4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1 Hồ sơ thu thập mẫu
4.5Kết quả phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST
Sau khi kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch ựã xác ựịnh chắc chắn ựược vị trắ khu trú của virus Care trong một số cơ quan của 5 chó mắc bệnh, chúng tôi tiến hành phân lập virus Care từ các cơ quan khác nhau trên môi trường tế bào một lớp Vero-DST.
Ở mỗi chó, chúng tôi lấy bệnh phẩm từ cơ quan có bệnh tắch ựể phân lập virus. Bệnh phẩm bao gồm: phổi, hạch lympho, ruột, não của các chó bệnh. Sau khi lấy, bệnh phẩm có thể ựược nghiền ngay ựể phân lập hoặc bảo quản ở nhiệt ựộ - 800C ựể sử dụng cho các lần phân lập tiếp theo.
Nghiền bệnh phẩm bằng chày trong cối vô trùng, bổ sung thêm DMEM và 10% kháng sinh. Huyễn dịch ly tâm loại bỏ cặn, lấy phần nước trong ựể phân lập bằng cách gây nhiễm vào khay 96 giếng ựã phủ tế bào Vero-DST một lớp. Mỗi mẫu ựem pha loãng theo cơ số 2 rồi gây nhiễm lên khay tế bào, mỗi nồng ựộ lặp lại 3 lần (25 ộl/giếng). để khay tế bào ựã gây nhiễm virus trong tủ ấm 370C, 5%CO2.
Quan sát bệnh tắch tế bào (CPE) tại các thời ựiểm 12, 24, 36, 48, 60 và 72 giờ sau khi gây nhiễm. Chúng tôi ựánh giá khả năng gây bệnh tắch tế bào của virus Care khi quan sát tế bào sau khi gây nhiễm virus tại các thời ựiểm bằng kắnh hiển vi soi nổi. Mức ựộ CPE ựược tắnh theo tỷ lệ phần trăm diện tắch có bệnh tắch tế bào so với tổng diện tắch tế bào trong bình. CPE ựạt 100% khi bệnh tắch xuất hiện trên cả bề mặt tế bào nuôi cấy một lớp, 0% khi chưa thấy có bệnh tắch tế bào. Từ ựó chúng tôi xác ựịnh tương ựối mức ựộ bệnh tắch. Chẳng hạn, CPE ựạt 25% khi quan sát trong toàn bộ môi trường nuôi cấy tế bào, bệnh tắch tế bào xuất hiện trên Ử diện tắch. Và ựể có kết luận chắnh xác, chúng tôi ựã bố trắ ựối chứng âm (không gây nhiễm virus vào giếng tế bào) và ựối chứng dương (sử dụng chủng virus Care Onderstepoort Ờ chủng virus vắc xin). Kết quả phân lập virus Care ựược trình bày tại bảng 4.6:
Bảng 4.6. Kết quả phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST CPE (%) Chó Mẫu bệnh phẩm 12h 24h 36h 48h 60h 72h Phổi - 20 55 80 100 B Ruột - * 39 80 100 B Hạch * 50 90 100 B B C20 Não - 10 30 60 90 100 Phổi - 10 25 50 70 100 Ruột - 40 75 100 B B Hạch * 30 60 95 100 B C21 Não - - - - Phổi - 20 50 70 100 B Ruột - 20 50 80 100 B Hạch - 10 40 70 95 100 C22 Não - 30 50 75 100 B Phổi - 50 85 100 B B Ruột - * 20 40 85 100 Hạch * 50 85 100 B B C23 Não - 10 30 70 100 B Phổi - 20 50 70 100 B Ruột - 20 50 80 100 B Hạch - 10 40 70 95 100 C24 Não - 30 50 75 100 B Chú thắch:
CPE: Bệnh tắch tế bào (Cytopathogenic Effect) (-) : Không có bệnh tắch
Sau khi phân lập chúng tôi thấy, bệnh tắch tế bào (CPE) do virus Care gây ra trên môi trường tế bào Vero-DST là kiểu Syncytium- thể hợp bào. đó là thể hợp bào bệnh lý: các tế bào co cụm lại, hòa màng, bao quanh các nhân tạo thành. Thể CPE này có thể quan sát ựược bằng kắnh hiển vi soi nổi thông thường.
Trong tổng số 20 mẫu phân lập từ 5 chó có triệu chứng lâm sàng của bệnh Care có 19 mẫu cho bệnh tắch tế bào ở các mức ựộ khác nhau, 1 mẫu không có bệnh tắch. Như vậy, sự có mặt của virus ở các cơ quan trong cơ thể chó mắc bệnh là không giống nhau.
Trong số các mẫu bệnh phẩm ựược chọn ựể phân lập thì mẫu phổi, ruột, hạch lympho thường xuyên khu trú virus ở các mức ựộ khác nhau. Hầu hết các mẫu bệnh phẩm ựem ựi phân lập ựều thấy xuất hiện bệnh tắch tế bào ở 24 giờ sau khi gây nhiễm và bệnh tắch tế bào ựạt 100% chủ yếu ở 60-72 giờ sau gây nhiễm.
Hạch lympho tập trung nhiều virus với số lượng lớn nên khi phân lập cho bệnh tắch tế bào (CPE) sớm và nhiều nhất. Sau 12 giờ phân lập virus từ 5 mẫu hạch lympho của 5 chó, có 3 mẫu hạch lympho xuất hiện CPE. Trong khi tại thời ựiểm này, những mẫu khác hầu như chưa xuất hiện CPE. Sau 48 giờ phân lập, có 2 trong số 5 mẫu hạch gây ra CPE 100%. Như vậy, hạch lympho là nơi tập trung virus nhiều hơn các cơ quan khác. điều này cũng phù hợp với những kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch ựã tiến hành. Ngoài ra, phổi, ruột và não cũng là những vị trắ khu trú của virus Care. Kết quả này giải thắch cho những triệu chứng và những tổn thương bệnh lý ựiển hình ở chó mắc bệnh Care.
đối với các mẫu phổi, ruột và não, thời gian xuất hiện CPE cũng như mức ựộ CPE có liên quan ựến mức ựộ tổn thương của các cơ quan này. Phân tắch bảng 4.6 kết hợp với những kết quả ở bảng 4.3 về biến ựổi ựại thể của các cơ quan lấy mẫu thấy rằng:
Chó C23 có bệnh tắch tập trung chủ yếu ở hệ hô hấp thì CPE của mẫu phổi của C23 chó cũng xuất hiện sớm và nhiều. Ở 24 giờ sau khi gây nhiễm, cho kết quả CPE 50%, CPE ựạt 100% ở 48 giờ. Ngược lại, phân lập virus từ mẫu ruột của C23 cho kết quả CPE chậm và ắt hơn. Sau 24 giờ, CPE mới xuất hiện dưới 10% và CPE ựạt 100% tại thời ựiểm 72 giờ.
Não là cơ quan khu trú của virus Care. 4 trong số 5 mẫu não ựã cho CPE. Tiến triển CPE tương ựối nhanh ở chó C24. CPE ựạt 30% tại thời ựiểm 24 giờ và ựạt 100% tại 60 giờ.