đồng nghĩa với việc thu nhận lượng tế bào gốc trung mô mỡ phong phú so với tủy xương Hơn nữa, để thu thập mô mỡ, bệnh nhân cần phải gây tê cục vết thương bệnh nhân sau thu mỡ dễ dàng liền lại thời gian ngắn Thứ hai, mô dễ dàng tự bồi đắp thể Thứ ba lý quan trọng nhất, nguồn tế bào gốc thuận lợi cho sử dụng để ghép tự thân Với lý nói trên, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ coi nguồn tế bào gốc trưởng thành tự thân lý tưởng cho nghiên y học tái tạo, công nghệ mô liền vết thương Vết thương mạn tính hệ nhiều bệnh dị ứng, tiểu đường, bỏng sâu, bệnh hệ cứu thống miễn dịch da trường hợp tai nạn giao thông dẫn tới liệt người già ốm nằm chỗ lâu ngày gây loét da Các vết thương không điều trị nhanh chóng gây viêm nhiễm kéo dài làm thể dịch, chất dinh dưỡng suy kiệt Trường hợp thể có sức đề Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 kháng dẫn tới viêm phổi, viêm đường tiết niệu, chí nhiễm trùng máu gây tử vong Có nhiều phương pháp điều trị vết thương mạn tính dùng thuốc kích thích phát triển tế bào, dùng oxy cao áp, tia laser hiệu thấp, can thiệp phẫu thuật thường thất bại áp dụng sức khỏe bệnh nhân không cho phép phẫu thuật khổng thể tự phục hồi vết thương Vì vậy, nhu cầu điều trị vết thương ghép tế bào gốc lớn, nhu cầu đặc biệt tăng cao bệnh nhân lớn tuổi Xuất phát từ sở khoa học tiềm ứng dụng tế bào gốc mỡ, tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu, phân lập nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc mỡ định hƣớng ghép tự thân điều trị vết thƣơng mạn tính” nhằm hai mục tiêu sau: Đánh giá khả tăng sinh tế bào gốc mỡ nuôi cấy bệnh nhân có vết thương mạn tính Đánh giá tính an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh Footer Page 10 of 126 Header Page 30 of 126 trình phân lập, nuôi cấy, bảo quản sử dụng ASCs ứng dụng lâm sàng đánh giá an toàn Trên giới, việc đánh giá nguy xảy sử dụng tế bào gốc mỡ nghiên cứu đầy đủ qua nhiều tiêu chí nhiều hệ tế bào sau nuôi cấy tăng sinh [49, 56, 27,], Theo nghiên cứu Chua cộng sự, ASCs sau nuôi cấy tăng sinh tới hệ P20 (sau khoảng 42 lần phân chia tế bào) đánh giá thay đổi hình thái, mức độ biểu gen ức chế khối u, đột biến p53, hoạt tính telomerase, xác định chiều dài telomere tiến hành kiểm tra khả hình thành khối u điều kiện in vivo Người ta nhận thấy mức độ tổn thương DNA xảy từ P15 tới P20, thay đổi đáng kể biểu gen p53 p21, thay đổi đánh kể nồng độ telomerase chiều dài telomere tất hệ tế bào Tiếp đó, ASCs hệ P15 P20 cấy chuột tác giả không quan sát thấy hình thành khối u môi trường in vivo sau cấy ghép tháng Những liệu cho thấy, ASCs sau nuôi cấy tới P20 có nguy tạo khối u điều rằng, mô mỡ nguồn tế bào gốc an toàn cung cấp cho liệu pháp tế bào [50] Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, việc đánh giá an toàn ASCs sau nuôi cấy tăng sinh thông qua đánh giá mặt hình thái, nhiễm sắc thể đồ (Karyotype) định lượng enzyme telomerase tế bào từ P1 tới P5 1.7.1 Đánh giá tính an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua nhiễm sắc thể đồ Nhiễm sắc thể cấu trúc nằm nhân tế bào, cấu tạo sợi nhiễm sắc (chromatin), phức hợp DNA protein Trong nhân tế bào, chất nhiễm sắc tồn thường xuyên dạng sợi nhiễm sắc mảnh, khó quan sát Khi bước vào thời kỳ phân bào, sợi nhiễm sắc bắt đầu đóng xoắn đạt độ nén cực đại kỳ Lúc này, nhiễm sắc thể (chromosome) dày dạng kép gồm hai nhiễm sắc tử (chromatid) đính tâm động (centromere), chúng có hình dạng kích thước đặc trưng nên quan sát đếm số lượng thông qua kính hiển vi quang học Công thức nhiễm sắc thể người hay gọi Nhiễm sắc thể đồ (Karyotype) viết dạng: 46,XX 46,XY Bất kỳ thay đổi 22 Footer Page 30 of 126 Header Page 31 of 126 số lượng cấu trúc nhiễm sắc thể tế bào/ quần thể tế bào đĩa nuôi cấy so với công thức nhiễm sắc thể chuẩn, dẫn đến bất thường trình phát triển tế bào/ quần thể tế bào Trong lâm sàng, nhiễm sắc thể đồ ứng dụng rộng rãi chẩn đoán trước sinh, sau sinh để phát bệnh hay dị tật hay hội chứng có liên quan tới bất thường nhiễm sắc thể Ngoài ra, nhiễm sắc thể đồ sử dụng phân loại tiên lượng điều trị số loại ung thư Chẳng hạn, lặp đoạn gen NMYC nhiễm sắc thể, đặc biệt đoạn nhánh ngắn nhiễm sắc thể số thêm đoạn nhánh dài nhiễm sắc thể số có giá trị phân loại tiên lượng điều trị u nguyên bào thần kinh [7] Việc đánh giá xu hướng biến đổi thành ác tính tế bào gốc trung mô nghiên cứu di truyền tế bào việc cần thiết, đặc biệt nhiễm sắc thể đồ việc trì kiểu nhân bình thường số đáng tin cậy ổn định mặt di truyền MSCs Nhiễm sắc thể đồ cần coi tiêu chí đánh giá tế bào trước đưa vào sử dụng lâm sàng [12] Kỹ thuật phân tích công thức nhiễm sắc thể kỹ thuật di truyền tế bào sử dụng đánh giá ổn định gen dòng tế bào, đặc biệt dòng tế bào từ khối u Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể thường gặp bao gồm: Kỹ thuật nhuộm băng C, Kỹ thuật nhuộm băng Q, Kỹ thuật nhuộm băng G, Kỹ thuật nhuộm băng R Kỹ thuật nhuộm băng N Trong kỹ thuật lập karyotype, kỹ thuật nhuộm band G cho biết nhiều thông tin đánh giá di truyền dòng tế bào cho phép xác định bất thường mặt số lượng cấu trúc nhiễm sắc thể [12] Khi sử dụng kỹ thuật nhuộm băng G, NST lên dải vạch có độ đậm nhạt khác Đó bắt màu khác vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin) vùng nhiễm sắc thực (euchromatin) Kỹ thuật này, thực thuốc nhuộm Giemsa sau xử lý NST trypsin chọn vào kỳ (metaphase) kỳ tiền (prometaphase) nguyên phân Ở kỳ này, NST cho hình ảnh rõ nét giúp đánh giá số lượng cấu trúc NST cách dễ dàng Đây phương pháp nhuộm sử dụng rộng rãi để đánh giá bất thường nhiễm sắc thể số lượng cấu trúc Phương pháp đơn giản, dễ làm, chi phí thấp ứng dụng rộng rãi 23 Footer Page 31 of 126 Header Page 32 of 126 Khi ASCs cấy chuyền nhiều lần gây biến đổi cấu trúc vật chất di truyền Meza-Zepeda cộng sử dụng kỹ thuật nhuộm band G kỹ thuật CGH (comparative genomic hybridization) để phân tích tính ổn định mặt di truyền mức độ khả phát kính hiển vi ASCs sau nuôi cấy tăng sinh qua nhiều hệ Kết quả, nhóm nghiên cứu nhận thấy karyotype ASCs giữ trạng thái bình thường [12] Một nghiên cứu đánh giá ASCs bền vững mặt di truyền điều kiện nuôi cấy, công thức nhiễm sắc thể trì trạng thái bình thường sau 100 lần phân chia Tuy nhiên, nhiễm sắc thể đồ bất thường MSCs ASCs người sau cấy truyền phát số nghiên cứu khác Chẳng hạn, nhóm nghiên cứu C Bellotti tìm thấy đột biến chuyển đoạn số người hiến mẫu mỡ lần cấy chuyền thứ người khác số người nói có đột biến trisomy lần cấy truyền thứ 15 [12] Công nghệ tế bào gốc gần ứng dụng nhiều y học để điều trị nhiều bệnh ung thư hay tổn thương khó lành, Tuy nhiên, để ứng dụng tế bào gốc qua nuôi cấy vào điều trị bệnh nhà nghiên cứu cần phải chứng minh tế bào thông qua nuôi cấy phải đảm bảo không bị thay đổi cấu trúc chức NST việc xác định kiểu nhân ASCs sau nuôi cấy tiêu chí quan trọng đánh giá ổn định mặt di truyền tế bào cấp độ tế bào 1.7.2 Đánh giá an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua định lượng enzyme telomerase Telomere Telomere phức hệ nằm mút nhiễm sắc thể DNA telome động vật có xương sống TTAGGG chiều dài trung bình telomere khác cá thể người, dao động từ đến 20 kb tùy theo độ tuổi, tùy quan số lần phân chia tế bào Trong trình tổng hợp phân chia DNA, telomere bị ngắn lại đoạn telomere không chép enzyme DNA polymerase Hiện tượng ngắn lại telomere chế phân tử tượng lão hóa giảm chiều dài trầm trọng telomere gây lão hóa nhiễm sắc thể khiến cho tế bào bị chết Nhằm ngăn chặn ngắn lại 24 Footer Page 32 of 126 Header Page 33 of 126 telomere gây phân hủy exonuclease, sợi đơn telomere đầu 3’ tự cuộn vào vùng D-loop DNA telomere để tạo phức hệ T-loop Thêm vào đó, T-loop tăng cường độ bền vững với TRF2 protein liên kết với DNA telomere TRF1, POT1, TIN2, TPP1, RAP1…[11] Hình 1.6 Cấu trúc vùng T-loop telomere ((theo Blasco, 2003) Nhờ bảo vệ chặt chẽ protein cấu trúc “cài then” mà telomere giúp nhiễm sắc thể “cơ hội” gắn kết với đầu tận chúng Telomere sinh vật nhân chuẩn có đặc điểm cấu tạo sau: - Có protein đặc trưng liên kết phần đuôi nhiễm sắc thể - Phần DNA tận nhiễm sắc thể dạng sợi đơn, mang trình tự lặp, cuộn lại thành dạng kẹp tóc Mỗi lần phân bào, người trung bình 30 – 200 cặp base telomere tế bào Những tế bào bình thường phân chia khoảng 40 – 70 lần với ngắn dần telomere lão hóa, chết trì sai sót di truyền dẫn đến ung thư Tuy nhiên, có trường hợp chiều dài telomere không bị ngắn (như mô tim) chúng không liên tục phân chia Telomere có chức sau: - Giúp tế bào phân chia mà không làm gene Nếu telomere, gene cấu trúc quy định tính trạng thể bị rút ngắn dần sau lần phân bào - Giữ cho nhiễm sắc thể không bị dung hợp với tự dung hợp vị trí tận cùng: Khi cắt bỏ đoạn telomere đầu nhiễm sắc thể, 25 Footer Page 33 of 126 Header Page 34 of 126 người ta phát nhiều nhóm nhiễm sắc thể dính đầu tận cùng, tự dính vào đầu gây nên khép vòng Chức có hình thành cấu trúc kẹp tóc telomere: phần DNA tận cuộn xắn lại, giúp cho phần DNA mạch đơn kết cặp bổ sung cách ngẫu nhiên với Telomerase mối liên quan telomerase với bệnh ung thư Telomerase enzyme phiên mã ngược có chứa phân tử RNA mẫu cho phép chép đoạn lặp lại TTAGGG vào đuôi nhiễm sắc thể nhằm trì chiều dài vùng telomere Nếu telomerase, độ dài telomere ngắn lại sau lần tế bào phân chia Khi telomere ngắn đến độ đó, tế bào không phân chia chết theo chương trình Tế bào ung thư khác với tế bào bình thường hai đặc điểm, bất quy tắc không giới hạn phân chia tế bào Bệnh ung thư phát sinh tế bào tích lũy đột biến di truyền với việc tế bào thoát khỏi kiểm soát bình thường trình phân chia di cư Khi tế bào hệ tế bào phân chia kiểm soát, chúng xâm nhập gây hại mô lân cận Một số tế bào vào mạch máu di cư đến phận thể tạo mô ung thư Telomerase hoạt động telomere, góp phần vào phát sinh nhiều bệnh ung thư người [10] Lĩnh vực nghiên cứu ung thư bắt đầu quan tâm tới telomerase chiều dài telomere từ năm 1990 Các thí nghiệm ban đầu cho thấy telomere bị ngắn nguyên bào sợi nuôi cấy nguyên bào sợi qua nhiều hệ telomerase gần không hoạt động hệ nuôi cấy Trái lại, kéo dài số lần cấy truyền 20 hệ, tế bào bắt đầu có biến đổi hình thái phân chia, chiều dài telomere trở nên ổn định telomerase hoạt hóa, thể gia tăng nồng độ Điều gợi ý rằng, telomerase có vai trò định tăng trưởng tế bào nuôi cấy Một số thí nghiệm khác cho thấy khối u có telomere ngắn mô bình thường telomerase hoạt hóa nhiều khối u mà không biểu nhiều mẫu mô lành [10] Nhiều nghiên cứu telomerase hoạt động mạnh tế bào gốc phôi khoảng 85% tế bào ung thư [11, 12, 31] 26 Footer Page 34 of 126 Header Page 35 of 126 Hình 1.7 Chiều dài telomere hoạt tính telomerase dòng tế bào ung thư phổi (SCLC: Small Cell Lung Cancer): tế bào ung thư biểu mô tuyến tế bào ung thư biểu mô vảy (theo Broccoli, 1995) Trái lại, nồng độ lại thấp gần không biểu tế bào soma hay loại tế bào gốc khác (trong có tế bào gốc trung mô) Trên sở này, telomerase trở thành công cụ hữu hiệu chẩn đoán, dự đoán điều trị ung thư Do đó, việc đánh giá tính an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy thông qua đánh giá hoạt tính enzyme telomerase tiêu chí lựa chọn quan trọng cần thiết trước cấy ghép chúng vào thể [71] 27 Footer Page 35 of 126 Header Page 36 of 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Đinh Văn Hân, Phan Minh Hoàng (2012), “Phân lập, đặc điểm hình thái khả tạo dòng tế bào gốc trung mô màng dây rốn”, Tạp chí Y học thảm họa Bỏng (2012); pp 35-43 Đoàn Hoàng Thu (2014), Nghiên cứu khả tăng sinh tế bào gốc mỡ ảnh hưởng chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng điều trị vết thương, Luận văn Thạc sỹ khoa học Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Gia Tiến, Đinh Văn Hân, Đoàn Hoàng Thu (2012), “Chế tạo vật liệu tương đương trung bì từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn điều kiện nuôi cấy không giá đỡ để điều trị vết thương bỏng”, Tạp chí Y học thảm họa bỏng (2012), pp 36-42 Trần Văn Hanh (1997), “Quan điểm mô học đại trình liền vết thương”, Tài liệu đào tạo sau đại học – chuyên đề mô học, Đại học Y Hà Nội, tr 141-156 B Tiếng Anh Akita S, Akino K, Hirano A, Ohtsuru A, Yamashita S (2010), “Noncultured autologous adipose-derived stem cells therapy for chronic radiation injury”, Stem Cells International, pp 1-8 Al Battah F, De Kock J, Vanhaecke T, Rogiers V (2011), “Current status of human adipose-derived stem cells: differentiation into hepatocyte-like cells”, Scientific World Journal, 11 (), pp.1568-81 Ana CC Paula, Thaís MM Martins, Alessandra Zonari, Soraia PPJ Frade, Patrícia C Angelo, Dawidson A Gomes, and Alfredo M Goes (2015), “Human adipose tissue-derived stem cells cultured in xeno-free culture condition enhance cMYC expression increasing proliferation but bypassing spontaneous cell transformation”, Stem Cell Research & Therapy, 6(1), pp 76 Footer Page 36 of 126 Header Page 37 of 126 Andrew J.M Boulton, David G Armstrong, Stephen F Albert, Robert G Frykberg, Richard Hellman, M Sue Kirkman, Lawrence A Lavery, Joseph W LeMaster, Joseph L Mills, Michael J Mueller, Peter Sheehan and Dane K Wukich (2008), “Comprehensive Foot Examination and Risk Assessment Diabetes Care, 31(8), pp 1679-1685 Lauren Collins, Samia Seraj, Thomas Jefferson (2010), “Diagnosis and Treatment of Venous Ulcers” American Family Physician, 81(8), pp 989-996 10 Armanios M, Greider CW (2005), “Telomerase and cancer stem cells.” Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 2005 (70), pp 205-8 11 Blasco MA (2003), “Mammalian telomeres and telomerase: why they matter for cancer and aging”, European Journal of Cell Biology; 82(9), pp 441-6 12 C Bellotti, D Stanco, S Ragazzini, L Romagnoli, E Martella, S Lazzati, C Marchetti, D Donati, E Lucarelli (2013), “Analysis of the Karyotype of Expanded Human Adipose-Derived Stem Cells for Bone Reconstruction of the Maxillo-Facial Region”, International Journal of Immunopathology and Pharmacology, 26 (1), pp 3-9 13 Carol W Greider (1998), “Telomerase activity, cell proliferation, and cancer”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(1), pp 90–92 14 Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J (2007), “Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing” Stem Cells, 25(11), pp 2739-49 15 D Broccoli, J W Young, and T de Lange (1995), “Telomerase activity in normal and malignant hematopoietic cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences 92 (20), pp 9082–9086 16 De Lange T, Shiue L, Myers RM, Cox DR, Naylor SL, Killery AM, Varmus HE (1990), “Structure and variability of human chromosome ends”, Molecular and Cellular Biology, 10(2), pp 518-27 17 E Hiyama, K Hiyama (2007), “Telomere and telomerase in stem cells”, British Journal of Cancer, 96(7), pp 1020–1024 Footer Page 37 of 126 Header Page 38 of 126 18 Ebrahimian TG, Pouzoulet F, Squiban C, Buard V, André M, Cousin B (2009), “Cell therapy based on adipose tissue-derived stromal cells promotes physiological and pathological wound healing”, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 29 (4), pp 503-10 19 Erices A, Conget P, Minguell JJBr (2000), “Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood”, British Journal of Haematology, 109(1), pp 235-42 20 Frank Werdin MD, Mayer Tennenhaus, MD, Hans-Eberhardt Schaller, MD, and Hans-Oliver Rennekampff, MdcEplasty (2009), “Evidence-based Management Strategies for Treatment of Chronic Wounds”, Eplasty 21 Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Latsinik NV, Panasyuk AF, Keiliss-Borok IV (1974) “Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues”, Transplantation, 17(4), pp 331-40 22 Fromm-Dornieden C, Koenen P (2013) “Adipose-derived stem cells in wound healing: recent results in vitro and in vivo”, Molecul ar & Cell Biology, 20; pp 1-8 23 Frykberg RG, Banks J (2015), “Challenges in the Treatment of Chronic Wounds”, Advance Wound Care, (9), pp 560-582 24 Garcia-Olmo D, Herreros D, Pascual M, Pascual I, De-LaQuintana P, Trebol J (2009) “Treatment of enterocutaneous fi stula in Crohn’s Disease with adiposederived stem cells: A comparison of protocols with and without cell expansion” International Journal of Colorectal Disease, (24), pp 27-30 25 Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S (2000), “Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(25), pp 13625-30 26 Han SK, Kim HR, Kim WK (2010) “The treatment of diabetic foot ulcers with uncultured, processed lipoaspirate cells: A pilot study” Wound Repair and Regeneration, (18), pp 342-8 27 Haniffa MA,WangXN, Holtick U, Rae M, Isaacs JD, Dickinson AM, Hilkens CM, Collin MP (2007), “Adult human fibroblasts are potent immunoregulatory cells and functionally equivalent to mesenchymal stem cells”, Journal Immunology, 179(3), pp 1595-604 Footer Page 38 of 126 Header Page 39 of 126 28 Harley CB, Futcher AB, Greider CW (1990), “Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts”, Nature, 345(6274), pp 458-60 29 Hastie ND, Dempster M, Dunlop MG, Thompson AM, Green DK, Allshire RC (1990),“Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing”, Nature, 346(6287), pp 866-8 30 J Bernier, J Bonner, J B Vermorken R., J Bensadoun, R Dummer, J Giralt, G Kornek, A Hartley, R Mesia, C Robert, S Segaert K, K Ang (2008), “Consensus guidelines for the management of radiation dermatitis and coexisting acne-like rash in patients receiving radiotherapy plus EGFR inhibitors for the treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck” Annals of Oncology, 19 (1), pp 142-149 31 Josh F1, Kobe K, Tobita M, Tanaka R, Suzuki K, Ono K, Hyakusoku H, Mizuno H (2012, “Accelerated and safe proliferation of human adipose-derived stem cells in medium supplemented with human serum’, Journal of Nippon Medical School, 79(6), pp 444-52 32 Jung JW, Kwon M, Choi JC, Shin JW, Park IW, Choi BW, et al Familial occurrence of pulmonary embolism after intravenous, adipose tissue-derived stem cell therapy Yonsei Medicine Journal 2013;54:1293-6 33 K Kishi, N Imanishi, H Ohara (2010), “Distribution of adipose-derived stem cells in adipose tissues from human cadavers,” Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, 63(10), pp 1717–1722 34 Knippenberg M., Helder M N., Doulabi B Z., Semeins C M., Wuisman P I J M., Klein-Nulend J (2005), “Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells acquire bone cell-like responsiveness to fluid shear stress on osteogenic stimulation”, Tissue Engineering, 11(11-12), pp.1780–1788 35 Kuznetsov S.A., Krebsbach P.H., Satomura K., Kerr J., Riminucci M., Benayahu D., Robey P.G (1997), “Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo” Journal of Bone and Mineral Research, 12 (9), pp 1335–1347 Footer Page 39 of 126 Header Page 40 of 126 36 Lin Y, Uemura H, Fujinami K, Hosaka M, Harada M, Kubota Y (1997), “Telomerase activity in primary prostate cancer”, The Journal of Urology, 157 (3), pp 1161–1165 37 Lipsky BA, Berendt AR, Cornia PB, Pile JC, Peters EJ, Armstrong DG, Deery HG, Embil JM, Joseph WS, Karchmer AW, Pinzur MS, Senneville E (2012), “Infectious Diseases Society of America clinical practice guideline for the diagnosis and treatment of diabetic foot infections” Clinical Infectious Diseases; 54(12), pp.132-73 38 Mamidi MK, Nathan KG, Singh G, Thrichelvam ST, Mohd Yusof NA, Fakharuzi NA, Zakaria Z, Bhonde R, Das AK, Majumdar AS (2012), “Comparative cellular and molecular analyses of pooled bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells during continuous passaging and after successive cryopreservation” Journal of Cellular Biochemistry, 113(10), 3153-64 39 Marta García-Contreras, César David Vera-Donoso, José Miguel HernándezAndreu, José Manuel García-Verdugo, and Elisa Oltra (2014), “Therapeutic Potential of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs) from Cancer Patients: A Pilot Study”, PLoS One, 9(11) 40 Mesimäki K, Lindroos B, Törnwall J, Mauno J, Lindqvist C, Kontio R, Miettinen S, Suuronen R (2009), “Novel maxillary reconstruction with ectopic bone formation by GMP adipose stem cells”, International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 38(3), pp 201-9 41 Meza-Zepeda LA, Noer A, Dahl JA, Micci F, Myklebost O, Collas P (2008), “High-resolution analysis of genetic stability of human adipose tissue stem cells cultured to senescence”, Journal of Cellular and Molecular Medicine, 12(2): 553– 563 42 Mustoe TA, O'Shaughnessy K, Kloeters O (2006), “Chronic wound pathogenesis and current treatment strategies: a unifying hypothesis”, Plastic and Reconstructive Surgery, 117(7), pp 35-41 43 Nambu M, Ishihara M, Nakamura S, Mizuno H, Yanagibayashi S, Kanatani Y, Hattori H, Takase B, Ishizuka T, Kishimoto S, Amano Y, Yamamoto N, Azuma R, Kiyosawa T (2007), “Enhanced healing of mitomycin C-treated wounds in rats Footer Page 40 of 126 Header Page 41 of 126 using inbred adipose tissue-derived stromal cells within an atelocollagen matrix”, Wound Repair and Regeneration, 15(4), pp 505-10 44 Nie C, Yang D, Xu J, Si Z, Jin X, Zhang (2011), “Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis”,Cell Transplantation, 20(2), pp 205-16 45 Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR (1999), “Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells”, Science 284 (5411), pp 143147 46 Ranera B, Remacha AR, Álvarez-Arguedas S, Castiella T, Vázquez FJ, Romero A, Zaragoza P, Martín-Burriel I, Rodellar C (2013), “Expansion under hypoxic conditions enhances the chondrogenic potential of equine bone marrowderived mesenchymal stem cells” The Veterinary Journal, 195(2), pp 248-51 47 Raynaud CM, Maleki M, Lis R, Ahmed B, Al-Azwani I, Malek J, Safadi FF, Rafii A (2012), “Comprehensive characterization of mesenchymal stem cells from human placenta and fetal membrane and their response to osteoactivin stimulation” Stem Cells International, 2012 (658356) 48 Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, Pell CL, Johnstone BH, Considine RV, March KL (2004), “Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells”, Circulation, 109 (10), pp 1292-8 49 Riekstina U, Muceniece R, Cakstina I, Muiznieks I, Ancans J (2008), “Characterization of human skin-derived mesenchymal stem cell proliferation rate in different growth conditions” Cytotechnology, 58(3), pp 153-62 50 Rigotti G, Marchi A, Galiè M, Baroni G, Benati D, Krampera M (2007), “Clinical treatment of radiotherapy tissue damage by lipoaspirate transplant: A healing process mediated by adipose-derived adult stem cells”, Plastic and Reconstructive Surgery (119), pp 1409-22 Footer Page 41 of 126 Header Page 42 of 126 51 Robert Lanza, John Gearhart, Brigid Hogan, Douglas Melton, Roger Pedersen, E Donnall Thomas, James Thomson and Sir Ian Wilmut (2009), Essentials of Stem Cell Biology, Elsevier, Canada 52 Rotter N, Oder J, Schlenke P, Lindner U, Böhrnsen F, Kramer J, Rohwedel J, Huss R, Brandau S, Wollenberg B, Lang S (2008), “Isolation and characterization of adult stem cells from human salivary glands” Stem Cells and Development, 17(3), pp 509-18 53 Roufosse CA, Direkze NC, Otto WR, Wright NA (2004), “Review Circulating mesenchymal stem cells”, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 36(4), pp 585-97 54 Schüring AN, Schulte N, Kelsch R, Röpke A, Kiesel L, Götte M (2011), “ Characterization of endometrial mesenchymal stem-like cells obtained by endometrial biopsy during routine diagnostics” Fertility and Sterility, 95(1), pp 423-6 55 Sessarego N, Parodi A, Podestà M, Benvenuto F, Mogni M, Raviolo V, Lituania M, Kunkl A, Ferlazzo G, Bricarelli FD, Uccelli A, Frassoni F (2008), “Multipotent mesenchymal stromal cells from amniotic fluid: solid perspectives for clinical application, Haematologica, 93(3), pp 339-346 56 Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW (1998), “Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 95, pp.13726-13731 57 Tamara Borgonovo, Isadora May Vaz, Alexandra Cristina Senegaglia, Carmen Lucia Kuniyoshi Rebelatto, Paulo Roberto Slud Brofman (2014) “Genetic evaluation of mesenchymal stem cells by G-banded karyotyping in a Cell Technology Center”, Rev Bras Hematol Hemoter, 36(3), pp 202–207 58 Umesh D Wankhade, Michael Shen, Ravindra Kolhe, and Sadanand Fulzele (2016), “Advances in Adipose-Derived Stem Cells Isolation, Characterization, and Application in Regenerative Tissue Engineering”, Stem Cells International, 2016(5), pp 1-9 Footer Page 42 of 126 Header Page 43 of 126 59 Vériter S, André W, Aouassar N, Poirel HA, Lafosse A, Docquier PL, Dufrane D (2015), “Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells in Cell Therapy: Safety and Feasibility in Different "Hospital Exemption" Clinical Applications”, PLoS One, 10 (10) 60 Wan Safwani Wan Kamarul Zaman, Suzana Makpol, Somasundaram Sathapan, Kien Hui Chua (2014), “Long-term in vitro expansion of human adiposederived stem cells showed low risk of tumourigenicity”, Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 8(1), pp 67-76 61 Wang HS, Hung SC, Peng ST, Huang CC, Wei HM, Guo YJ, Fu YS, Lai MC, Chen CC (2004), “Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord” Stem Cells, 22(7), pp 1330-7 62 Wellinger R.J., Ethier K., Labrecque P., Zakian V.A.(1996), “Evidence for a new step in telomere maintenance”,Cell, 85, pp 423–433 63 William T Wake (2010), “Pressure Ulcers: What Clinicians Need to Know” The Permanente Journal, 14(2), pp 56–60 64 Wu XB, Tao R (2012), “Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells” Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International, 11(4), pp 360-71 65 Y Wang, D.L Huso, J Harrington, J Kellner, D.K Jeong, J Turney (2005), “Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture”, Cytotherapy, 7, pp 509–519 66 Young DA, DeQuach JA, Christman KL (2011), “Human cardiomyogenesis and the need for systems biology analysis”, WIREs Systems Biology and Medicine, 3(6), pp 666-80 67 Youwei Wang, Zhi-bo Han, Yong-ping Song, and Zhong Chao Han (2012), “Safety of Mesenchymal Stem Cells for Clinical Application”, Stem Cells International, 2012 (2012), pp.1-4 68 Z.X Zhang, L.X Guan, K Zhang ((2007), “Cytogenetic analysis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged in vitro”, Cell Biology International, 31 (2007), pp 645–648 Footer Page 43 of 126 Header Page 44 of 126 69 Zimmerlin L, Donnenberg VS, Pfeifer ME, Meyer EM, Péault B, Rubin JP (2010), “Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue”, Cytometry Part A , (77), pp 22-30 70 Zoe Marie MacIsaac, Hulan Shang, Hitesh Agrawal, Ning Yang, Anna Parker, and Adam J Katz (2011) ”Long-term In-Vivo Tumorigenic Assessment of Human Culture-expanded Adipose Stromal/Stem Cells”, Experimental Cell Research, 318(4), pp 416–423 71 Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, Alfonso ZC, Fraser JK, Benhaim P, Hedrick MH (2002) Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells Mol Biol Cell., 13(12), pp 4279-95 72 Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH (2001), “Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies” Journal of Tissue Engineering, 7(2), pp 211-28 Footer Page 44 of 126 ... Nghiên cứu, phân lập nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc mỡ định hƣớng ghép tự thân điều trị vết thƣơng mạn tính nhằm hai mục tiêu sau: Đánh giá khả tăng sinh tế bào gốc mỡ nuôi cấy bệnh nhân có vết. .. 6.000.000 tế bào sau tách từ 1ml mỡ hút sau xử lý SVF chứa gồm loại tế bào khác tế bào gốc trung mô, tế bào gốc mỡ, tế bào gốc tạo máu tế bào tế bào gốc nguyên bào sợi, tế bào máu, tiền thân tế bào mỡ. .. KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỊCH THỊ KIM HƢƠNG NGHIÊN CỨU, PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TĂNG SINH TẾ BÀO GỐC MỠ ĐỊNH HƢỚNG GHÉP TỰ THÂN TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG MẠN TÍNH Chuyên ngành : Sinh học