Kết quả thí nghiệm cho thấy, mật độ tế bào 5x105 trên môi trường MT cho kết quả số tế bào tạo dòng mô sẹo cao nhất khác biệt có ý nghĩa qua thống kê so với các nghiệm thức còn lại (bảng 4.4). Các nghiên cứu trước đây cho rằng mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự tái sinh của tế bào trần cũng như môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng bổ sung vào môi trường có vai trò trong việc kích thích tế bào tăng trưởng và phân chia tái sinh tạo mô sẹo và tạo chồi. Tuy nhiên, ở thí nghiệm này, môi trường MT cơ bản phù hợp để phát triển tế bào trần thịt lá cây tắc thành mô sẹo. Grosser và Gmitter năm 1990 cũng nghiên cứu cho rằng tế bào trần cây có múi rất dễ phát triển thành mô sẹo khi nuôi cấy trong môi trường MS, MT và BH3. Do thời gian nghiên cứu ngắn nên chúng tôi vẫn chưa xác định được môi trường có bổ sung chất ĐHST thích hợp để tái sinh TBT lá cây tắc thành cây hoàn chỉnh.
bào trần cây tắc in vitro
Môi trường Mật độ tế bào/ml
5x105 1x105 0,5x105
MT 88,33 a 55 c 39 e
MS 61,33 b 49,67 d 31,33 f
RMAN 52,33 cd 23,33 g 13,33 h
Cv(%) 4,77
Theo kết quảphân tích thống kê, nghiệm thức với mật độ tế bào 5x105 trong môi trường RMAN so với nghiệm thức mật độ tế bào 1x105 trên môi trường MS và nghiệm thức với mật độ tế bào 5x105 trong môi trường RMAN so với nghiệm thức mật độ tế bào 1x105 trên môi trường MT sự khác biệt không có ý nghĩa. Các nghiệm thức còn lại sự khác biệt là có ý nghĩa.
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VAØ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận
Qua các kết quả thí nghiệm, chúng tôi rút ra được những kết luận sau đây:
- Nồng độ enzyme cellulase và pectinase bổ sung vào dung dịch trích tốt nhất để phân lập TBT từ lá cây Tắc in – vitro lần lượt là 3% (cellulase) và 0,2-0,3% (pectinase) - Thời gian xử lý mô lá cây tắc trong dung dịch trích tốt nhất là 16 giờ, theo sau các bước rửa dịch trích trong dung dịch rửa và thu nhận tế bào trần sau khi ly tâm 850 vòng/phút trong 10 phút.
- Tốc độ và thời gian ly tâm tốt nhất để rửa và thu nhận tế bào trần của cả hai giai đoạn là 850 vòng/phút trong 10 phút.
- Môi trường và nồng độ tế bào thích hợp để TBT cây tắc tái sinh tạo dòng mô sẹo là môi trường MT (không bổ sung chất ĐHST) với mật độ tế bào là 5 x 105 tế bào/ml.
5.2 Đề nghị
Qua các kết luận này, chúng tôi đề nghị một qui trình tạm thời để phân lập tế bào trần lá cây tắc như sau:
Phương pháp phân lập tế bào trần từ mô lá tắc
- Mẫu lá tắc được loại bỏ đất cát và bụi trên bề mặt bằng cách rửa dưới vòi nước máy. Sau đó khử trùng sơ bộ bằng cồn 700 và rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần. Mẫu lá tiếp tục được khử trùng bằng hypochlorite calcium 5 - 10% trong vòng 5-10 phút. Sau đó rửa sạch mẫu lá 3 lần bằng nước cất vô trùng. Mẫu lá sau khi khử trùng được loại bỏ gân lá và cắt nhỏ có kích
của tế bào được thực hiện bằng cách ngâm mẫu lá đã xử lý vào dung dịch mannitol 0,7M trong thời gian 1 giờ. Các thao tác trên được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
- Ngâm 1 g mẫu lá trong 5 ml dung dịch enzyme trong đĩa petri để phân lập tế bào trần (dung dịch A) và đặt trong tối, nhiệt độ 250C, lắc 50v/phút, thời gian ủ 16h.
- Sau khi ủ xong thì dung dịch enzyme được hút ra cẩn thận và loại bỏ vì thường chứa rất ít tế bào. Mẫu lá còn lại được bổ sung 5 ml dung dịch rửa (dung dịch B) và lắc nhẹ cho tế bào trần thoát ra. Việc rửa được lặp lại 3 lần.
- Sau mỗi lần rửa dung dịch được lọc qua rây lọc bằng thép có kích thước lỗ 0,75µm để loại bổ những thành phần còn lại của mẫu lá không được thủy phân.
- Dung dịch tế bào trần được ly tâm ở 850 vòng/phút trong 10 phút, khi đó tế bào trần sẽ lắng xuống đáy ống ly tâm, phần dung dịch ở trên được hút ra từ từ và được loại bỏ.
- Phần còn lại được bổ sung 10 ml dung dịch C và chia làm 2 phần bằng nhau cho vào 2 ống ly tâm 15 ml.
- Thêm từ từ vào mỗi ống ly tâm 3 ml dung dịch D và sau đó bổ sung lên lớp mặt của dung dịch 3 ml dung dịch B, khi đó dung dịch trong ống ly tâm sẽ phân thành 3 lớp.
- Tiến hành ly tâm ở 850 vòng/phút trong 5 phút và thu tế bào trần ở lớp giữa của 2 lớp trên để tiến hành nghiên cứu hoặc nuôi cấy.
Do thời gian thực hiện đề tài ngắn (4 tháng) do đó chúng tôi không thể hoàn thiện được qui trình phân lập và nuôi cấy tái sinh tế bào trần cây tắc in vitro. Vì vậy, chúng tôi đề nghị, nếu có điều kiện sẽ tiếp tục thực hiện các nghiên cứu tiếp theo để hoàn chỉnh qui trình này.
TAØI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước
1. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006). Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản
Đại Học Quốc Gia, Tp. Hồ Chí Minh.
2. Phạm ngọc liễu (1998), Điều tra khảo sát, bình tuyển các giống bưởi ở một số tỉnh Nam Bộ, Viện Nghiên Cứu Cây Ăn quả Miền Nam. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Trần Thị Oanh Yến et al (2003), Kết quả bước đầu bình tuyển cam, quýt, bưởi không hạt, Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ cây ăn quả(2002 – 2003 ), Viện Cây Ăn Quả Miền Nam, 77 – 81.
Tài liệu nước ngoài
4. Boerjan, W., Ralph, J. & Baucher, M., (2003). Lignin bios. Annual Reviews in Plant Biology, 54, 519–549.
5. Cocking E.C (1960). Enzymatic degradation of cell wall for protoplast formation.
Nature , 187, 927–929.
6. Duran- Vila N., (1992). Morphognesis and tissue culture sweet orange (Citrus si- nesis (L. Osb.): Effect of temperature and photosynthetic radiation. Plant Cell. Tissue and Organ Culture, 29, 11-18.
7. Eugenio P. M. B. and Neftali O. A., (1997). In vitro regeneraiton of Mexican lime and mandarin by direct organogenesis. Hort. Science, 5, 931-934.
8. Frearson E.M, Power JB, Cocking E.C (1973). The isolation, culture and regene- ration of Petunia leaf protoplasts. Dev Biol, 33, 1130–1137.
9. Ginblat, U. (1972). Differentiation of citus stem in vitro. J.Am.Soc.Hortic. Sci, 97, 599-603.
10. Guek-Eng Sim, Chiang-Shiong Loh, and Chong-Jin Gob (1988). Direct somatic embryogenesis from protoplasts of Citrus mitis Blanco. Plant Cell Reports ,7, 418-420.
11. Grosser JW, Gmitter FG Jr (1990). Protoplast fusion and citrus improvement,
Chapter 10. In Plant Breeding Reviews 8. Timber Press Inc, Portland, pp 339– 374.
12. Grosser, J.W., G.A. Moore&F.G. Gmitter Jr., (1989). Interspecific somatic hybrid plants from the fusion of ‘Key’ lime (Citrus aurantifolia) with Valencia sweet orange (Citrus sinensis) protoplasts. Sci Hort, 39, 23–29.
13. Harvey, L., Amold, B., Lawrence, Z., Paul, M., David, B. & Jame, P., (2000).
Molecular Cell Biology. W. H. Freeman and Company, New York.
14. Hearn C.J. (1986). Development of seedless grapefruit cultivars through bud- wood irradiation. J. Amer. Soc. Hort. Sci, 1112, 304-306.
15. Hensz, R.A. (1977). Mutation breeding and the development of ‘Star Ru- by’grapefruit. Proc. Intl. Soc. Citriculture, 2, 582-585.
16. Hyun Joo An, et al (2008). Production of Somatic Hybrids between Satsuma an- darin (Citrus unshiu) and Navel Orange (Citrus sinensis) by Protoplast Fusion.
Journalof Plant Biology, 51, 186-191.
17. Kerry Hosmer Caffall, Debra Mohnen (2009) The structure, function, and biosyn- thesis of plant cell wall. Carbohydrate Research, 344, 1879–1900.
18. Kitto S. L. and Young M. J. (1981). In vitro propagation of Carrizo Citrange.
HortScience, a, 305-306.
19. Kochba et al. (1972). Adventive plants from ovules and nuclli in citrus. Planta, 106, 237-245.
20. Kordan H. A., (1959). Proliferation of excised juice vesicles of lemon in vitro.
Science, 129, 779-780.
21. Ling, J.T., Nito, N., Iwamasa, M., Kunitake, H. (1990). Plant regeneration from pro- toplasts isolated from embryogenic callus of Sat suma. Hort Science, 8, 970-972.
22. Murashige T, Tucker DPH (1969). Growth factor requirements for citrus tissue culture. In: Proceedings of first international citrus symposium, 3, pp 1155–1161. 23. Moore G. A. (1986). In vitro propagation of Citrus rootstocks. HortScience, 21 (2),
300-301.
24. Navarro, L., C. N. Roistacher, and T. Murashige, (1975). Improvement of shoot- tip grafting in vitro for virus free citrus. J. Am. Soc. Hort. Sci, 100, 471-479.
25. Naima Beloualy (1990). Plant regeneration from callus culture of three citrus roots- toets. Plant cell tissue and organ culure, a,29-34. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
26. Ohgawara, T.; Kobayashi, S.; Ohgawara, E.; Uchimiya, H.; Ishii, S. (1985). So- matic hybrid plant obtained by protoplast fusion between Citrus sinensis and Pon- cirus trifoliata. Theor. Appl. Genet 71:1 – 4.
27. Parthasarathy V. A., T. K. Bose, P. C. Deka (2001). Biotechnology Of Horticul- tural Crops Vol. 1. N. P. Sales Pvt. Ltd.
28. Rangaswamy, N. S. (1961). Experimental studies on female reproductive struc- tures of Citrus microcarpa Bunge. Phytomorphology, 11, 109-127.
29. Roose. M. L., Williams, T. E. (2000). Citrus Scion Breeding in California. Proc. Intl. Soc. Citricult , 1, 34-36.
30. Russo F., domini B., and Starrantino S. (1981). Mutagenesis applied for citrus improvement. Proc. Intl. Soc. Citriculture, 1, 68-70.
31. Sim, G. E., C. J. Goh, and C. S. loh, (1989). Micropropagation of citrus Mitis blanco- Multiple bud formation from shoot and explants in the presence of 6- Benzylaminopurine. Plant science, 59, 203-210.
32. Tapati- Das, Mitra, G.C., Chatterjee, A., das, T. (1995). Micropropagation of Citrus sinensis var. mosambi an improtant scion. Ohytomorphology, 45, 57-64.
33. Vardi A, Galun E (1988). Recent advances in protoplast culture of horticultural crops: citrus. Sci Hort 37:217–230.
34. Widholm, J.M. (1972). The use fluorescein diacetate and phenosafranine for de- termining viability of cultured plant cells. Stain Technology, 47, 89-94.
35. Wang, D. and Chang, C.J. (1978). Triploid citrus plantlet from endosperm culture.
Sci. Sin, 21, 822-827.
36. Xiaodong Cai, Yanxin Duan, Jin Fu, Wenwu Guo (2010). Production and molecu- lar characterization of two new Citrus somatic hybrids for scion improvement. Ac- ta Physiol Plant, 32: 215–221.
Tài liệu web
37. http://www.sigmaaldrich.com
38. http://www.ccrc.uga.edu/~mao/intro/ouline.htm
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: Môi trường MS, MT và RMAN Thành phần
môi trường MS MT RMAN
NH4NO3 1650 1650 825 KNO3 1900 1900 950 KH2PO4 170 170 85 MgSO4.7H2O 370 370 185 CaCl2.H2O 440 440 220 Na2EDTA 37.3 37.3 18.65 FeSO4.7H2O 27.8 27.8 13.9 MnSO4 23.3 22.3 11.15 ZnSO4.7H2O 8.6 8.6 4.3 H3BO3 6.2 6.2 3.1 KI 0.83 0.83 0.415 Na2MoO4.2H2O 0.25 0.25 0.125 CuSO4.5H2O 0.025 0.025 0.013 CoCI2.6H2O 0.025 0.025 0.013 Thiamine HCI 0.1 10 5 Pyridoxine HCI 0.5 10 5 Nicotinic Acid 0.5 1 0.5 Glucine 2.0 - - Myoinositol - 100 - Sucrose - 50000 25000 Malt extract - 500 -
PHỤ LỤC 2
Phương pháp đếm tế bào trần dùng buồng đếm hồng cầu Số tế bào/1ml =
c b
a* *4000*1000
a : số tế bào đếm được trong 5 ô lớn b : nghịch đảo nồng độ pha loãng tế bào c : số ô nhỏ trong 5 ô lớn ( 16 x 5 )
Nhỏ lên hai khoang
Đậy lá kính (dùng tay ấn nhẹ)
Nhỏ lên buồng đếm
Thấm nước dư
Quan sát dưới kính hiển vi Mẫu Nước Pha loãng XO O O X XO O X O XO O
PHỤ LỤC 3: CHUYỂN ĐỔI LỰC LY TÂM Công thức chuyển đổi lực ly tâm: g = (1,118 × 10-5) *R*(rpm)2 Bảng tra một số giá trị lực ly tâm chuyển đổi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tốc độ(rpm)
Bán Kính Roto Máy Ly Tâm R (cm)
5 6 7 8 9 10 11 12 500 14 17 20 22 25 28 31 34 1000 56 67 78 89 101 112 123 134 1500 126 151 176 201 226 252 277 302 2000 224 268 313 358 402 447 492 537 2500 349 419 489 559 629 699 769 839 3000 503 604 704 805 906 1006 1107 1207 3500 685 822 959 1096 1233 1370 1507 1643 4000 894 1073 1252 1431 1610 1789 1968 2147 4500 1132 1358 1585 1811 2038 2264 2490 2717 5000 1398 1677 1957 2236 2516 2795 3075 3354 5500 1691 2029 2367 2706 3044 3382 3720 4058 6000 2012 2415 2817 3220 3622 4025 4427 4830 6500 2362 2834 3306 3779 4251 4724 5196 5668 7000 2739 3287 3835 4383 4930 5478 6026 6574 7500 3144 3773 4402 5031 5660 6289 6918 7547 8000 3578 4293 5009 5724 6440 7155 7871 8586 8500 4039 4847 5654 6462 7270 8078 8885 9693 9000 4528 5433 6339 7245 8150 9056 9961 10867
Bảng kết quả thí nghiệm 1 Nghiệm thức Nồng độ enzyme(%w/v) Mật độ (tbt x 107/g lá) Onozuka R10 pectinase Lần 1 Lần 2 Lần3 1 1 0,1 2,32 2,72 2,56 2 2 0,1 2,70 2,86 2,74 3 3 0,1 2,80 3,01 3,10 4 1 0,2 3,10 3,22 3,15 5 2 0,2 5,10 4,98 4,80 6 3 0,2 3,28 3,37 3,41 7 1 0,3 3,60 3,55 3,78 8 2 0,3 5,40 5,50 5,63 9 3 0,3 3,30 3,15 3,42
PHỤ LỤC 5 Bảng kết quả thí nghiệm 2 Nghiệm thức Thời gian (giờ ) Mật độ tế bào (tbt x 107/g lá) Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 2 0 0 0 2 3 1,5 1,45 1,6 3 5 2,25 2,3 2,15 4 6 1,5 2 1,8 5 16 5,8 5,4 5,7
PHỤ LỤC 6 Bảng kết quả thí nghiệm 3 Nghiệm thức Tốc độ ly tâm (vòng/phút) Mật độ tế bào (tbt x 106/g lá) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 1 750 4,5 5,2 4,8 4,6 5,1 2 850 5,5 4,9 5,4 5,7 4,8 3 1000 3,1 2,8 3,2 2,7 2,9
PHỤ LỤC 7 Bảng kết quả thí nghiệm 4 Nghiệm thức Môi trường Mật độ (tbt x105/ml) Số dòng tế bào Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 MT 0,5 86 88 91 2 MT 1 52 58 55 3 MT 5 37 41 39 4 MS 0,5 62 63 59 5 MS 1 48 51 50 6 MS 5 29 33 32 7 RMAN 0,5 54 50 53 8 RMAN 1 25 21 24 9 RMAN 5 11 15 14