Nhờ có vị trí địa lý thuận lợi, khí hậu nhiệt đới cùng độ ẩm cao, Việt Nam sở hữu một hệ sinh thái vô cùng phong phú và đa dạng. Cây cối sinh trưởng, phát triển mạnh, là nguồn tài nguyên quan trọng cho tiềm năng về dược liệu. Theo ước tính nước ta có trên 12000 loài thực vật bậc cao, trong số đó có khoảng 4000 loài được sử dụng làm thuốc 5. Ngày nay, khi nhu cầu về thuốc có nguồn gốc dược liệu ngày càng tăng, việc đi sâu vào nghiên cứu, xác minh các kinh nghiệm của y học cổ truyền và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao đang rất được thế giới quan tâm 1. Đặc biệt đối với Việt Nam, một đất nước giàu tài nguyên dược liệu, thì xu hướng phát triển các sản phẩm từ tự nhiên là một hướng đi đúng đắn. Thảo dược là đối tượng lý tưởng để các nhà khoa học sàng lọc và tìm ra các hoạt chất mới cho tác dụng mạnh, độc tính thấp, giảm thiểu chi phí nghiên cứu phát triển so với tổng hợp hóa học. Mỗi cây thuốc có chứa một hỗn hợp các hợp chất khác nhau, tuy nhiên trong mọi trường hợp hầu hết chưa xác định rõ hợp chất nào cho tác dụng điều trị. Chính vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học của các loài cây đem lại ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn cao. Những tiến bộ trong định tính và định lượng các phân tử thuốc từ thực vật giúp chúng ta hiểu rõ hơn về mối quan hệ giữa các thành phần và tác dụng của chúng. Cây Cỏ rươi lá bắc thuộc chi Murdannia, một trong những chi lớn nhất của họ Thài lài (Commelinaceae). Chi này phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và ôn đới ấm 18, thích hợp với khí hậu nóng ẩm; ở Việt Nam có 16 loài, trong đó 7 loài được sử dụng làm thuốc 2. Cỏ rươi lá bắc, tên khoa học Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong, tìm thấy ở Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Việt Nam 48. Một số nghiên cứu trên thế giới ghi nhận loài cây này có tác dụng kháng khuẩn 47, chống viêm 46, bảo vệ gan 49, hỗ trợ điều trị ung thư gan và tiểu đường 39. Trong y học cổ truyền một số nước, Murdannia bracteata được dùng để trị ho 30, kháng viêm 2, chữa các bệnh về gan, thận 39. Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu cụ thể về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Cỏ rươi lá bắc ở Việt Nam còn rất hạn chế. Để góp phần xây dựng cơ sở khoa học cho việc ứng dụng Cỏ 2 rươi lá bắc trong điều trị bệnh, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây Cỏ rươi lá bắc (Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong)” với những mục tiêu sau: 1. Định tính sơ bộ thành phần hóa học của lá cây Cỏ rươi lá bắc. 2. Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của 02 hợp chất từ lá cây Cỏ rươi lá bắc.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC - - LÊ PHƯƠNG THẢO BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CỎ RƯƠI LÁ BẮC (Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2020 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt (ppm) Tên tiếng Anh (ppm = part per million) ALT Alanine transaminase AST Aspartate transaminase d doublet dd double doublet Độ dịch chuyển hóa học C-NMR C Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Phổ DEPT 13 13 Tên tiếng Việt D-GalN dLGG EC50 D-galactosamine N 1,2-di-O-α-linolenoyl-3-O-galactopyranosyl-sn-glycerol Half Maximal Effective Concentration Nồng độ cho 50% tác dụng tối đa ESI-MS Electrospray Ionization Mass Khối phổ đo phương pháp Spectrometry ion hóa phun điện tử EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry Sắc ký khí ghép khối phổ Galactolipids-enriched Extract of M bracteata Dịch chiết giàu galactolipid Murdannia bracteata GLE Chữ viết tắt H-NMR HE Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt H Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Hexane Extract of M bracteata Dịch chiết hexan M bracteata HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Correlation nhiều liên kết HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết Half Maximal Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối đa nửa iNOS Inducible Nitric Oxide Synthase NO synthase cảm ứng IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại J (Hz) J coupling constant Hằng số ghép LPS Lipopolysaccharide ME Methanol Extract of Murdannia bracteata IC50 MeOH MIC Dịch chiết methanol M bracteata Methanol Minimun Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu chất có hoạt tính kháng sinh s singlet SI Selective Index Hệ số chọn lọc Ultra Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng siêu hiệu UPLC DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Hình 1.1 Tên hình Đặc điểm thực vật số lồi thuộc chi Murdannia Việt Nam Trang 5-6 Hình 1.2 Hoa số lồi thuộc chi Murdannia Hình 1.3 Đặc điểm quan sinh dưỡng Murdannia bracteata Hình 1.4 Đặc điểm quan sinh sản Murdannia bracteata Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ Cỏ rươi bắc 26 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hai hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat 27 Hình 3.3 Cấu trúc hóa học hợp chất CT1 29 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học hợp chất CT2 30 DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Bảng 1.1 Phân bố loài thuộc chi Murdannia Việt Nam Bảng 1.2 Một số hợp chất phân lập từ Murdannia bracteata Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất hữu phương pháp hóa học Trang 4-5 11 - 12 24 - 25 Số liệu phổ DEPT, 1H- 13C-NMR CT1 chất Bảng 3.2 tham khảo đo DMSO 28 Số liệu phổ DEPT, 1H- 13C-NMR CT2 chất Bảng 3.3 tham khảo đo DMSO 29 - 30 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Murdannia 1.1.1 Vị trí phân loại chi Murdannia 1.1.2 Số lượng loài phân bố loài thuộc chi Murdannia 1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Murdannia 1.2 Tổng quan loài Murdannia bracteata 1.2.1 Đặc điểm hình thái lồi Murdannia bracteata 1.2.2 Đặc điểm phân bố loài Murdannia bracteata 1.2.3 Thành phần hóa học Murdannia bracteata 1.2.4 Tác dụng sinh học Murdannia bracteata 13 1.2.5 Công dụng Murdannia bracteata theo y học cổ truyền 16 1.2.6 Sản phẩm có thành phần Murdannia bracteata thị trường 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1 Nguyên liệu 17 2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phương pháp định tính nhóm chất hữu có Cỏ rươi bắc 18 2.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc số hợp chất có Cỏ rươi bắc 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Kết định tính nhóm chất phương pháp hóa học 24 3.2 Kết chiết xuất, phân lập số hợp chất Cỏ rươi bắc 25 3.2.1 Chiết phân đoạn từ Cỏ rươi bắc 25 3.2.2 Phân lập hợp chất sắc ký cột 26 3.2.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 27 3.3 Bàn luận 31 3.3.1 Về định tính nhóm chất 31 3.3.2 Về chiết xuất phân lập 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 MỞ ĐẦU Nhờ có vị trí địa lý thuận lợi, khí hậu nhiệt đới độ ẩm cao, Việt Nam sở hữu hệ sinh thái vô phong phú đa dạng Cây cối sinh trưởng, phát triển mạnh, nguồn tài nguyên quan trọng cho tiềm dược liệu Theo ước tính nước ta có 12000 lồi thực vật bậc cao, số có khoảng 4000 lồi sử dụng làm thuốc [5] Ngày nay, nhu cầu thuốc có nguồn gốc dược liệu ngày tăng, việc sâu vào nghiên cứu, xác minh kinh nghiệm y học cổ truyền tìm kiếm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao giới quan tâm [1] Đặc biệt Việt Nam, đất nước giàu tài nguyên dược liệu, xu hướng phát triển sản phẩm từ tự nhiên hướng đắn Thảo dược đối tượng lý tưởng để nhà khoa học sàng lọc tìm hoạt chất cho tác dụng mạnh, độc tính thấp, giảm thiểu chi phí nghiên cứu phát triển so với tổng hợp hóa học Mỗi thuốc có chứa hỗn hợp hợp chất khác nhau, nhiên trường hợp hầu hết chưa xác định rõ hợp chất cho tác dụng điều trị Chính vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học loài đem lại ý nghĩa khoa học giá trị thực tiễn cao Những tiến định tính định lượng phân tử thuốc từ thực vật giúp hiểu rõ mối quan hệ thành phần tác dụng chúng Cây Cỏ rươi bắc thuộc chi Murdannia, chi lớn họ Thài lài (Commelinaceae) Chi phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới ơn đới ấm [18], thích hợp với khí hậu nóng ẩm; Việt Nam có 16 lồi, loài sử dụng làm thuốc [2] Cỏ rươi bắc, tên khoa học Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong, tìm thấy Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Việt Nam [48] Một số nghiên cứu giới ghi nhận loài có tác dụng kháng khuẩn [47], chống viêm [46], bảo vệ gan [49], hỗ trợ điều trị ung thư gan tiểu đường [39] Trong y học cổ truyền số nước, Murdannia bracteata dùng để trị ho [30], kháng viêm [2], chữa bệnh gan, thận [39] Tuy nhiên, nghiên cứu cụ thể thành phần hóa học tác dụng sinh học Cỏ rươi bắc Việt Nam cịn hạn chế Để góp phần xây dựng sở khoa học cho việc ứng dụng Cỏ rươi bắc điều trị bệnh, lựa chọn thực đề tài: “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học Cỏ rươi bắc (Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong)” với mục tiêu sau: Định tính sơ thành phần hóa học Cỏ rươi bắc Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc 02 hợp chất từ Cỏ rươi bắc CT1-DMSO-HMBC ppm 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 13 12 11 10 210 ppm CT1-DMSO-HMBC ppm 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 13 12 11 10 ppm CT1-DMSO-HMBC ppm 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8 6.6 6.4 6.2 ppm Page of Instrument: LC-MSD-Trap-SL 2195410AE0000515 Operator: Display Report - Selected Window Selected Analysis Analysis Name: CT2.d Cot150x3mm.m Method: Sample Name: CT2 Analysis Info: Column Eclipse XDB-C18, 4.6 x150mm MSD Trap Report v (A4-Opt2) Print Date: 14/4/2020 1:36:14 PM Acq Date: 14/4/2020 1:36:01 PM 14 13 12 10 9.539 9.305 0.94 2.00 3.297 2.508 2.503 2.500 2.495 2.492 CT2-DMSO-1H 1.04 1.02 11 7.676 7.670 7.549 7.543 7.532 7.526 6.894 6.875 6.406 6.401 6.188 6.183 1.02 10.802 0.81 12.501 1.00 1.00 1.03 ppm Current Data Parameters NAME MAI_CT2 EXPNO 10 PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200409 Time 16.14 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 16 DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 sec RG 111.09 DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 304.2 K D1 1.00000000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 500.1920889 MHz NUC1 1H P1 10.20 usec PLW1 22.00000000 W F2 - Processing parameters SI 65536 SF 500.1890051 MHz WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 7.8 7.7 1.00 7.6 1.03 7.676 7.670 7.5 7.549 7.543 7.532 7.526 7.4 7.3 7.1 7.0 6.9 6.894 6.875 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 1.04 6.406 6.401 6.3 6.2 1.02 6.188 6.183 CT2-DMSO-1H 7.2 1.02 ppm 220 200 180 175.79 160 120 121.92 119.93 115.56 115.04 100 102.97 98.14 93.30 80 60 40 40.00 39.83 39.66 39.50 39.33 39.16 39.00 CT2-DMSO-C13CPD 135.67 140 163.83 160.68 156.10 147.65 146.77 145.01 20 ppm Current Data Parameters NAME LOI_CT2 EXPNO PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20200410 Time 6.19 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 256 DS SWH 31250.000 Hz FIDRES 0.476837 Hz AQ 1.0485760 sec RG 198.57 DW 16.000 usec DE 6.50 usec TE 304.7 K D1 2.00000000 sec D11 0.03000000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 125.7864591 MHz NUC1 13C P1 10.00 usec PLW1 88.00000000 W ======== CHANNEL f2 ======== SFO2 500.1910008 MHz 1H NUC2 CPDPRG[2 waltz16 PCPD2 80.00 usec PLW2 22.00000000 W PLW12 0.35764000 W PLW13 0.17989001 W F2 - Processing parameters SI 32768 SF 125.7726885 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.40 175 175.79 170 165 163.83 155 156.10 150 145 147.65 146.77 145.01 140 135 135.67 130 125 121.92 120 119.93 115 115.56 115.04 110 105 102.97 100 98.14 95 ppm 93.30 CT2-DMSO-C13CPD 160 160.68 200 DEPT90 210 DEPT135 200 CH&CH3 CH2 210 200 C13CPD 210 190 190 180 180 180 170 170 170 160 160 160 150 150 150 140 140 140 130 130 130 120 120 120 110 110 110 100 100 100 90 90 90 80 80 80 70 70 70 60 60 60 50 50 50 40 40 40 30 30 30 20 20 20 10 10 10 ppm ppm ppm CT2-DMSO-C13CPD&DEPT 190 DEPT90 DEPT135 CH&CH3 CH2 C13CPD 120 120 115 115 115 110 110 110 105 105 105 100 100 100 95 95 95 ppm ppm ppm CT2-DMSO-C13CPD&DEPT 120 CT2-DMSO-HSQC ppm 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 ppm CT2-DMSO-HSQC ppm 92 94 96 98 100 102 104 106 108 110 112 114 116 118 120 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8 6.6 6.4 6.2 ppm CT2-DMSO-HMBC ppm 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 13 12 11 10 ppm CT2-DMSO-HMBC ppm 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 12 11 10 ppm CT2-DMSO-HMBC ppm 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 6.8 6.6 6.4 6.2 6.0 ppm ... Để góp phần xây dựng sở khoa học cho việc ứng dụng Cỏ rươi bắc điều trị bệnh, lựa chọn thực đề tài: ? ?Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học Cỏ rươi bắc (Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong)? ??... Trong y học cổ truyền số nước, Murdannia bracteata dùng để trị ho [30], kháng viêm [2], chữa bệnh gan, thận [39] Tuy nhiên, nghiên cứu cụ thể thành phần hóa học tác dụng sinh học Cỏ rươi bắc Việt... Trà Rumput Beijing Tea – Thành phần chính: Murdannia bracteata 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu Cây Cỏ rươi bắc có hoa thu hái huyện