1.Tổng quan về Bacteriocin Bacteriocin là chất kháng khuẩn của protein được riboxom tổng hợp từ pepetit hay protein của vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương.Bacteriocin của vi khuẩn nào tiết ra thì có khả năng chống lại Bacteriocin đó.Có tác dụng kháng khuẩn đối với vi khuẩn gây thối rửa và các vi khuẩn trong thực phẩm phổ biến là vi khuẩn Listeria monocytogenes, staphylococus auriusĐể tránh nhầm lẫn với thuốc y học, Bacteriocin không được gọi là “antibiotic”Những tác nhân kháng khuẩn này là phân tử polipepetit với đặc hiệu hoạt động hẹp chống lại chuổi dòng chủng tương tự hoặc giống.a.Phân loại•Nhóm I: Lantibiotic (klpt 950 CpH của sữa: >6pH của nước chua: 44,5pH của nước chua có ý nghĩa rất quan trọng trong việc kết tủa.Nếu pH cao thì lượng nước chua phải sử dụng nhiều, nếu pH thấp thì hiệu xuất thu hồi đạm thấp.Khi dịch sữa đạt 950 C ta cho nước chua từ từ vào (15).Quá trình này chia làm 3 giai đoạn:Giai đoạn đầu cho ½ lượng nước chuaSau 3 phút cho lượng còn lại.Vừa cho vừa khấy đều và nhẹ.Khi thấy nhiều hoa bông kết tủa xuất hiện thì không nên cho thêm nước chua nữa.
Trang 1MỤC LỤC:
I. Tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh Bacteriocin
1.Tổng quan về Bacteriocin
2.Tổng quan vi khuẩn lactic
3 Phân lập vi khuẩn
4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic
5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
II Ứng dụng sản xuất và bảo quản đậu phụ
1. Sơ đồ sản xuất đậu phụ bằng nước dưa chua theo kiểu truyền thống
2. Trong tương lai, có thể sử dụng chế phẩm sinh học để sản xuất đậu phụ hay không?
TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC SINH
BACTERIOCIN TỪ NƯỚC DƯA ĐỂ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT
VÀ BẢO QUẢN ĐẬU PHỤ
I Tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh Bacteriocin
1.Tổng quan về Bacteriocin
Trang 2Bacteriocin là chất kháng khuẩn của protein được riboxom tổng hợp từ pepetit hay protein của vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương.Bacteriocin của vi khuẩn nào tiết ra thì có khả năng chống lại Bacteriocin đó.Có tác dụng kháng khuẩn đối với vi khuẩn gây thối rửa và các vi khuẩn trong thực phẩm phổ biến là
vi khuẩn Listeria monocytogenes, staphylococus aurius
Để tránh nhầm lẫn với thuốc y học, Bacteriocin không được gọi là “antibiotic” Những tác nhân kháng khuẩn này là phân tử polipepetit với đặc hiệu hoạt động hẹp chống lại chuổi dòng chủng tương tự hoặc giống
a. Phân loại
• Nhóm I: Lantibiotic (klpt <5Kda)
Những Bacteriocin này nhóm không đồng nhất của hợp chất liên quan tới khối lượng phân tử, cấu trúc và cơ chế hoạt động Dựa trên cấu trúc hóa học và cơ chế kháng khuẩn , lớp I sâu hơn dược chia làm 2 loại A và B Lantibiotic
• Nhóm II: Đoạn peptet bền nhiệt nhỏ (klpt<10Kda)
Những Bacteriocin này tổng hợp bởi ribosom như tiền peptit chưa kích hoạt Bền nhiệt có điện tích dương
Hiệu lực hoạt động kháng khuẩn là đặc tính chung của nhóm Bacteriocin này
• Nhóm III: Protein lớn không bền nhiệt
Lớp Bacteriocin này chưa đặc trưng Protein lớn (30Kda), kém bền nhiệt, có cấu trúc domain
• Nhóm IV: Protein phức tạp
Nhóm này chứa đồng thời glycoprotein hoặc lipoprotein yêu cầu những nửa nonprotein cho hoạt động kháng khuẩn Plantaricin Scuxng thuộc về nhóm IV bacteriocin
Nhóm này chưa đặc trưng đầy đủ ở cấp độ sinh hóa,
b. Một số tính chất của Bacteriocin
• Độ bền nhiệt
Một số nghiên cứu cho thấy các loại Bacteriocin có khả năng chịu nhiệt khác nhau Nó phụ thuộc vào cấu trúc phân tử của Bacteriocin
• Độ bền pH
Một số Bacteriocin có thể hoạt động tốt dưới nhửng khoảng pH nhất định.Nó dựa vào bản chất thần phần cấu trúc của Bacteriocin đó.Rất quan trọng trong quá trình bảo quản nguyên liệ thực phẩm Tùy vào trạng thái, nhiệt độ thực phẩm mà chúng ta có thể lựa chọn loại Bacteriocin bổ sung vào sao cho phù hợp với mục đích sản xuất
• Độ bền vói Enzym
Trang 3Mỗi loại Bacteriocin có thành phần cấu trúc các amino acid khác nhau nên
sẽ chịu sự phân cắt đặc hiệu của các enzym khác nhau, thích hợp với nó.Khi bị phân cắt bởi các enzym này sẽ khiến Bacteriocin mất đi hoạt tính kháng khuẩn.Đồng thời, đây cũng là dấu hiệu để ta nhận biết có phải Bacteriocin không
c. Quá trình tác động của Bacteriocin có thể chia làm 2 giai đoạn
• Giai đoạn 1: Bacteriocin hấp thụ lên bề mặt tế bào vi khuẩn nhờ vào các thụ thể trên bề mặt.Giai đoạn này chưa có tác động tích cực trong việc tiêu diệt vi khuẩn
• Giai đoạn 2: bacteriocin tạo ra các kênh để xâm nhập vào bên trong màng nguyên sinh hoặc có thể chúng tác động trực tiếp lên thành peptidoglican
2 Tổng quan vi khuẩn lactic
Acid lactic lần đầu tiên được phát hiện ra từ sữa bò lên men chua bởi nhà toán học Thụy Điển Carl Scheele năm 1780 và được gọi là acid sữa, có công thức hóa học C3H6O3
Năm 1857 Louis Pasteur lần đầu tiên đã chứng minh được rằng việc làm chua sữa bò là do nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic
Năm 1878 Josph Lister lần đầu tiên phân lập được một loại vi khuẩn lactic
đặt tên là Bacterium lactis ( hiện nay gọi là Streptococcus lactis ) Từ đó đến nay
niều loài vi khuẩn lactic khác nhau đã được phân lập và nghiên cứu
Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriacae Mặc dù nhóm vi
khuẩn nay không đồng nhất về hình thái (vi khuẩn dạng que ngắn, que dài lẫn vi khuẩn hình cầu) song về mặt sinh lý chúng tương đối đồng nhất: vi khuẩn Gram (+), không tạo bào tử, và hầu hết không di động Chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và tiết ra acid lactic:
C6H12O6 2 CH3CHOHCOOH + 22,5 kcal
Trang 4Tất cả các loài vi khuẩn lactic đều là vi khuẩn lên men bắt buộc, chúng không chứa các xitocrom và enzim catalaza Tuy nhiên chúng có thể sinh trưởng
được khi có mặt O2 , chúng là các loài vi khuẩn sống từ kị khí tới hiếu khí Các
loài vi khuẩn lactic bao gồm 4 giống sau: Streptococcus, Leuconostoc,
Pediococcus, Lactobacilus Một số hình ảnh:
Bản chất quá trình lên men lactic
Bản chất quá trình lên men là quá trình oxi hóa khử để thu năng lượng và các chất hữu cơ trung gian mà cơ chất đã chuyển hóa thành Các phản ứng chuyển hóa đó được thực hiện trong tế bào vi sinh vật dưới tác dụng của enzim
-Trong quá trình biến đổi cơ chất thành sản phẩm lên men luôn xảy ra quá trình tách và vận chuyển proton 2H+, hai điện tử 2e- qua enzim dehydrogenase có coezim là NAD hoặc NADP Sau đó 2H+ và 2e- được chuyển đến cho hợp chất hữu cơ trung gian để thực hiện quá trình khử chúng và tạo thành sản phẩm lên men
VD: Lên men giấm là quá trình oxi hóa rượu etylic thành acid acetic nhờ enzim alcohol oxydaza
CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O
Cơ chế quá trình lên men lactic
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành axid lactic nhờ vi sinh vật, điển hình là vi khuẩn lactic Lên men lactic là một trong những loại hình lên
Trang 5men phát trển nhất trong thiên nhiên, có hai kiểu lên men lactic chính là lên men đồng hình và lên men dị hình Trong lên men lactic điển hình thì sản phẩm tạo thành chỉ có axit lactic Còn đối với lên men lactic không điển hình, thì ngoài sản phẩm chính là axit lactic, còn có các sản phẩm phụ đó là: acetaldehyt, rượu etylic, CO2, axit succinic, axit acetic, axit formic, Chính các sản phẩm phụ này đã góp phần làm cho sản phẩm có mùi, vị thơm ngon hơn
aLên men lactic đồng hình (điển hình) :
Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men trong đó các sản phẩm axit lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ axit acetic, aceton, di-acetyl,……
Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:
C6H12O6 2 CH3CHOHCOOH +21,8.104 J
Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucoza được chuyển hóa theo chu trình Embden-Mayerhoff, vi khuẩn sử dụng cho qui trình này tấtcả các loại enzym aldolase, còn hydro tách ra khi dehydro hóa triozophophat được chuyển đến pyruvat Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase cho nên axit pynivic không phân hủy nữa mà tiếp tục khử thành axit lactic theo sơ đồ chuyển hóa dưới đây
b Lên men lactic dị hình
Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm axit lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như axit acetic, etanol, axit succinic,CO2Trong đó, axit lactic chiếm khoảng 40%, axit succinic khoảng 20%, rượu etylic và axit acetic 10% các loại khí 20% đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích lũy một lượng ít axit focmic Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn so với lên men lactic đồng hình
C 6 H 12 O 6 → CH 3 - CO - COOH → CH 3 - CHOH - COOH
Glucose Axit pyruvic Axit lactic
Trang 6Trong vi khuẩn lên men lactic dị hình không có các enzyme cơ bản của sơ
đồ Embden-Marehoff là aldolase triozophotphatizomerase bước đầu phân giải đường glucose ở những vi khuẩn này theo con đường pentozophotphat, tức là thông qua glucose 6photphat, 6-photphatgluconat và ribulose-5-photphat chuyển thành xilulose-5-photphat, hợp chất này tiếp tục biến đổi thành photphoglyceeraldehyde và acetylphotphat dưới tác dụng của enzyme pentozophotpho xelolase Những vi khuẩn dị hình thành axit acetic kèm theo sự tổng hợp ATP Acetylphophat được khử thành etanol thông qua acetyldehyt photphoglyceraldehyde thông qua axit pynivic mà tạo thành axit lactic’
+ Axit lactic được tạo thành từ axits pynivic do sựu tiếp nhận trực tiếp hydrogen từ dehydrase theo phương trình :
CH3COCOOH + dehydrase-H2 -> CH3CHOHCOOH + dehydrase
+ Axit xucxinic tạo thành từ pynivic do tác dụng với CO2 và tiếp theo sự tiếp nhận hydrogen từ dehydrase theo phương trình sau:
CH3COCOOH + CO2COOH-CH2-CO-COOH COOHCH2COCOOH+2Dehydrase-H2 COOH(CH2)2COOH+H2O+2Dehydrase +Etanol và axit acetic tạo thành nhờ men aldehydrase từ acetadehyde theo phương trình:
2CH3CHO + H2O + aldehydrase C2H5OH + CH3COOH + aldehydrase + Việc sinh ra các khí liên quan đến điều kiện yếm khí tỉ lệ các hợp chất phụ sinh
ra phụ thuộc vào môi trường dinh dưỡng và các laoij vi khuẩn lactic
Theo quan điểm tiến hóa sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hóa độc lập của lên men dị hình
Tác nhân vi sinh vật của quá trình lên men lactic
Tác nhân vi sinh vật trong quá trình lên men lactic là vi khuẩn lactic Người
ta đã sử dụng các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết làm tác nhân chính cho quá trình lên men Vì chúng là những vi sinh vật có nhiều đặc tính tốt như sử dụng được nhiều nguồn cacbon khác nhau, có khả năng sinh axit, phát triển ở nhiệt độ khá rộng và chịu mặn
Một số chủng vi khuẩn lactic được đưa vào nghiên cứu và ứng dụng như:
Trang 7•Giống Ladiococcus: là những cầu khuẩn Gram (+), thường dính lại với nhau thành
cặp đôi hoặc bốn Qúa trình trao đổi chất của nó là quátrình lên men đồng hình Chúng là những vi khuẩn yếm khí tùy tiện, có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí Chủng này yêu cầu rất cao về thành phần dinh dưỡng từ môi trường vì chúng không có khả năng sinh tổng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển của cơ thể
•Giống Lactobacillus: bao gồm các vi khuẩn chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật tự
nhiên của lên men thịt Đây là những trực khuẩn Gram (+), có thể lên men đồng hình hoặc dị hình Chúng có khả năng thủy phân đường Saccharose mạnh, nhiệt
độ phát triển tối thích là 30-350C
Vi sinh vật được sử dụng rộng rãi và rất nhiều vì chúng đem lại lợi íc thiết thực cho người sử dụng như tăng khả năng tiêu hóa hấp thụ tăng sức đề kháng, tạo ra chất dinh dưỡng
3 Phân lậpvi khuẩn
a Phân lập vi khuẩn lactic từ nước dưa chua
•Mẫu nước dưa được pha loãng như sau:
Rót 9ml dd nước muối sinh lý đã hấp khử trùng vào các ống nghiệm
Hút 1 ml dd mẫu nước dưa pha loãng với nôngf độ 10-1, rồi đưa lên máy vortex
để trộn đều
Từ ống nghiệm 10-1,pha loãng ra ống nghiệm có nồng độ thấp hơn 10-2 bằng cáh hút 1 ml từ ống nghiệm 10-1 cho vào 9ml dd nước muối sinh lý đã hấp khử trùng
ở ống nghiệm khác, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống nghiệm có
độ pha loãng mẫu 10-2, tiếp tục pha ta có các nồng độ khác nhau
•Gieo cấy mẫu
Dùng thạch MRS trong bình tam giác đã đun nóng sau đó làm nguội đến 45oC, sau đó tiến hành cho môi trường vào đĩa peptri,để thach khô Lấy các ống nghiệm
có mẫu pha loãng ở trên ,mỗi mẫu lấy 0,1ml mẫu cho vào đĩa petri Nhúng que trang vào đèn cồn 96o đốt que trang trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội trong 3 lần Tiếp đến dùng que trang trang đều dịch mẫu lên bề mặt thạch.Mỗi nồng độ lặp lại 2 đĩa peptri , mỗi lần trang phải hơ khử trùng que trang,mọi thao tác đều được tiến hành trong điều kiện vô trùng trong tủ cấy,bên cạnh ngọn lửa đèn cồn.Sau
Trang 8khi trang xong ,dùng giấy báo gói lại,lật ngược đĩa và nuôi cấy trong tủ ấm ở
37oC trong vòng 24-48 giờ ,thì tiến hành đếm và quan sát khuẩn lạc
•Cấy ria
Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trong tủ ấm ở 37oC trong vòng 24-48 giờ thì các khuẩn lạc xuất hiện,các khuẩn lạc có nhiều dạng khác nhau,có mùi chua đặc chưng của acid lactic.Chọn những khuẩn lạc có hỉnh thái khác nhau trên môi trường MRS
để đem cấy ria tạo khuẩn lạc thuần
Dùng que cấy ria thu sinh khối các khuẩn lạc đã chọn , cấy ria thành 3 đường trên đỉa thach cho đen khi các khuẩn lạc thuần tạo ra Sau khi cấy, lật ngược đĩa thạch lại bao gói ngoài bằng giấy báo và nuôi trong tủ ấm ở 37oC trong vofng 24h
Lưu ý : hơ và khử trùng que cấy sau mỗi lần trang dịch , mọi thao tác đều dược
tiến hành trong điều kiện vô trùng trong tủ, sấy bên cạnh ngọn lửa đèn cồn
b Nuôi cấy và bảo quản vi khuẩn
Các vi khuẩn lactic trong môi trường MRS pH 6,3-6,5 nuôi trong tủ ấm ở 370 C mục đích thu và bảo quản và khảo sát một số tính chất của Bacteriocin
Tiến hành :
Nuôi cấy vi khuẩn trong các bình tam giác chứa môi trường lỏng trong 7-10h Chia nhỏ huyên phù tế bào vào từng ống eppendolf 1,5 ml, sau đó thêm vào glicerol theo tỉ lệ 7:3 trộn đều hổn họp, để vào tủ lạnh ngản mát trong 3h rồi đem bảo quản ở 800C.
4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic
• Nguồn cacbon: Nguồn cacbon tốt nhất là các loại đường, nhưng ở một mức độ nhỏ, các đường chứa nhóm rượu, còn polisaccarid thì thực chất không thể lên men Tốc độ lên men của các loại polisacaccarid, disaccarid, olygsaccaridcuar các loại khác nhau là khác nhau tới mức có thể sử dụng tiêu chuẩn này giữa các loài Nếu khi nhân giống người ta sử dụng một lượng đường thông thường hiếm khi được làm nguồn cacbon thì vi khuẩn có thể thích nghi được với các loại đường đó về sau chúng có thể phát triển có hiệu quả trên môi trường chứa loại đường này, mà vẫn không làm ảnh hưởng tới khả năng lên men của các loại đường thông thường
• Vitamin B6: là một loại vitamin quan trọng trong sự tổng hợp các acid amin của
vi khuẩn lactic Tuy nhiên, phụ thuộc vào từng loại vi khuẩn lactic, nhiều acid
Trang 9amin vẫn được coi là acid amin không thay thế, các peptit và amit cũng có thể dùng làm nguồn N, tốc độ sinh trưởng khi có mặt chúng, có thể có gấp nhiều lần so với khi có mặt các acid amin tự do
• Photphate: là loại muối quang trọng nhất mà các vi khuẩn lactic yêu cầu, các muối amon không thể dùng làm nguồn N2 duy nhất, nhưng gây ảnh hưởng nhất định sự chuyển hóa acid amin
• Nhiệt độ: là một yếu tố quang trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Tùy thuộc vào nhiệt độ tối ưu mà chia làm 2 nhóm: ưa nhiệt và không ưa nhiệt
• pH, các chất kháng sinh và nhu cầu oxy cũng gây ảnh hưởng
5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
Tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic
Trong nguyên cứu bacteriocin thì vấn đề quan trọng là xác định xem loại vi khuẩn lactic nguyên cứu có tính đối kháng đối với 1 loài VSV hay không Để xác định tính đối kháng, việc thử nghiệm được tiến hành trên môi trường rắn có chủng chỉ thị như các chủng Vibrio, Bacillus và Salmonella Tính đối kháng thể hiện ở việc chất ức chế của chủng lactic khuyếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị Vi khuẩn lactic sinh bacteriosin có tính đối kháng với các chủng chỉ thị càng nhiều thì phổ kháng khuẩn càng rộng Để xác định hoạt tính kháng khuẩn ta sử dụng phương pháp khuyếch tán trên thạch
Với mục đích bảo quản bacteriocin từ vi khuẩn lactic để bảo quản thực phẩm
II. Ứng dụng sản xuất và bảo quản đậu phụ
Từ xa xưa, vi khuẩn lactic được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực.Trong đó dưa chua là món ăn phổ biến được lên men từ vi khuẩn lactic Mà nước dưa chua chứa rất nhiều vi khuẩn lactic sinh bacterriocin Vì vậy, người ta đã sử dụng nước dưa chua để sản xuất đậu phụ (đậu khuôn) Vậy đậu phụ là một sản phẩm như thế nào? Đậu phụ là một sản phẩm giàu dinh dưỡng và được nhiều người ưa chuộng
do đặc điểm dễ ăn, dễ dàng chế biến lại rẻ tiền Sản phẩm có quy trình sản xuất khá đơn giản không đòi hỏi nhiều thiết bị máy móc
1. Sơ đồ sản xuất đậu phụ bằng nước dưa chua theo kiểu truyền thống
Nước chua từ vi khuẩn lactic
Điều kiện để kết tủa sữa như sau:
Trang 10Nhiệt độ của sữa: >950 C
pH của sữa: >6
pH của nước chua: 4-4,5
pH của nước chua có ý nghĩa rất quan trọng trong việc kết tủa.Nếu pH cao thì lượng nước chua phải sử dụng nhiều, nếu pH thấp thì hiệu xuất thu hồi đạm thấp.Khi dịch sữa đạt 950 C ta cho nước chua từ từ vào (1/5).Quá trình này chia làm 3 giai đoạn:
Giai đoạn đầu cho ½ lượng nước chua
Sau 3 phút cho lượng còn lại.Vừa cho vừa khấy đều và nhẹ.Khi thấy nhiều hoa bông kết tủa xuất hiện thì không nên cho thêm nước chua nữa
Đậu nành
Ngâm
Ngâm 6h
Nước/đậu=1/6
xay Lọc thô