Các thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3-5 lần tùy theo thí nghiệm. Kết quả các thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm MSTATC 5.0.
3.4.3.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các enzyme cellu- lase và pectinase lên sự phân lập tế bào trần mô lá cây tắc.
Các bước chuẩn bị mẫu lá được thực hiện theo mục 3.3.2 và phân lập tế bào trần được thực hiện theo bước 4.4.1 và có những sự điều chỉnh như sau:
- Thí nghiệm sử dụng phối hợp 2 loại enzyme: cellulase onozuka-R10 (Meck) và pectinase (sigma)
- Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ enzyme cellulase khác nhau 1%, 2%, 3% và tương ứng với các nồng độ của pectinase là 0.1%, 0.2%, 0.3%.
- Mỗi nghiệm thức enzyme tiến hành xử lý phân lập 1g lá tắc và lặp lại 3 lần.
- Mẫu lá được xử lý với dung dịch enzyme trong vòng 16 giờ .
- Sau thời gian xử lý dung dịch enzyme được loại bỏ cẩn thận, sau đó được rửa lại với 5 ml dung dịch B (bảng 3.1) và được lặp lại 3 lần. Tiếp theo ta tiến hành đếm mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu và so sánh giữa các nồng độ enzyme để xác định hỗn hợp enzyme có nồng độ hiệu quả nhất.
Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm 1 Nghiệm thức Nồng độ cellulase (%) Nồng độ pectinase (%) 1 3 0,3 2 3 0,2 3 3 0,1 4 2 0,3 5 2 0,2 6 2 0,1 7 1 0,3 8 1 0,2 9 1 0,1
Thí nghiệm bao gồm 9 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần xử lý 1g lá.
Chỉ tiêu theo dõi: số lượng tế bào trần nguyên vẹn sau khi phân lập.
Các bước xử lý mẫu lá được tiến hành như mục 3.3.2 và phân lập tế bào trần được thưc hiện theo mục 3.4.1 và có những thay đổi như sau:
Xử lý mẫu lá tắc ở cùng 1 nồng độ hỗn hợp enzyme cellulase 2% và pectinase 0.3%.
Thời gian xử lý mẫu lá với enzyme được thực hiện ở 2 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 6 giờ, 16 giờ. Sau đó, dung dịch enzyme được loại bỏ và rửa mẫu bằng 5 ml dung dịch B lặp lại 3 lần. Tiếp theo, tiến hành đếm mật độ tế bào trần bằng buồng đếm hồng cầu và so sánh mật độ tế bào trần giữa các thời gian xử lý khác nhau để xác định thời gian xử lý cho mật độ tế bào cao nhất.
Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm 2
Nghiệm thức Thời gian xử lý (giờ)
1 2
2 3
3 5
4 6
5 16
Thí nghiệm bao gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1g lá.
Chỉ tiếu theo dõi: số lượng tế bào trần nguyên vẹn sau khi phân lặp.
3.4.3.3 Thí nghiệm 3 : Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ ly tâm tinh sạch tế bào trần lên số tế bào trần thu được
Dịch tế bào trần sau khi rửa 3 lần bằng dung dịch B được chứa vào các ống ly tâm 15 ml và tiến hành ly tâm theo các bước sau:
Ly tâm lần 1 và lần 2 được thực hiện ở tốc độ (vòng/phút): 750, 850, 1000 tương ứng trong 10 phút và so sánh số tế bào trần nguyên vẹn sau khi ly tâm cũng như độ tinh sạch của dung dịch chứa tế bào trần (quan sát dưới kính hiển vi)
Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm 3
Nghiệm thức Tốc độ ly tâm (vòng/phút)
1 750
2 850
3 1000
Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 g lá.
Chỉ tiêu theo dõi: số tế bào trần nguyên vẹn sau khi ly tâm tinh sạch và độ tinh sạch của dung dịch chứa tế bào trần được đánh giá từ 1+ đến 3+: + không sạch; ++ sạch và +++ rất sạch.
3.4.3.4 Thí nghiệm 4 : Nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau lên sự tái sinh mô sẹo từ tế bào trần thịt lá cây tắc.
Thực hiện phân lập và tinh sạch tế bào trần từ mô thịt lá cây tắc theo mục 3.4.1 và tiến hành nuôi cấy trên các môi trường khác nhau.
Môi trường sử dụng nuôi cấy thử nghiệm tế bào trần cây tắc gồm 3 môi trường cơ bản MS, MT và RMAN.
Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm 4
Nghiệm thức Môi trường Nồng độ tế bào ( TBT/ml) 1 MT 5x105 2 MS 1x105 3 RMAN 0,5x105 4 MT 5x105 5 MS 1x105 6 RMAN 0,5x105 7 MT 5x105 8 MS 1x105 9 RMAN 0,5x105
Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 g lá.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VAØ BIỆN LUẬN