Nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân tinh bột sống

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRẦN THỊ TRÚC THANH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG THUỶ PHÂN TINH BỘT SỐNG CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH : 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2008 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học : PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét : TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét : TS NGUYỄN THỊ THANH KIỀU (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc -oOo Tp HCM, ngày tháng năm NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Trần Thị Trúc Thanh Giới tính : Nữ Ngày, tháng, năm sinh : 24/08/1983 Nơi sinh : Tây Ninh Chuyên ngành : Công nghệ sinh học MSHV : 03106683 Khoá (Năm trúng tuyển) : 2006 1- TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG THUỶ PHÂN TINH BỘT SỐNG 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: - Phân lập, làm vi sinh vật có khả thuỷ phân tinh bột sống - Khảo sát hoạt tính enzym α-amylase, glucoamylase, enzym thuỷ phân tinh bột sống, enzym cellulase; chọn chủng có khả thủy phân tinh bột sống tốt - Dựa nguồn chất bã khoai mì, tiến hành khảo sát điều kiện ni cấy nhằm tối ưu hoá việc thu nhận enzym từ chủng vi sinh vật chọn - Thử nghiệm khả thuỷ phân tinh bột sống chủng chọn nguồn tinh bột sống khác nhau, môi trường bã khoai mì sống 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) Luận văn khơng thể hồn thành khơng có giúp đỡ tận tình, lời động viên chân thành người thân, thầy cô, anh chị người bạn sát cánh bên tơi Xin cho tơi gửi đến người lịng biết ơn chân thành sâu sắc! Con xin cảm ơn mẹ! Tuy không cạnh suốt trình làm việc mẹ ln dõi theo với lo lắng lời động viên mộc mạc! Con xin cảm ơn thầy – PGS TS Nguyễn Đức Lượng nhiệt tình hướng dẫn truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian thực luận văn! Em xin cảm ơn thầy cô môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách khoa TP HCM cho em học hữu ích kiến thức chuyên môn suốt thời gian qua! Luận văn khơng đạt kết khơng có giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cô phịng thí nghiệm Em xin chân thành cảm ơn! Tôi xin cảm ơn chị Phương, chị Như, chị Thúy, chị Huyền, bạn Quang Tâm, bạn Nhã, bé Trúc bạn tơi nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ, động viên tơi lúc khó khăn suốt q trình thực đề tài! Tơi gửi lời cảm ơn đến bạn Cao học 2006, em sinh viên làm việc phịng thí nghiệm! Một lần xin chân thành cảm ơn người hết lịng giúp đỡ tơi hồn thành luận văn! TÓM TẮT NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN TINH BỘT SỐNG Các chủng nấm mốc phân lập từ môi trường bã khoai mì bị lên men đem xác định hoạt tính enzym Chủng có enzym thuỷ phân tinh bột sống mạnh chọn để khảo sát điều kiện ni cấy nhằm tối ưu hố việc thu nhận enzym Enzym thô sau thu nhận dùng để thử khả thuỷ phân tinh bột sống nguồn tinh bột sống khác nhau, mơi trường bã khoai mì sống Cơ sở: Ở nơi giàu nguồn chất đó, có vi sinh vật tương ứng mang hệ enzym chuyển hố chất thành thức ăn cho Phương pháp: Sử dụng mơi trường pepton cao nấm men có bổ sung 1% tinh bột sống để phân lập chủng vi sinh vật có khả thuỷ phân tinh bột sống Các phương pháp xác định đường khử sử dụng xuyên suốt trình xác định hoạt độ enzym, đánh giá khả thuỷ phân tinh bột sống dựa vào lượng đường khử tạo thành Kết luận: Trong ba chủng nấm mốc phân lập được, chủng M3 chọn có khả sinh tổng hợp enzym thuỷ phân tinh bột sống, glucoamylase, cellulase mạnh vượt trội hai chủng lại, dù khả sinh α-amylase không mạnh Trên môi trường ni cấy có độ ẩm 55%, pH 6.5, bổ sung 5% cám gạo, 4% tinh bột sắn (bột mì) sống chủng có khả sinh tổng hợp enzym mạnh Chủng nấm mốc có khả thuỷ phân nhiều loại tinh bột sống khác bột bắp, bột gạo, bột sắn, tinh bột tan, bã khoai mì sống Trong đó, thuỷ phân tinh bột sắn sống, bã khoai mì sống tốt Ứng dụng: Tạo bước khởi đầu cho nghiên cứu từ chủng nấm mốc nhằm tiến tới ứng dụng công nghệ sản xuất cồn từ bã khoai mì sống, vừa giảm chi phí sản xuất, vừa đơn giản hoá thiết bị sản xuất, vừa giải phần ô nhiễm môi trường nhà máy sản xuất bột mì gây ABSTRACT ISOLATION OF MICROORGANISMS, CAPABLE OF HYDROLYSING RAW STARCH Objective: Molds, isolated from rotten starch-processing waste from cassava starch plant were used to determine enzyme activity The strain with the best capability of raw starch digetion would be chosen.The optimal culture of production enzymes from this strain was studied The crude enzyme would be used to test its raw starch digesting ability on many sources of raw starch and waste on cassava starch plant Background: It is the fact that one place having high concentration of one substract always contains the suitable microorganisms which have enzymes can transfom this substract to its food Method: Pepton-Yeast extract-raw starch-agar medium was used as isolated medium Determining reducing sugar methods such as Somogyi-Nelson method, and DNS method were be used to calculate the enzyme activity and determine raw starch hydrolysis extent Conclusion: In three strain of isolated molds, regardless of α-amylase activity is not good, M3 strain was choosen because it can synthesize raw starch digesting enzyme, glucoamylase, and cellulase remarkable stronger than the other strains With the starchprocessing waste from cassava starch plant as the main substract, the culture with 55% of moisture, pH 6.5, 5% of mash of rice, 4% of raw cassava starch is good for production enzyme from this mold This mold can hydrolyse many kind of raw starchs such as raw corn starch, raw rice starch, raw cassava starch, soluble starch, and raw starch-processing waste from cassava starch plant Among them, raw cassava starch and raw starchprocessing waste from cassava starch plant are the best substracts for this mold Application: This is one of the first steps for after researches on this mold to aim at fermenting ethanol from raw starch-processing waste from cassava starch plant Its advantages are not only reducing production cost, simplifying equipment, but also solving a part of enviroment pollution problem from cassava starch processing factories MỤC LỤC Trang Danh mục bảng Danh mục hình Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu Phần 2: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 2.1 Tổng quan tinh bột 2.1.1 Cấu tạo, tính chất tinh bột 2.1.2 Tinh bột sắn (khoai mì) 12 2.2 Quá trình thủy phân tinh bột 17 2.2.1 Các enzym thủy phân tinh bột 17 2.2.2 Quá trình thủy phân tinh bột 26 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân tinh bột 32 2.3 Các nghiên cứu ngồi nước q trình thủy phân tinh bột sống 36 2.3.1 Tình hình nghiên cứu nước 36 2.3.2.Tình hình nghiên cứu nước ngồi 38 2.4 Nguồn thu nhận enzym amylase 39 2.4.1 Các vi sinh vật 39 2.4.2 Thực vật 45 Phần 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Nguyên liệu 47 3.1.1 Giống vi sinh vật 47 3.1.2 Nguyên vật liệu 47 3.1.3 Môi trường PGA 48 3.1.4 Môi trường giữ giống 48 3.1.5 Dụng cụ thiết bị 48 3.2 Phương pháp 48 3.2.1 Phương pháp phân lập nhanh vi sinh vật thủy phân tinh bột sống 48 3.2.2 Phương pháp giữ giống vi sinh vật 49 3.2.3 Phương pháp xác định hình thái giống 49 3.2.4 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzym 50 3.2.5 Xác định đường khử theo phương pháp Somogyi-Nelson 52 3.2.6 Xác định đường khử theo phương pháp DNS 53 3.2.7 Phương pháp xác định hoạt tính enzym 55 3.2.7.1 Xác định hoạt độ α-amylase theo phương pháp Rukhliadeva Geriacheva 55 3.2.7.2 Glucoamylase 57 3.2.7.3 Enzym thủy phân tinh bột sống 58 3.2.7.4 Cellulase 59 3.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng độ ẩm đầu đến việc nuôi cấy thu nhận enzym 60 3.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng pH đầu đến việc nuôi cấy thu nhận enzym 61 3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng việc thay thành phần bã khoai mì cám gạo đến việc nuôi cấy thu nhận enzym 61 3.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung chất cảm ứng đến việc nuôi cấy thu nhận enzym 62 3.7 Phương pháp khảo sát thời gian nuôi cấy thu nhận enzym 62 3.8 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nước chất lên men tinh bột sống đến việc nuôi cấy thu nhận enzym 62 3.9 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ chế phẩm enzym chất để thu lượng đường khử cao 63 3.10 Thử khả thủy phân tinh bột sống nguồn chất khác 64 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN A Kết phân lập vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzym thủy phân tinh bột sống 65 Kết khảo sát hoạt tính enzym 68 1.1 Enzym α-amylase 69 1.2 Enzym glucoamylase 69 1.3 Enzym thủy phân tinh bột sống 70 1.4 Enzym cellulase 71 Xác định hình thái giống M3 73 B Kết nuôi cấy để thu nhận enzym Amylase 74 Ảnh hưởng pH đầu 75 Ảnh hưởng độ ẩm 77 Khảo sát việc bổ sung, thay phần bã khoai mì cám gạo 78 Khảo sát việc cảm ứng tạo enzym thủy phân tinh bột sống 80 Thời gian thu nhận enzym 81 C Kết nuôi cấy thu nhận enzym amylase nguồn chất khác 84 Tỉ lệ chất nước 85 1.1 Cơ chất bã khoai mì khơ 85 1.2 Cơ chất bã khoai mì ướt 86 Tỉ lệ enzym : chất lượng đường khử tạo thành theo thời gian 87 Khảo sát nguồn chất khác 88 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ A Kết luận 90 B Đề nghị 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 Phần 6: PHỤ LỤC Phụ lục kết Phiếu kết kiểm nghiệm thành phần bã khoai mì thu từ Lị mì số 2, Ấp Giồng Tre, xã Bình Minh, Thị xã Tây Ninh DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Nhiệt độ hồ hóa số loại tinh bột 11 Bảng 2.2: Các nhóm vi sinh vật tìm thấy nước thải nhà máy chế biến tinh bột sắn 16 Bảng 2.3: Tổng vi sinh vật nước thải từ nhà máy chế biến tinh bột sắn 16 Bảng 2.4: Quá trình dịch hóa tinh bột cơng nghiệp 28 Bảng 3.1: Kết phân tích thành phần bã khoai mì ướt 47 Bảng 4.1: Kết đường chuẩn theo phương pháp Somogyi-Nelson 68 Bảng 4.2: Kết khảo sát ảnh hưởng pH đầu đến sinh tổng hợp 75 Bảng 4.3: Kết khảo sát ảnh hưởng độ ẩm đầu đến khả sinh tổng hợp enzym 77 Bảng 4.4: Kết khảo sát việc bổ sung, thay phần bã khoai mì cám gạo 78 Bảng 4.5: Kết khảo sát việc cảm ứng tạo enzym thủy phân tinh bột sống 80 Bảng 4.6: Kết khảo sát thời gian thu nhận enzym 81 Bảng 4.7: Kết đường chuẩn theo phương pháp DNS 84 Bảng 4.8: Kết khảo sát tỷ lệ chất (bã khoai mì khơ) nước 85 Bảng 4.9: Kết khảo sát tỷ lệ chất (bã khoai mì ướt) nước 86 Bảng 4.10: Kết khảo sát tỉ lệ enzym chất lượng đường khử tạo thành theo thời gian 87 Bảng 4.11: Kết khảo sát nguồn chất khác 88 91 Nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật có khả thủy phân tinh bột sống - Để thu lượng đường khử cao (9.54 mg/ml) sau 12g nuôi cấy cần bổ sung lượng giống (enzym thô) ban đầu 14% Tuy nhiên, thời điểm lượng đường khử thu 8.65 mg/ml chênh lệch không nhiều so với thời điểm 12 Vì vậy, xét hiệu thời điểm thu đường khử tốt Lượng đường khử tương đối thấp, chưa đủ để lên men thu nhận cồn từ bã khoai mì sống - Chủng nấm mốc M3 có khả thuỷ phân nhiều nguồn tinh bột sống khác tinh bột sắn (bột mì), bột bắp, bột gạo, tinh bột tan Trong đó, chủng thuỷ phân tinh bột sắn tốt - Theo kết kiểm nghiệm bã khoai mì ướt thu từ Lị mì số sử dụng thí nghiệm khơng ghi nhận có mặt HCN nên khả khử HCN enzym chủng chưa thể kiểm nghiệm Nhìn chung, chủng nấm mốc có khả thuỷ phân tinh bột sống tốt, đạt khoảng 43.4% so với khả thuỷ phân tinh bột hồ hố Và chủng có khả thuỷ phân nhiều loại tinh bột sống khác Đặt biệt khả thuỷ phân bã khoai mì sống tốt Ngồi ưu điểm chủng nấm mốc M3 có số điểm hạn chế thời gian nuôi cấy thu nhận enzym tương đối dài, tỉ lệ giống bổ sung lớn, lượng đường khử tạo thành chưa đủ cao để lên men cồn trực tiếp từ bã khoai mì B KIẾN NGHỊ Từ kết khảo sát trên, có số kiến nghị sau: - Định danh chủng mốc theo phương pháp gen - Thử nghiệm bổ sung đường để lên men cồn trực tiếp từ bã khoai mì sống, số tinh bột sống khác - Kiểm tra xem chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp enzym khác không nhằm mở rộng phạm vi ứng dụng GVHD: PGS TS Nguyễn Đức Lượng HVTH: Trần Thị Trúc Thanh 92 Nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật có khả thủy phân tinh bột sống - Khảo sát pH tối ưu, nhiệt độ tối thích, ảnh hưởng số ion kim loại đến hoạt tính enzym thuỷ phân tinh bột sống thu nhận từ chủng nấm mốc M3 - Khảo sát tối ưu hố mơi trường nhằm thu lượng đường khử cao khoảng thời gian ngắn - Nghiên cứu kết hợp chủng nấm mốc với số vi sinh vật có khả sinh tổng hợp α-amylase mạnh khác để tăng cường khả thủy phân tinh bột sống Hiện nay, nguồn bã khoai mì từ nhà máy chế biến tinh bột mì chủ yếu sử dụng làm thức ăn gia súc với hiệu không cao, gây ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường lượng HCN nước thải, mùi nồng khó chịu bã khoai mì dễ bị lên men Vì vậy, việc tận dụng nguồn bã khoai mì với hiệu cao vừa có ý nghĩa mặt kinh tế, vừa góp phần hạn chế nguồn gây nghiễm môi trường Để khắc phục nhược điểm thời gian thu nhận enzym, lượng giống bổ sung lớn; tăng cường ưu điểm vốn có chủng nấm mốc M3 nhằm tiến tới việc lên men thu nhận cồn trực tiếp từ nguồn chất bã khoai mì sống cần có phương pháp thực mạnh mẽ hiệu Đó phương pháp cải tạo gen Ngoài việc khảo sát sâu, rộng nhằm tạo điều kiện tối ưu để thu nhận enzym thuỷ phân tinh bột sống từ chủng M3 kiến nghị trên, kỹ thuật di truyền gần cơng cụ giúp nhanh chóng đẩy mạnh khả thuỷ phân tinh bột sống, rút ngắn thời gian thu enzym, giảm tỉ lệ giống bổ sung để tiến gần đến ứng dụng sản xuất qui mô công nghiệp GVHD: PGS TS Nguyễn Đức Lượng HVTH: Trần Thị Trúc Thanh 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước [1] Hồng Kim Anh, Ngơ Kế Sương, Nguyễn Xích Liên, Tinh bột sắn sản phẩm từ tinh bột sắn, NXB Khoa học kỹ thuật, trang 35 – 37 , 42 – 44, 109 – 114, 220 – 225, 2004 [2] Lê Văn Hoàng (chủ biên), Tinh bột khai thác ứng dụng, NXB Đà Nẵng, trang 24, 2007 [3] Phạm Thị Ánh Hồng, Kỹ thuật Sinh hóa, NXB Đại học quốc gia TP HCM, trang 113- 114, 2003 [4] Dương Bá Hồng, Nghiên cứu xử lý Biomass (rơm, rạ, trấu) phương pháp thủy nhiệt nhằm thu hồi dung dịch đường có khả lên men ethanol, Luận văn tốt nghiệp Đại học, khoa Môi trường, Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh, 2005 [5] Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng, Sử dụng Glucoamylaza từ nấm Aspergillus niger tế bào nấm men cố định lên men ethanol trực tiếp từ bột sắn, Tạp chí Sinh học, số 4, trang 28-32, 1990 [6] Dương Văn Hợp, Nghiên cứu sử dụng nịi nấm men lai lên men ethanol, Tạp chí Di truyền ứng dụng, số 2, trang 7, 1991 [7] Dương Văn Hợp, Tối ưu hố mơi trường lên men sản xuất enzym glucoamylase từ Aspergillus niger, Tạp chí Đại học Khoa học tự nhiên, Số 1, trang 27-34, 1991 [8] Dương Văn Hợp, Sử dụng nấm men chịu nhiệt lên men ethanol từ bột sắn sống, Tạp chí Nơng nghiệp Cơng nghiệp thực phẩm , số 3, trang 115- 116, 1992 [9] Dương Văn Hợp, Hoạt tính glucoamylaza thuỷ phân tinh bột sống số chủng nấm sợi phân lập, Tạp chí Sinh học, số , trang 82-86, 1993 [10] Dương Văn Hợp, Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có khả sinh glucoamylaza thuỷ phân tinh bột sống, Tạp chí Sinh học, số , trang 66-69, 1993 [11] Dương Văn Hợp cộng sự, Lựa chọn thành phần môi trường lên men ethanol trực tiếp từ bột sắn sống, Hội thảo Quốc gia khu vực, 1995 [12] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập – Thí nghiệm hóa sinh, NXB Đại học quốc gia TP.HCM, 2003 [13] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập – Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại học quốc gia TP.HCM, 2006 94 [14] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Công nghệ enzym, NXB Đại học quốc gia TP.HCM, trang 147 – 167, 317 – 334, 2004 [15] Sẽ có xăng sinh học Việt Nam, Tạp chí Cơng nghiệp Hố chất, Số 06, Năm 2006 [16] Trịnh Hồi Thanh, Nghiên cứu công nghệ chế biến rơm rạ để sản xuất cồn nhiên liệu, Luận văn cao học, khoa Cơng nghệ hóa học, Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh, 2007 [17] Đồng Thị Thanh Thu cộng sự, Sự cố định enzym thủy phân số ứng dụng, Báo cáo khoa học, Tiểu ban Sinh học, Hội nghị Khoa học lần II, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, 2000 [18] Trần Linh Thước CTV, Tạo dòng nấm men S cerevisiae tái tổ hợp biểu gen mã hóa glucoamylase, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ ĐH Quốc gia TP.HCM, tập 5, số 7, 2002 [19] Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích VSV nước, thực phẩm, mỹ phẩm, NXB Giáo Dục, 2006 [20] Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng, Cơng nghệ sản xuất kiểm tra cồn etylic, NXB Khoa học Kỹ thuật, trang 79 – 94, 2007 [21] Phạm Xuân Vượng, Giáo trình Cơng nghệ sản xuất rượu bia, NXB Hà Nội,2007 Tài liệu nước [22] Akpan, I., Uraih, N., Obuekwe, C O and Ikenebomeh, M J Production of ethanol from cassava waste, Acta Biotechnologica 8(1), p.39-45, 2004 [23] Arato, C, Pye, E.K., Gjennestad, G., The Lignol approach to biorefining of woody biomass to produce ethanol and chemicals Applied Biochemistry and Biotechnology, p.121-124, p 871-882, 2005 [24] Ballesteros, M., Oliva, J.M., Negro, M.J., Manzanares, P., Ballesteros, I., Ethanol from lignocellulosic materials by a simultaneous saccharification and fermentation process (SFS) with Kluyveromyces marxianus CECT 10875 Process Biochemistry 39, p.1843 – 1848, 2004 [25] Bengtson, H.H., Small scale ethanol production from corn technology, energy efficiency and economics Energy in Agriculture Batchelor, 1983 [26] S.E., Cook, P., Booth, EJ., Walter, KC., Economics of bioethanol production from wheat in the UK Renewable Energy (II), p 807 – 809, 1994 95 [27] C R Soccol et al, Breeding and growth of Rhizopus in raw cassava by solid state fermentation, Microbiology and Biotechnology, Volume 41, Number 3, p 330-336, 1994 [28] Delgenes, J.P., Laplace, J.M., Moletta, R., Navarro, J.M., Comparative study of separated fermentations and cofermentation processes to produce ethanol from hardwood derived hydrolysates Biomass and Bioenergy 11 (4), p 353-360, 1996 [29] Department of Microbiology, Utilization of Cassava and Cassava Waste through Fermention Technology Progress Report (June-November) Thailand-USAID Project Kasetsart University, Bangkok, 1984 [30] E.A ABU, S.A ADO AND D B JAMES, 2005, Raw starch degrading amylase production by mixed culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae African Journal of Biotechnology Vol (8), pp 785-790, August 2005 [31] Frederick Green III, Carol A Clausen, and Terry L Highley, Adaptation of the Nelson-Somogyi reducing-sugar assay to a microassay using microtiter plates, 1989 [32] Hiroshi Morita, Mayumi Matsunaga, Kouhei Mizuno, and Yusaku Fujio, A comparison of raw starch-digesting glucoamylase production in liquid and solid cultures of Rhizopus strains, 1998 [33] Hiroshi Morita, Yusaku Fujio, Effect of Organic Nitrogen Sources on Raw StarchDigesting Glucoamylase Production of Rhizopus sp MKU 40, Wiley VCH, Volume 52, Issue , p 18 – 21, 2000 [34] Muhammed Aurangzeb, Studies on the production of raw starch hydrolyzing amylolytic enzymes by various microbes and their use in ethanol fermentation, 1993 [35] Norton Nelson, A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose, 1944 [36] Oboh, G anhd Akindahunsi, A.A., Biochemical changes in casava products (flour and gari) subjected to Saccharomyces cerevisiae solid media fermentation, Food Chemistry, vol 82, p 599-602, 2003 [37] Omemu, A M ; Akpan, I ; Bankole, M O and Teniola, O D , Hydrolysis of raw tuber starches by amylase of Aspergillus niger AM07 isolated from the soil, 2004 [38] Seinosuke Ueda, Celia T Zenin, Domingos A Monteiro, Yong K Park., Production of ethanol from raw cassava starch by a nonconventional fermentation method Biotechnology and Bioengineering 23 (2), p 291-299, 2004 96 [39] Shinsaku Hayashida and Perfecto Q Flor, Raw starch-digestive glucoamylase productivity of protease-less mutant from Aspergillus awamori var kawachi Agric Biol Chem., 45 (12), 2675 - 2681,1981 [40] Shinsaku Hayashida, Yuji Teramoto, and Takehiro Inoue, Production and characteristics of raw–potato–starch–digesting α-amylase from Bacillus subtilis 65, 1988 [41] Srioth, K, Chollakup, R, Chotineeranat, S., Piyachomkwan, K and Oates, C.G, Processing of Cassava Waste for Improved Biomass Utilization, Bioresource Technology, vol 71, p 63-69, 2000 [42] Yusaku Fujio, Puangpen Suyanadona, Poonsook Attasampunna, Seinosuke Ueda., Alcoholic fermentation of raw cassava starch by Rhizopus koji without cooking, Biotechnology and Bioengineering 26 (4), p 315-319, 2004 -1- PHỤ LỤC KẾT QUẢ Đường chuẩn glucose theo phương pháp Somogyi-Nelson Hàm lượng glucose chuẩn (mg/ml) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 OD1 OD2 OD3 Trung bình 0.086 0.080 0.082 0.083 0.144 0.140 0.139 0.141 0.181 0.185 0.182 0.183 0.259 0.261 0.265 0.262 0.432 0.445 0.439 0.439 0.481 0.502 0.546 0.510 0.585 0.526 0.592 0.568 0.665 0.596 0.638 0.633 0.733 0.701 0.738 0.724 Đường chuẩn glucose theo phương pháp DNS Hàm lượng glucose chuẩn (mg/ml) OD1 OD2 Trung bình 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.067 0.081 0.074 0.182 0.183 0.183 0.299 0.285 0.292 0.405 0.406 0.406 0.562 0.548 0.555 Hoạt độ enzym glucoamylase chủng nấm mốc Chủng mốc M1 M2 M3 Thí nghiệm OD-TN OD-ĐC ∆OD Trung bình Trung bình Trung bình 0.417 0.424 0.421 0.447 0.449 0.448 0.700 0.715 0.708 0.031 0.032 0.032 0.036 0.036 0.036 0.057 0.062 0.060 0.386 0.392 0.389 0.411 0.413 0.412 0.643 0.653 0.648 Độ pha loãng 1/50 1/50 1/50 Đường khử tạo thành (mg) 5.45 5.53 5.49 5.80 5.82 5.81 9.00 9.13 9.07 Hoạt độ enzym (UI/g) 30.28 30.74 30.51 32.19 32.35 32.27 49.98 50.75 50.37 Hoạt độ enzym thủy phân tinh bột sống chủng nấm mốc Chủng mốc M1 M2 M3 Thí nghiệm OD-TN OD-ĐC ∆OD Trung bình Trung bình Trung bình 0.514 0.527 0.521 0.437 0.445 0.441 0.535 0.554 0.545 0.043 0.046 0.045 0.039 0.041 0.040 0.047 0.050 0.049 0.471 0.481 0.476 0.398 0.404 0.401 0.488 0.504 0.496 Độ pha loãng 1/6 1/6 1/20 Đường khử tạo thành (mg) 0.79 0.81 0.80 0.67 0.68 0.68 2.74 2.83 2.79 Hoạt độ enzym (UI/g) 4.42 4.51 4.46 3.74 3.80 3.77 15.24 15.73 15.48 -2- Hoạt độ enzym cellulase chủng nấm mốc Chủng mốc Độ pha loãng Hoạt độ enzym (UI/g) Thí nghiệm OD-TN OD-ĐC ∆OD 0.332 0.018 0.314 0.335 0.019 0.316 Trung bình 0.334 0.019 0.315 0.89 0.016 0.011 0.005 0.00 0.013 0.009 0.004 M1 M2 0.89 1/10 0.90 0.00 Trung bình 0.022 0.010 0.012 0.00 0.550 0.051 0.499 2.10 0.560 0.053 0.507 Trung bình 0.555 0.052 0.503 M3 1/15 2.14 2.12 Ảnh hưởng pH đầu đến sinh tổng hợp enzym glucoamylase pH 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 8.0 Đường khử (mg) Hoạt độ enzym (UI/g) 5.451 30.28 5.272 29.29 0.129 5.362 29.79 0.064 0.192 6.235 34.64 0.244 0.059 0.185 6.139 34.10 Trung bình 0.250 0.062 0.189 6.187 34.37 0.436 0.064 0.372 8.710 48.39 8.490 47.17 8.600 47.78 9.508 52.82 9.796 54.42 9.652 53.62 10.773 59.85 10.842 60.23 Thí nghiệm OD-TN OD-ĐC ∆OD 0.188 0.053 0.135 0.179 0.057 0.122 Trung bình 0.184 0.055 0.256 2 0.423 0.067 0.356 Trung bình 0.430 0.066 0.364 0.491 0.061 0.430 Độ pha loãng 1/50 1/50 1/50 1/50 0.508 0.057 0.451 Trung bình 0.500 0.059 0.441 0.579 0.057 0.522 0.578 0.051 0.527 Trung bình 0.579 0.054 0.525 10.807 60.04 0.458 0.054 0.404 9.150 50.83 0.462 0.049 0.413 9.274 51.52 Trung bình 0.460 0.052 0.409 9.212 51.18 0.346 0.052 0.294 7.638 42.43 0.337 0.055 0.282 7.472 41.51 Trung bình 0.342 0.054 0.288 7.555 41.97 1/50 1/50 1/50 -3- Ảnh hưởng pH đầu đến sinh tổng hợp enzym thủy phân tinh bột sống pH 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 8.0 Thí nghiệm OD-TN OD-ĐC ∆OD Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình 0.137 0.142 0.140 0.179 0.171 0.175 0.253 0.246 0.250 0.259 0.253 0.256 0.313 0.306 0.310 0.167 0.174 0.171 0.155 0.144 0.150 0.048 0.049 0.049 0.072 0.068 0.070 0.052 0.059 0.056 0.050 0.047 0.049 0.054 0.055 0.055 0.058 0.061 0.060 0.053 0.049 0.051 0.289 0.293 0.291 0.307 0.303 0.305 0.401 0.387 0.394 0.409 0.406 0.408 0.459 0.451 0.455 0.309 0.313 0.311 0.302 0.295 0.299 Độ pha loãng Đường khử (mg) Hoạt tính enzym (UI/g) 1.239 1.256 1.248 1.751 1.729 1.740 2.836 2.739 2.787 2.891 2.870 2.880 3.234 3.179 3.207 2.203 2.230 2.217 2.155 2.107 2.131 6.88 6.98 6.93 9.73 9.61 9.67 15.75 15.22 15.49 16.06 15.94 16.00 17.97 17.66 17.82 12.24 12.39 12.32 11.97 11.70 11.84 1/15 1/20 1/25 1/25 1/25 1/25 1/25 Ảnh hưởng độ ẩm đầu đến sinh tổng hợp enzym glucoamylase Độ ẩm 45% 50% 55% 60% 65% Thí nghiệm OD-TN OD-ĐC ∆OD Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình 0.520 0.512 0.516 0.628 0.637 0.633 0.701 0.697 0.699 0.658 0.641 0.650 0.597 0.589 0.593 0.1100 0.0980 0.1040 0.1280 0.1160 0.1220 0.1460 0.1380 0.1420 0.1140 0.1040 0.1090 0.1060 0.1040 0.1050 0.410 0.414 0.412 0.500 0.521 0.511 0.555 0.559 0.557 0.544 0.537 0.5406 0.491 0.485 0.488 Độ pha loãng 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 Đường khử (mg) 11.563 11.673 11.618 14.047 14.626 14.337 15.565 15.675 15.620 15.261 15.071 15.166 13.798 13.633 13.716 Hoạt độ enzym (UI/g) 64.24 64.85 64.54 78.04 81.26 79.65 86.47 87.08 86.78 84.78 83.73 84.26 76.66 75.74 76.20 -4- Ảnh hưởng độ ẩm đầu đến sinh tổng hợp enzym thủy phân tinh bột sống Độ ẩm 45% 50% 55% 60% 65% Thí nghiệm OD-TN OD-ĐC ∆OD Độ pha loãng Đường khử (mg) Hoạt độ enzym (UI/g) Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình 0.557 0.549 0.553 0.702 0.692 0.697 0.518 0.505 0.512 0.663 0.657 0.660 0.603 0.597 0.600 0.116 0.121 0.1185 0.148 0.156 0.152 0.175 0.167 0.171 0.17 0.167 0.169 0.158 0.147 0.153 0.441 0.428 0.4345 0.554 0.536 0.545 0.343 0.338 0.341 0.493 0.490 0.492 0.445 0.450 0.448 1/25 1/25 1/25 1/25 1/25 1/25 1/50 1/50 1/50 1/30 1/30 1/30 1/30 1/30 1/30 3.10 3.01 3.06 3.88 3.76 3.82 4.86 4.79 4.82 4.16 4.13 4.14 3.76 3.80 3.78 17.25 16.75 17.00 21.58 20.89 21.23 26.98 26.60 26.79 23.09 22.95 23.02 20.88 21.11 21.00 Ảnh hưởng việc thay cám gạo đến tổng hợp enzym glucoamylase Tỉ lệ thay (%) 10 15 20 30 Thí nghiệm OD-TN OD-ĐC ∆OD Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình 0.603 0.629 0.616 0.692 0.703 0.698 0.715 0.697 0.706 0.713 0.720 0.717 0.714 0.724 0.719 0.708 0.699 0.704 0.067 0.071 0.069 0.083 0.086 0.085 0.088 0.082 0.085 0.091 0.092 0.092 0.089 0.093 0.091 0.087 0.086 0.087 0.536 0.558 0.547 0.609 0.617 0.613 0.627 0.615 0.621 0.622 0.628 0.625 0.625 0.631 0.628 0.621 0.613 0.617 Độ pha loãng 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 1/100 Đường khử (mg) Hoạt độ enzym (UI/g) 15.04 15.65 15.34 17.06 17.28 17.17 17.55 17.22 17.39 17.41 17.58 17.50 17.50 17.66 17.58 17.39 17.17 17.28 83.56 86.93 85.24 94.75 95.98 95.37 97.51 95.67 96.59 96.75 97.67 97.21 97.21 98.13 97.67 96.59 95.37 95.98 -5Ảnh hưởng việc thay cám gạo đến tổng hợp enzym thủy phân tinh bột sống Tỉ lệ thay (%) 10 15 20 30 Thí nghiệm OD-TN OD-ĐC ∆OD Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình 0.401 0.383 0.392 0.461 0.458 0.460 0.469 0.465 0.467 0.471 0.467 0.469 0.481 0.472 0.477 0.474 0.467 0.471 0.043 0.039 0.041 0.048 0.047 0.048 0.049 0.051 0.050 0.053 0.053 0.053 0.058 0.055 0.057 0.058 0.057 0.058 0.358 0.344 0.351 0.413 0.411 0.412 0.420 0.414 0.417 0.418 0.414 0.416 0.423 0.417 0.420 0.416 0.410 0.413 Độ pha loãng 1/50 1/50 1/50 1/50 1/50 1/50 Đường khử (mg) Hoạt độ enzym (UI/g) 5.06 4.87 4.97 5.82 5.80 5.81 5.92 5.84 5.88 5.89 5.84 5.86 5.96 5.88 5.92 5.86 5.78 5.82 28.13 27.06 27.59 32.35 32.19 32.27 32.88 32.42 32.65 32.73 32.42 32.58 33.11 32.65 32.85 32.58 32.12 32.35 Ảnh hưởng việc bổ sung chất cảm ứng Tỉ lệ bổ sung (%) 10 Thí nghiệm OD-TN OD-ĐC ∆OD Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình 0.452 0.431 0.442 0.503 0.491 0.497 0.577 0.552 0.565 0.570 0.568 0.569 0.586 0.572 0.579 0.599 0.586 0.593 0.037 0.032 0.035 0.041 0.039 0.040 0.056 0.049 0.053 0.052 0.052 0.052 0.057 0.055 0.056 0.063 0.062 0.063 0.415 0.399 0.407 0.462 0.452 0.457 0.521 0.503 0.512 0.518 0.516 0.517 0.529 0.517 0.523 0.536 0.524 0.530 Độ pha loãng 1/50 1/50 1/50 1/50 1/50 1/50 Đường khử (mg) Hoạt độ enzym (UI/g) 5.85 5.63 5.74 6.50 6.36 6.43 7.31 7.06 7.19 7.27 7.24 7.26 7.42 7.26 7.34 7.52 7.35 7.44 32.50 31.27 31.89 36.11 35.34 35.72 40.63 39.25 39.94 40.40 40.25 40.32 41.24 40.32 40.78 41.78 40.86 41.32 -6- Ảnh hưởng thời gian đến việc thu nhận glucoamylase Thời gian (h) 24 48 72 96 120 144 Thí nghiệm OD-TN OD-ĐC ∆OD Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình 0.448 0.447 0.448 0.562 0.552 0.557 0.646 0.634 0.640 0.598 0.591 0.595 0.734 0.719 0.727 0.607 0.596 0.602 0.031 0.032 0.032 0.042 0.038 0.040 0.051 0.047 0.049 0.047 0.044 0.046 0.056 0.053 0.055 0.049 0.048 0.049 0.417 0.415 0.416 0.520 0.514 0.517 0.595 0.587 0.591 0.551 0.547 0.549 0.678 0.666 0.672 0.558 0.548 0.553 Độ pha loãng 1/4 1/20 1/50 1/100 1/100 1/100 Đường khử (mg) 0.47 0.47 0.47 2.92 2.89 2.90 8.33 8.22 8.28 15.45 15.34 15.40 18.96 18.63 18.79 15.65 15.37 15.51 Hoạt độ enzym (UI/g) 2.61 2.60 2.61 16.22 16.04 16.13 46.30 45.69 46.00 85.86 85.24 85.55 105.33 103.49 104.41 86.93 85.40 86.16 Ảnh hưởng thời gian đến việc thu nhận enzym thủy phân tinh bột sống Thời gian (h) 24 48 72 96 120 144 Thí nghiệm OD-TN OD-ĐC ∆OD Trung bình Trung bình Trung bình 0.565 0.546 0.556 0.439 0.419 0.429 0.639 0.624 0.632 0.549 0.539 0.044 0.037 0.041 0.033 0.031 0.032 0.058 0.053 0.056 0.043 0.041 0.521 0.509 0.515 0.406 0.388 0.397 0.581 0.571 0.576 0.506 0.498 Đường khử (mg) Hoạt độ enzym (UI/g) 1/50 0.29 0.29 0.29 1.15 1.10 1.12 4.88 4.80 4.84 7.11 7.00 1.63 1.59 1.61 6.36 6.09 6.22 27.14 26.68 26.91 39.48 38.87 1/50 Độ pha lỗng 1/2 1/10 1/30 Trung bình 0.544 0.042 0.502 7.05 39.17 0.658 0.643 0.066 0.059 0.592 0.584 8.29 8.18 46.07 45.46 Trung bình 0.651 0.063 0.588 8.24 45.77 0.604 0.591 0.053 0.052 0.551 0.539 7.73 7.56 42.93 42.01 Trung bình 0.598 0.053 0.545 7.64 42.47 1/50 -7Khảo sát tỉ lệ bã khoai mì khơ nước Tỉ lệ 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 Thí nghiệm OD Đường khử* (mg/ml) Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình 0.103 0.109 0.106 0.211 0.207 0.209 0.249 0.259 0.254 0.217 0.223 0.220 0.167 0.181 0.174 3.57 3.71 3.64 6.03 5.94 5.99 6.90 7.12 7.01 6.17 6.30 6.24 5.03 5.35 5.19 Khảo sát tỉ lệ bã khoai mì ướt nước Tỉ lệ Thí nghiệm OD Đường khử* (mg/ml) Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình 0.149 0.137 0.143 0.237 0.245 0.241 0.267 0.252 0.260 0.218 0.221 0.220 0.197 4.62 4.35 4.48 6.62 6.81 6.71 7.31 6.97 7.14 6.19 6.26 6.22 5.71 Trung bình 0.184 0.191 5.42 5.56 1:1 1:2 1:2.5 1:3 1:3.5 Khảo sát nguồn tinh bột sống khác Tin bột sống Bột gạo Bột mì Bột bắp Tinh bột tan * : Độ pha lỗng 1/27 Thí nghiệm OD Đường khử* (mg/ml) 0.184 5.42 0.189 5.53 Trung bình 0.1865 5.47 0.242 6.74 0.234 6.56 Trung bình 0.238 6.65 0.19 5.55 0.186 5.46 Trung bình 0.188 5.51 0.217 6.17 0.217 6.17 Trung bình 0.217 6.17 -8- Khảo sát tỉ lệ giống bổ sung lượng đường khử tạo thành theo thời gian Thời gian (h) Tỉ lệ bổ sung (%) 10 12 14 Độ pha loãng 1/8 1/6 1/10 1/10 1/12 1/12 OD1 0.223 0.214 0.281 0.257 0.352 0.413 OD2 0.235 0.208 0.283 0.253 0.344 0.397 Trung bình 0.228 0.411 0.282 0.355 0.348 0.405 Đường khử (mg/ml) 1.90 2.35 2.83 3.45 4.07 4.65 Độ pha loãng 1/18 OD1 0.113 0.167 0.189 0.198 0.227 0.283 OD2 0.119 0.155 0.185 0.204 0.229 0.267 Trung bình 0.116 0.161 0.187 0.201 0.228 0.275 Đường khử (mg/ml) 2.58 3.26 3.66 3.87 4.28 4.99 Độ pha loãng 1/22 OD1 0.213 0.245 0.269 0.290 0.325 0.418 OD2 0.211 0.237 0.283 0.290 0.323 0.406 Trung bình 0.212 0.242 0.276 0.29 0.324 0.412 Đường khử (mg/ml) 4.93 5.49 6.12 6.38 7.01 8.65 Độ pha loãng 12 1/27 OD1 0.179 0.194 0.253 0.272 0.295 0.356 OD2 0.185 0.200 0.251 0.286 0.303 0.374 Trung bình 0.182 0.197 0.252 0.279 0.299 0.365 Đường khử (mg/ml) 5.37 5.71 6.97 7.58 8.04 9.54 OD1 0.232 0.247 0.306 0.314 0.319 0.353 OD2 0.238 0.261 0.308 0.322 0.337 0.365 Trung bình 0.235 0.254 0.307 0.318 0.328 0.359 Đường khử (mg/ml) 6.58 7.01 8.22 8.47 8.70 9.40 Độ pha loãng 15 1/27 Độ pha loãng 18 1/27 OD1 0.241 0.255 0.307 0.315 0.316 0.346 OD2 0.249 0.261 0.317 0.327 0.328 0.352 Trung bình 0.245 0.258 0.312 0.321 0.322 0.349 Đường khử (mg/ml) 6.81 7.10 8.33 8.54 8.56 9.18 Độ pha loãng 22 1/27 OD1 0.254 0.258 0.309 0.311 0.313 0.321 OD2 0.256 0.264 0.319 0.329 0.321 0.335 Trung bình 0.255 0.261 0.314 0.32 0.317 0.328 Đường khử (mg/ml) 7.03 7.17 8.38 8.51 8.45 8.70 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Trần Thị Trúc Thanh Ngày, tháng , năm sinh: 24/08/1983 Nơi sinh: Tây Ninh Địa liên lạc: 59 Tỉnh lộ 6–Khu phố Gia Huỳnh–Thị Trấn–Trảng Bàng–Tây Ninh QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO 2001 – 2005: Học Đại học chuyên ngành Công nghệ sinh học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh 9/2006 – 7/2008: Học tiếng Nhật theo chương trình Học bổng Nhật ngữ GHS trường Ngơn ngữ Sài Gịn 2006 – 2008: Học Cao học chuyên ngành Công nghệ sinh học trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh ... 31 Nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật có khả thủy phân tinh bột sống α-Αmylase từ số vi khuẩn thủy phân tinh bột sống Amylase từ chủng Lactobacillus amylovorus hấp phụ lên bề mặt hạt tinh bột. .. vi sinh vật có khả tổng hợp enzym GVHD: PGS TS Nguyễn Đức Lượng HVTH: Trần Thị Trúc Thanh 40 Nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật có khả thủy phân tinh bột sống amylase Những chủng vi sinh vật. .. Phân lập, làm vi sinh vật có khả thuỷ phân tinh bột sống - Khảo sát hoạt tính enzym α-amylase, glucoamylase, enzym thuỷ phân tinh bột sống, enzym cellulase; chọn chủng có khả thủy phân tinh bột