3. đỐI TƯỢNG NỘI DUNG VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.4Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC)
là phương pháp mới, có ựộ chắnh xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức. Phương pháp này ựược thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết hợp giữa kháng nguyên với kháng thể ựặc hiệu và ựược phát hiện bằng chất chỉ thị màu. Trong mỗi lô nhuộm IHC chúng tôi bố trắựối chứng dương (lát cắt tổ chức của chó bị bệnh Care) và ựối chứng âm (lát cắt tổ chức của chó không bị bệnh Care) ựể ựối chiếu. Kết quả ựược ựánh giá ở các mức ựộ nặng nhẹ khác nhau tùy thuộc và việc xuất hiện các ựiểm, các ựám màu nâu vàng trên tiêu bản (màu của cơ chất DAB). Khi có sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể ựơn dòng ựặc hiệu thì xuất hiện các ựám nâu vàng trên tiêu bản, phản ứng dương tắnh hay tổ chức có virus khu trú. Các ựám màu này càng nhiều, màu càng ựậm thì chứng tỏ mức ựộ kháng nguyên tập trung tại ựây càng nhiều.
Phương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch có quy trình tẩm ựúc bằng parafin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể. Các bước thực hiện:
Bước 1: Làm sạch tiêu bản
Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương pháp làm tiêu bản vi thể. Sau khi cho chảy dưới vòi nước rửa lại tiêu bản bằng nước cất.
Bước 2: Hoạt hoá enzyme
Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS và hấp ướt ở 1210C/5 phút.
Bước 3: Khử peroxydase nội sinh
Dùng H2O2 trong dung môi Methanol (1H2O2 30% : 9 Methanol), ngâm tiêu bản trong 10 phút.
Bước 4: Gắn kháng thể
Nhỏ 80 ộl kháng thể CDV lên tiêu bản. để tủ ấm 370C/1giờ hoặc 40C/qua ựêm.
Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần)
Bước 5: Gắn kháng kháng thể
Nhỏ 2 giọt kháng kháng thể lên tiêu bản. để tủ ấm 370C/1 giờ.
Rửa PBS 3 lần (5 phút/lần)
Bước 6: Cho cơ chất
Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 3-5 phút.
Kiểm tra dưới kắnh hiển vi thường. Nếu thấy xuất hiện màu vàng nâu trên lát cắt thì dừng phản ứng bằng nước sạch. Nếu không thì ngâm tiếp tiêu bản trong DAB ựến khi xuất hiện màu ở ựối chứng dương.
Bước 7: Nhuộm nhân tế bào bằng Hematoxilin, làm sạch tiêu bản, gắn
lamen và quan sát bằng kắnh hiển vi quang học.