Không giống như tế bào động vật, tế bào thực vật có một vách cellulose cứng và các tế bào gần kề nhau được kết dính với nhau bởi mạng lưới giàu pectin. Mặc dù một số ít tế bào trần có thể được tách bằng phương pháp cơ học. Nhưng chỉ có thể tách tế bào trần số lượng lớn khi dùng enzyme thủy phân. Một trong những người đi đầu trong việc dùng enzyme để tách tế bào trần là Cocking(1960). Ông ấy dùng enzyme thô lấy từ Myrothecium verrucaria để tách tế bào trần từ rễ cà chua [5]. Những nghiên cứu sau đó và có sự sửa đổi cách thức làm cho phương pháp trên hiệu quả trong việc tách tế bào trần từ các loại mô khác nhau.
Ngày nay, trong kỹ thuật tế bào trần, người ta không phá vỡ thành tế bào bằng phương pháp cơ học hay hóa học vì cần đảm bảo hoạt tính sinh học của tế bào. Vì vậy, người ta thường sử dụng enzyme để tách thành tế bào ra khỏi tế bào. Một số loại enzyme được sử dụng là cellulase (β-1,4–glucanase) từ nấm Tricoder- ma viridae; macerozyme (exo–polygaracturonase) từ Rhyzopus giàu proteinase và hemicellulase; và driselase từ Basidiomycete giàu cellulase và pectinase. Enzyme cellulase tham gia phân cắt cellulose có rất nhiều ở thành tế bào mà không ảnh hưởng đến màng tế bào và các thành phần khác trong tế bào thực vật [27].
Gần đây, Pectolyase Y23 (chứa endo-polygaracturonase và endo-ectinlyase) loại enzyme rất hiệu quả, được sử dụng với một lượng rất nhỏ [37].
Ngày nay, trong chế phẩm enzyme có mặt trên thị trường này đều có chứa enzyme cellulase. Ngoài enzyme cellulase, trong các chế phẩm enzyme còn chứa nhiều loại enzyme khác như hemicellulase, pectinase, lignase [1].
Hình 2.4 Một số loại enzyme thông dụng phân lặp tế bào trần Bảng 2.1 Một số loại enzyme thông dụng [27].
Enzyme Nguồn Nhà cung cấp Cellulase
Cellulase R-10 Trichoderma viride Yakult Pharmaceuticals 1-1-19, Higashi-
Shinbashi, Minato-ku, Tokyo-105, Japan
Cellulase RS như trên
Macerozyme R-10 Rhizopus sp như trên
Driselase Ipex lactes Kyokwa Hakko Kogyo Co.Ltd., Tokyo
Hemicellulase Sigma Chemical Co., P.O. Box 14508,
St.Louis, MO 63178, USA
Pectinases
Pectinas (purified) Aspergilus niger
Pectolyase Y23 Aspergilus japonicus Seishin Co, 4-13 Koamicho Nihonbashi,
Khi sử dụng các chế phẩm enzyme, người ta có thế sử dụng riềng rẽ từng loại chế phẩm , hoặc có thể dùng hỗn hợp các chế phẩm theo một tỉ lệ nhất định. Một số hỗn hợp thường được sử dụng bao gồm: [1]
- Chế phẩm Hemerocallis
Cellulysin (1%) Rhozyme (1%) Macerase (0,5%)
Tổng cộng 2,5% so với tổng sinh khối tế bào. - Chế phẩm Pisumsativum
Onozuka R–10 (2%) Driselase (2%)
Rhozyme (2%) Pectinase (1%)
Tổng cộng 7% so với tổng sinh khối la.ù - Chế phẩm solanum
Onozuka R – 10 (1%) Macerozyme R – 10 Pectolyase Y 23 (0,013%)
Tổng cộng 1,013% so với tổng sinh khối lá. - Chế phẩm Medicago
Meicelase (4%) Rhozyme (2%)
Tổng cộng 6,03% so với tổng sinh khối lá.
Thông thường, vách tế bào bảo vệ tế bào trước sự thay đổi của áp suất thẩm thấu. Khi không còn vách tế bào thì tế bào trần có thể bì tổn thương trước sự thay đổi của áp suất thẩm thấu. Cho nên, tế bào trần phải được bảo vệ chống lại sự thay đổi của áp suất thẩm thấu. Thường thì người ta dùng 0,4–0,8 M Mannitol hoặc sor- bitol cùng với một ít calcium có thể giúp ổn định màng tế bào [27].
Tuy nhiên, việc sử dụng sorbitol làm chất cân bằng áp suất thẩm thấu đã giảm bớt hiệu quả tạo vách tế bào của hầu hết các loại tế bào trần citrus [33].
Sau khi enzyme phân giải vách tế bào, tế bào trần cần được làm sạch khỏi những vụn còn sót lại và loại bỏ enzyme. Chúng thường được loại bằng màng lọc nylon hoặc rây bằng thép không gỉ và rửa 3–4 lần bằng dung dịch muối cân bằng áp suất thẩm thấu như là CPW chứa 13% mannitol và ly tâm ở 80–100 g. Loại bỏ enzyme sau khi tách tế bào trần là rất quan trọng, như là viêc tái tạo lại vách tế bào thường không tốt khi còn lại enzyme [27].
Sau khi làm sạch tế bào trần cần kiểm tra khả năng sống của tế bào. Cách tốt nhất để kiểm tra khả năng sống của tế bào dựa trên sự tái tạo vách tế bào hoặc bắt đầu phân chia. Sự hoạt động của các dòng tế bào chất còn là dấu hiệu tốt cho khả năng sống của tế bào. Các loại thuốc nhuộm như: Evans blue hoặc Fluorescein di- acetate được dùng rộng rãi để xác định khả năng sống của tế bào [34].