Tạo huyền phù tế bào sinh phôi
Những noãn của C. mitis được cắt ra từ trái non (1 tháng tuổi, đường kính 10 mm) được đặt trong môi trường MT có bổ sung thêm 5% sucrose và 500 mg/l malt extract và được mà đặc với 0,2% gelrite. Mô sẹo hình thành sẽ được cấy chuyền mỗi tháng một lần trong vòng 1 năm.
Để tạo huyền phù tế bào phôi, 300–500 mg mô sẹo được chuyển vào bình tam giác 100 ml chứa 20 ml môi trường MT lỏng có bổ sung 5% sucrose và 10 mg/l BAP. Môi trường nuôi cấy được đặt trên máy lắc 120 v/p ở nhiệt độ 240C.
Huyền phù tế bào được cấy chuyền mỗi 2 tuần. Khối tế bào trong huyền phù tế bào được thu nhận bằng cách ly tâm ở 190 g trong 2 phút.
Phân lập và nuôi cấy
Khối tế bào thu được từ 10 ml dịch huyền phù tế bào đã nuôi cấy trong 8 ngày được sử dụng để tách tế bào trần. Khối tế bào được xử lý với 15 ml dung dịch enzyme chứa 0,3% cellulase R-10 (Kinki Yakult, Japan), 0,3% macerozyme R-10 (Kinki Yakult, Japan), 0,1% Driselase (Kyowa Hakko Kogyo, Japan), 0,7 M manni- tol và ½ MT trong 16 h ở 300C trong điều kiện tối và lắc 50 v/p. Sau khi xử lý en- zyme thì tế bào được lọc qua rây macrcloth (Calbiochem, USA) và sau đó lọc qua màng nylon 94 um. Tế bào trần được làm rửa 4 lần bằng cách ly tâm (90 g, 4 phút ) trong môi trường nuôi cấy.
Lớp mỏng dịch tế bào trần (4 ml với mật độ tế bào là 2 x 106 tbt/ml) được trãi trên 25 ml gelrite (0,2%) môi trường MT đặc trong đĩa petri 9 cm.
Môi trường nuôi cấy là MT cơ bản chứa 0,15 M sucrose và 0,45 M glucose. Và chỉnh pH môi trường về 5.7 trước khi lọc khử trùng bằng màng lọc 0,2 um. Và nuôi cấy trong điều kiên ánh sáng 10 µEm-2s-1 và chu kì 16 h/ngày ở 240C .
Để nhận biết sự hình thành vách tế bào tế bào trần được nhuộm bằng Calcoflour White theo phương pháp của Nagata and Takebe (1970).
Xác định khả năng sống, tế bào trần được nhuộm bằng FDA theo phương pháp của (Wldholm,1972).
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VAØ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU