2.4.4.1 Phương pháp phân lập tế bào trần từ lá [1]
Để tách tế bào trần từ lá các bước tiến hành như sau: (1) khử trùng mẫu lá, (2) lột bỏ lớp biểu bì mặt dưới lá, (3) xử lý enzyme trong điều kiện áp suất thẩm thấu thích hợp và (4) cô lập tế bào trần bằng cách lọc và ly tâm.
Mẫu lá được lấy từ cây còn non được rửa sạch bằng nước máy. Khử trùng sơ bộ bằng cồn 700 trong thời gian 1-5 phút , sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần. Lá non được khử trùng bằng hypochlorite calcium và thường khử trùng trong 7- 15 phút (các thao tác này được thực hiện trong điều kiện vô trùng). Rửa sạch mẫu lá bằng nước cất vô trùng 3 lần. Mẫu sau khi khử trùng sẽ được đem vào tách tế bào trần. Sau đó tách lớp biểu bì mặt dưới lá(mặt tiếp xúc với dịch) để enzyme có thể ngấm sâu vào nhu mô thịt lá. Lá được cắt thành từng mảnh nhỏ. Để tránh tình trạng màng tế bào bị rách cần ngâm mẫu lá trong mannitol, sorbitol, glucose 8 – 20% hoặc trong dung dịch muối vô cơ (0,3-0,5 M) trong thời gian 45- 60 phút để tế bào co nguyên sinh chất giúp ổn định màng tế bào. Sử dụng khoảng 1g lá tươi ngâm vào dung dịch enzyme chứa trong đĩa petri sau khi đã làm co nguyên sinh. Dung dịch enzyme được khử trùng bằng màng lọc 0,2 µm. và được sử dụng riêng lẻ hay phối hợp với nhau ở pH thích hợp (5,4–5,7) và có áp suất thẩm thấu thích hợp.
Phương pháp cô lập 1 bước
Các mẫu lá được ngâm trong 10ml dung dịch enzyme trong các đĩa petri (chứa 1 loại hoặc hỗn hợp enzyme). Đĩa petri đựng mẫu được để trong tối qua đêm (12– 18 giờ) ở 250C sẽ thu được hỗn hợp tế bào trần. Hỗn hợp tế bào trần sẽ được loại bỏ bã (như các mô không bị enzyme thủy phân hoàn toàn, cụm tế bào) bằng cách hút ra bằng ống hút có chia độ. Sau đó các tế bào được lọc qua phin lọc có kích thước lỗ 63–69 µm để loại các vụn lá còn lại. Dịch tế bào được ly tâm với tốc độ 100 vòng /phút. Các tế bào trần khi đó sẽ dính lại thành 1 cụm dưới đáy ống ly tâm. Phần nổi lên mặt sẽ được loại bỏ. Tế bào trần còn lại ở đáy sẽ được rửa 3 lần bằng môi trường nuôi cấy có áp suất thẩm thấu thích hợp. Trong lần cuối rửa cần thay thế chất duy trì áp suất thẩm thấu bằng dung dịch sucrose 20% và ly tâm với tốc độ 200 vòng/ phút trong 1 phút khi đó các tế bào trần nổi trên mặt sẽ được hút ra ngoài bằng ống hút chia độ.
Phương pháp cô lập 2 bước
Trong phương pháp này các mẫu lá sau khi được loại bỏ lớp biểu bì mặt dưới sẽ được ngâm trong dung dịch pectinase 0,5–2% và có áp suất thẩm thấu thích hợp, pH 5,8. Các bước tiếp theo tương tự phần trên nhưng dịch tế bào được ngâm trong dung dịch enzyme lần thứ 2 để thu nhận hoàn toàn các tế bào nhu mô giậu.
2.4.4.2 Phương pháp phân lập tế bào trần từ mô sẹo
Mô sẹo đang trong giai đoạn tăng trưởng tích cực là nguồn nguyên liệu lý tưởng để có thể cô lập tế bào trần. Phương pháp cô lập cũng tương tự như đối với lá. Tuy nhiên, một nồng độ enzyme thích hợp đặc biệt là cellualase có thể thấp hơn là khi sử dụng để cô lập tế bào trần từ lá. Thời gian ủ đối với mô sẹo là 4–6 giờ. Nhiệt độ trong suốt quá trình ủ là 30–320C. Các mô sẹo đã được nuôi cấy lâu ngày thì khó có thể tách tế bào trần hơn là các mô sẹo mới vì vách tế bào dày hơn. Vì vậy nên sử dụng mô sẹo mới để tách tế bào trần và thời gian giữa hai lần cấy chuyền không nên kéo dài.
2.4.4.3 Phân lập tế bào trần từ huyền phù tế bào [1]
Huyền phù tế bào mới được nuôi cấy trong trạng thái tăng trưởng mạnh cũng là nguồn cung cấp nguyên liệu tốt để cô lập tế bào trần. Một phương pháp điển hình để cô lập tế bào trần là 5ml huyền phù tế bào có mật độ tế bào cao được hút cho vào ống ly tâm hình nón và ly tâm tốc độ 100 vòng trong 2 phút. Sau khi những thành phần nổi trên mạt bị loại bỏ thì phần tế bào còn lại được cho vào môi trường khoáng dùng cho nuôi cấy để rửa và ly tâm lại. Tế bào thu được đem xử lý với en- zyme khoảng 5ml dung dịch enzyme 1–4% cellulase + 0,2–0,5% pectinase và rót vào đĩa petri. Đĩa petri được hàn kín bằng paraphin, đặt trên máy lắc 75 vòng/phút và ủ trong thời gian 2–4 giờ.