trong mẫu thử bằng chuẩn oleanolic nguyên liệu, song song với chuẩn đối chiếu bằng phƣơng pháp UV-VIS và HPLC.
Hiện nay, trên thị trường đã có nhiều sản phẩm dược có tác dụng hạ cholesterol, hạ huyết áp cho người huyết áp cao, sản phẩm ngày càng đa dạng và phong phú. Đa số là dạng nam dược được bào chế từ cao ngưu tất.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng quy trình phân tích acid oleanolic trong viên cao ngưu tất để tiến hành xác định hàm lượng acid oleanolic có trong những mẫu nam dược này, song song với chuẩn đối chiếu mua về.
- Xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic
- Thẩm định phương pháp phân tích từ mẫu thử bằng chuẩn acid oleanolic nguyên liệu, song song với chuẩn mua về.
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Kết quả chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngƣu tất
Tối ƣu các thông số trong quá trình chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngƣu tất
Điều kiện sắc ký bản mỏng:
Dung môi chạy sắc ký: (cloroform: methanol) ( 40:1) Bản mỏng silicagel 60 GF 254.
Thuốc thử phun màu: dung dịch acid phosphomolybdic 5% trong ethanol
Nhiệt độ lên màu: 120 oC
3.1.1 Chiết cao ngƣu tất
Kết quả chiết cao với ethanol tuyệt đối, ethanol 96 % và ethanol 70 %. Thực hiện: cân 3 bình khối lượng bằng nhau, tiến hành chiết tách đồng thời và cùng các điều kiện.
Kết quả sắc ký bản mỏng:
A S B C
Hình 4. Kết quả khảo sát dung môi chiết
Từ trái qua phải, kết quả cho thấy ethanol 70 % cho vệt sắc kí đậm hơn rất nhiều, và số vệt sắc kí ở cả ba dạng khảo sát là bằng nhau. Rõ ràng, phần trăm nước càng nhiều, độ phân cực của dung môi chiết càng tăng, năng suất chiết cao tăng. Tuy nhiên theo các tài liệu tham khảo, quy trình khảo sát ethanol ở 100 %, 96% và 70 %. Ngoài ra, với hàm lượng nước lớn sẽ gây khó khăn trong việc cô cạn dung môi, và có
A: ethanol 100% B: ethanol 96 % C: ethanol 70 %
thể gây ẩm mốc rất nhanh. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát ở ba dung môi trên. Sắc kí đồ cho thấy, ethanol 70 % cho vệt rất đậm, và vệt khá rõ ràng. Cho nên chúng tôi chọn ethanol 70 % làm dung môi chiết xuất cao ngưu tất.
3.1.2 Kết quả thủy phân saponin trong cao ngƣu tất cho ra sapogenin
Khảo sát môi trường acid dùng để thủy phân: acid hydrochlorid và acid sulfuric.
Hình 5. Kết quả khảo sát acid sử dụng thủy phân saponin toàn phần Trong quá trình tách chiết acid oleanolic từ dịch thủy phân, với tác nhân thực hiện phản ứng thủy phân là acid sulfuric thì sự tạo nhũ lớn gây bất lợi cho việc lôi kéo acid oleanolic ra khỏi dung dịch thủy phân.
Do đó, chúng tôi chọn HCl để thủy phân sapogenin
Khảo sát nồng độ acid HCl: HCl 10 %, HCl 15 %, HCl 20 %
Hình 6. Kết quả khảo sát nồng độ acid
HCl S H2SO4 S: chuẩn oleanolic H1: HCl 10% H2: HCl 20% H3: HCl 15% H1 S H2 H3 S: chuẩn oleanolic
Kết quả cho thấy, HCl 15 % và HCl 20 % cho hàm lượng acid oleanolic nhiều tương đương nhau. Và ở kết quả sắc kí của thí nghiệm sử dụng HCl 20 % đã xuất hiện thêm một vệt tạp, vì thế, để tiết kiệm acid HCl, cũng như giảm độ độc hại với môi trường, chúng tôi quyết định chọn HCl 15% trong quá trình nghiện cứu, và tiến hành tối ưu phản ứng trên thông số nhiệt độ và thời gian.
Khảo sát nhiệt độ thủy phân: 80 oC, 90 oC và 100 oC trên bếp cách thủy
Hình 7. Kết quả khảo sát nhiệt độ thủy phân
Với HCl 15 %, kết quả khảo sát ở nhiệt độ 100 oC trên bếp cách thủy cho hàm lượng acid oleanolic nhiều hơn, và đây cũng là nhiệt độ cài đặt tối đa của bếp cách thủy mà chúng tôi sử dụng nghiên cứu, do đó, chúng tôi chọn 100 o
C làm nhiệt độ thực hiện phản ứng thủy phân.
Khảo sát thời gian thủy phân: 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ.
S: chuẩn acid oleanolic
T1: Nhiệt độ thủy phân là 80 oC
T2: Nhiệt độ thủy phân là 90 oC
T3: Nhiệt độ thủy phân là 100 oC
S: chuẩn oleanolic
G1: phản ứng thủy phân diễn ra trong 1 giờ
G2: phản ứng thủy phân diễn ra trong 2 giờ
G3: phản ứng thủy phân diễn ra trong 3 giờ
T1 S T2 T3
Hình 8: Kết quả khảo sát thời gian thủy phân.
Kết quả cho phép chọn thời gian 2 giờ là thích hợp nhất, vì với thời gian phản ứng 1 giờ thì cho hàm lượng acid oleanolic ít, mà với thời gian 3 giờ thì hàm lượng acid oleanolic không tăng so với 2 giờ. Vậy, để tiết kiệm thời gian, chúng tôi chọn thời lượng cho phản ứng thủy phân là 2 giờ
3.1.3 Kết quả chiết sapogenin toàn phần từ dịch thủy phân
Sau khi thực hiện phản ứng thủy phân saponin, chúng tôi tiến hành chiết xuất sapogenin toàn phần bằng dung môi methylen cloric. Sau đó, cho cô quay chân không đến cắn và kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trước khi cho qua cột silicagel để tách phân đoạn acid oleanolic. Dịch chiết methylen cloric luôn cho 3 vệt tách khá xa nhau trên sắc kí đồ, trong đó có một vệt tương đương giá trị Rf với chuẩn, một cho giá trị lớn hơn và một vệt cho giá trị nhỏ hơn. Chứng tỏ rằng, trong cắn methylen cloric thu được có sự tồn tại của ba hoạt chất, có độ phân cực khác nhau, trong đó có acid oleanolic, là chất có độ phân cực trung bình so với hai chất còn lại. Nhiệm vụ chúng tôi đặt ra là phải tách được riêng biệt ba chất này, thu gom acid oleanolic.
3.1.4 Kết quả phân tách cắn acid oleanolic thô từ sapogenin toàn phần
Tách phân đoạn chứa acid oleanolic bằng sắc kí cột silicagel 60 GF, kích thước 63-200 µm. Thể tích cho một phân đoạn là 10 ml, các phân đoạn được hứng và kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng.
Sau khi qua cột, chúng tôi thu được 9 phân đoạn như sau:
Hình 9. Kết quả kiểm tra các phân đoạn thu được
S: chuẩn oleanolic
Dựa vào những phân đoạn cho vệt sắc kí tương đương Rf với vệt của chuẩn, từ đó chúng tôi thu gom tất cả những phân đoạn chứa acid oleanolic. Trong thí nghiệm minh họa này, acid oleanolic chỉ có trong phân đoạn 5 và 6, nên chúng tôi thu gom phân đoạn 5 và 6, cho bay hơi. Hợp chất thu được chúng tôi đặt tên là NL1
=> Tóm tắt quá trình chiết xuất acid oleanolic từ rễ ngƣu tất: Dung môi chiết cao ngưu tất: ethanol 70 %
Acid sử dụng thủy phân saponin thành sapogenin: acid hydrocloric 15%
Điều kiện thủy phân: nhiệt độ 100 o
C, trong thời gian 2 giờ.
Hình 10. Quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất. Hiệu suất chiết:
Bảng 2. Hiệu suất chiết acid oleanolic từ cao và dược liệu rễ cây ngưu tất
Rễ ngưu tất Cao cồn Cao CH2Cl2 Acid oleanolic Khối lượng (g) 100.5 18.95 0.1398 0.0949 Hiệu suất (%) 18.86 0.738 67.85
Hàm lượng acid oleanolic trong cao cồn: 0.5 % Hàm lượng acid oleanolic trong rễ ngưu tất: 0.094 %
Quy trình chiết này tiêu tốn số lượng dung môi và hóa chất như sau: 500 ml ethanol 70 %, 130 ml HCl 15 %, 400 ml methylene chloric, 25 g bột silicagel, 250 ml chloroform, 50 ml methanol.
3.2 Kết quả tinh chế, định danh và đánh giá acid oleanolic nguyên liệu
thu đƣợc song song với chuẩn đối chiếu
3.2.1 Kết quả tinh chế và định danh acid oleanolic
Kết tinh cắn acid oleanolic thu được sau khi chạy qua sắc kí cột
Sử dụng một lượng methanol vừa đủ, hòa tan cắn acid oleanolic, thêm một ít bột than hoạt tính và tiến hành lọc qua giấy lọc, để bay hơi tự nhiên, thu được hợp chất NL1 có dạng hình kim, màu trắng. Thực hiện nhiều lần để có độ sạch cao.
T1 S T2
Hình 11. Kết quả chấm sắc kí của NL1 với chuẩn acid oleanolic
Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NL1
Hợp chất NL1 kết tinh lại từ các phân đoạn 5 và 6 , có đặc điểm sau: T1: Thử NL1
S: Chuẩn acid oleanolic
Dạng bột trắng.
Điểm nóng chảy: 310.8 oC (phụ lục 01)
Sắc ký lớp mỏng cho một vết duy nhất ở Rf = 0.6 trong hệ dung môi (cloroform: methanol) (40:1), phun thuốc thử hiện hình dung dịch acid phosphormolybdic 5 % trong ethanol 96 %, nung nóng bản cho vết màu đen (hình 11).
Kết quả phổ UV-VIS [phụ lục 02]
Thiết bị sử dụng: máy đo quang phổ UV-VIS shimadzu UV- 2540 Chuẩn: cân chính xác khoảng 5.7 mg vào bình định mức 25 ml, hòa tan và định mức bằng methanol.
Nguyên liệu: cân chính xác khoảng 5.7mg vào bình định mức 25 ml, hòa tan và định mức bằng methanol.
Trắng: dung môi hòa tan, methanol.
Tiến hành quét phổ cho mẫu trắng, chuẩn và thử ở dãy bước sóng từ 190 – 350 nm
Kết quả: chuẩn và thử cho dãy phổ hấp thu trùng khớp, với ba bước sóng cực đại gồm 250.50 nm; 242.0 nm; và bước sóng chính là 207 nm.
Định tính bằng phổ IR [phụ lục 03]
Thiết bị sử dụng: máy đo phổ hồng ngoại Nicolet Sử dụng kỹ thuật dập viên KBr
Chuẩn: sử dụng một lượng nhỏ, tiến hành dập viên KBr, đo phổ IR.
Nguyên liệu: sử dụng một lượng nhỏ tương ứng với chuẩn, dập viên KBr và đo phổ IR.
Kết quả: phổ IR của chuẩn và thử tương đương nhau.
Phổ hấp thu IR của acid oleanolic đặc trưng bởi nhóm chức sau:
STT Nhóm chức Δ (cm-1
) Ghi chú
1 OH 3486 1 mũi hơi bầu
3 C=O 1698
4 C-O 1048
5 CH3 1376
6 -HC=CR 1000
Kết quả phân tích số khối [phụ lục 04]: 456.7; công thức phân tử: C30H48O3
Kết quả chạy phổ MNR [phụ lục 05, 06, 07, 08, 09, 10]. Độ dịch chuyển hóa học được trình bày trong bảng 3
Cân khoảng 20 mg nguyên liệu đóng gói cẩn thận gửi chạy phổ NMR Nơi gửi mẫu: phòng MNR_ Viện Hóa học/ Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, cầu Giấy Hà Nội. Mẫu: acid oleanolic
Dung môi: DMSO-d6
Máy : 500 MHz
Biện luận cấu trúc
Hợp chất NL1 có dạng tinh thể màu trắng, tan trong dung môi CHCl3, methanol. 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 21 20 19 30 29 24 23 HO 26 28 OH O 27 25 Hình 12. Cấu trúc của hợp chất NL1
Phổ proton (phụ lục 05) của hợp chất NL1 cho thấy ở vùng trường thấp xuất hiện các tín hiệu của 1 proton olefin [δH 5.15(1H;
mũi đơn, H-12)], tín hiệu một proton carbinol [δH 3.0 (1H; m; H-3)]. Ở vùng trường cao có các tín hiệu của 7 nhóm metyl [δH 0.67 (3H; s; H- 24)], [δH 0.71 (3H; s; H-26)], [δH 0.85 (3H; s; H-25)], [δH 0.87 (6H; s; H-29+30)], [δH 0.89 (3H; s; H-23)] và [δH 1.09 (3H; s; H-27)], cùng các proton metin và metylen có độ dịch chuyển hóa học từ 0.68 đến 2.7 ppm (bảng 3). Đây là những tín hiệu đặc trưng của triterpen có khung sườn olean.
Phổ 13C-NMR (phụ lục 06) và kết quả phổ DEPT 90, DEPT 135 (phụ lục 07) cho thấy hợp chất NL1 có 30 tín hiệu carbon. Ở vùng trường thấp có 1 carbon carbonyl của nhóm acid [δC 178.5; C-28], 1 carbon olefin tứ cấp [δC 144.37; C-13], 1 carbon olefin tam cấp [δC 121.26; C-12], 1 carbon carbinol tam cấp [δC 78.0; C-3]. Ở vùng trường cao có 7 carbon metyl [δC 15.07 ; C-25], [δC 15.98 ; C-24], [δC 16.83 ; C-26], [δC 23.34 ; C-30], [δC 25.57 ; C-27], [δC 28.21 ; C-23], [δC 32.80 ; C-29]; 10 carbon metylen [δC 18.0 ; C-6], [δC 22.6 ; C-11], [δC 22.9 ; C-16], [δC 26.9 ; C-2], [δC 27.2 ; C-15], [δC 32.08 ; C-22], [δC 32.41 ; C-7], [δC 33.31 ; C-21], [δC 38.06 ; C-1] và [δC 45.44 ; C- 19]; 3 carbon metin [δC 40.8 ; C-18], [δC 47.08 ; C-9] và [δC 54.8 ; C- 5]; 6 carbon sp3 tứ cấp [δC 30.35 ; C-20], [δC 36.6 ; C-10], [δC 38.36 ; C-4], [δC 38.87; C-8], [δC 41.3; C-14] và [δC 45.7; C-17] (bảng 3).
Các dữ liệu phổ NMR cho thấy hợp chất NL1 có cấu trúc của một triterpen khung olean. Phân tích phổ H-H COSY (phụ lục 09), HSQC (phụ lục 08) và HMBC (phụ lục 10) cho thấy hợp chất này có 1 nhóm hydroxyl ở vị trí C-3, 1 nhóm acid ở vị trí C-28, 7 nhóm metyl ở các vị trí C-23, C-24, C-25, C-26, C-27, C-29 và C-30 (hình 13).
2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 21 20 19 HO 24 23 25 26 27 29 30 COOH 28
Hình 13. Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (đường kẻ đậm) của
hợp chất NL1.
Kết hợp dữ liệu phổ 1 chiều và 2 chiều của phổ NMR cho phép khẳng định hợp chất NL1 đúng là acid oleanolic. Tiến hành so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất NL1 với hợp chất acid oleanolic cho thấy có sự trùng khớp [22] (bảng 3).
Bảng 3. Dữ liệu phổ của hợp chất NL1 và acid oleanolic trong dung môi DMSO-d6 Vị trí Loại carbon Hợp chất NL Acid oleanolic [22] δH (J/Hz) δC δH (J/Hz) δC 1 -CH2- 0.91 s 1.45 m 38.0 0.87 m 1.44 m 37.8 2 -CH2- 1.48 m 1.47 m 26.9 1.46 m 1.45 m 26.8 3 >CH-OH 2.98 m 76.8 2.99 m 76.7 4 >C< 38.4 39.1 5 >CH- 0.68 s 54.8 0.68 s 54.6 6 -CH2- 1.34 m 1.14 m 18.0 1.34 m 1.14 m 17.9 7 -CH2- 1.58 m 32.4 1.6 m 31.9 8 >C< 38.9 39.1 9 >CH- 1.48 m 47.0 1.49 m 46.8 10 >C< 36.6 37.2 11 -CH2- 1.8 m 22.6 1.8 m 22.6 12 =CH- 5.15 s 121.5 5.15 s 121.4 13 =C< 143.8 144.3
14 >C< 41.3 39.6 15 -CH2- 1.63 m 27.1 1.64 26.9 16 -CH2- 1.9 m 22.8 1.9 m 22.5 17 >C< 45.7 46.0 18 >CH- 2.7 dd (3.5, 13.5) 40.8 2.7 dd 40.5 19 -CH2- 1.03 m 45.4 1.04 m 45.4 20 >C< 30.4 30.8 21 -CH2- 1.43 m 1.31 m 33.3 1.43 m 1.31 m 33.2 22 -CH2- 1.42 m 1.22 m 32.1 1.41 m 1.23 m 32.1 23 -CH3 0.89 s 28.2 0.89 s 28.1 24 -CH3 0.67 s 15.9 0.67 s 15.9 25 -CH3 0.85 s 15.0 0.85 s 14.9 26 -CH3 0.71 s 16.8 0.72 s 16.6 27 -CH3 1.08 s 25.6 1.09 s 25.4 28 -COOH 178.5 179.3 29 -CH3 0.87 s 32.8 0.87 s 32.5 30 -CH3 0.87 s 23.3 0.87 s 23.2
3.2.2 Đánh giá acid oleanolic nguyên liệu thu đƣợc song song với chuẩn
đối chiếu
3.2.2.1 Định tính
Sắc kí lớp mỏng: chuẩn và thử cho vệt sắc kí tương đương có Rf = 0.6
Phổ IR: phổ IR của thử tương đương với chuẩn
Định tính dựa trên thời gian lƣu chuẩn, thử chạy bằng HPLC/ PDA
Số Thời gian lƣu của Thời gian lƣu của
TT mẫu chuẩn mẫu thử
1 10.43 RSD= 10.44 RSD=
2 10.36 0.38 10.35 0.51
3 10.36 10.35
TB 10.38 10.38
Thời gian lưu của chuẩn và thử gần như trùng khớp.
Tiêu chuẩn chấp nhận: Độ lệch chuẩn của thời gian lưu của chuẩn với thử không quá 2%
Kết quả định tính acid oleanolic nguyên liệu bằng sắc kí lớp mỏng, kết quả đo phổ IR, thời gian lưu trên sắc kí đồ HPLC, cho thấy nguyên liệu tinh chế được đúng thực acid oleanolic.
3.2.2.3 Định lƣợng
Phân tích phƣơng sai nhiệt DSC xác định điểm chảy và độ tính khiết của nguyên liệu acid oleanolic [phụ lục 02]
Thiết bị sử dụng: máy phân tích nhiệt DSC Q 20, TA
Cân một lượng nguyên liệu chính xác khoảng 1.5 mg (thực nghiệm cân 1.34 mg), cho vào cell đo, và đưa vào hệ thống phân tích nhiệt.
Kết quả cho nhiệt độ nóng chảy của acid oleanolic nguyên liệu là 310.88 oC Độ tinh khiết phân tích được là 98.65 %
Kết quả định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC/PDA
Điều kiện sử dụng thiết bị:
Thiết bị: máy sắc kí lỏng shimadzu UFLC 20 AD Cột sử dụng: Eurospher C18 (250x4.6 mm; 5 μm) PDA: 215 nm
Pha động: MeOH: Đệm kali dihydrophospat 0.03 M, pH =2.8 (86:14) Tốc độ dòng: 1.0 ml/ phút
Thể tích tiêm: 10 μl
Những điều kiện trên đây được tham khảo từ tài liệu [21], sau đó chúng tôi thay đổi tỷ lệ pha động cũng như bước sóng đo cho phù hợp với điều kiện thực nghiệm.
Bảng 4. Kết quả định lượng acid oleanolic nguyên liệu bằng phương pháp HPLC
Định lƣợng
Mẫu chuẩn: Acid oleanolic
Nguồn/Sốlô:
ALDRICH SIGMA 508-02-1/05504
HLN.T: 99% Hệ số qui đổi từ dạng
muối sang dạng bazơ: 1
Lƣợng cân (mg ) Chuẩn 1 11.28 Chuẩn 2 11.25 Stt (Chuẩn) Lấy (ml) Pha (ml)
Nồng độ pha loãng của chuẩn 1: 0.22334 1 50
Nồng độ pha loãng của chuẩn 2: 0.22275 2 1 1
Lƣợng cân mẫu thử : HL nước% 3 1 1