4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1 Hồ sơ thu thập mẫu
4.6.2Biểu ựồ biểu diễn sự nhân lên của virus phân lập
Do kinh phắ và thời gian thực tập tốt nghiệp có hạn nên chúng tôi chỉ lựa chọn 1 trong 5 virus phân lập ựược ựể tiếp tục nghiên cứu quy luật nhân lên của virus trên môi trường tế bào Vero- DST và so sánh với sự nhân lên của chủng virus vắc xin Onderstepoort. Căn cứ vào những ựiểm tương ựối khác biệt về biến ựổi bệnh lý ựại thể, vi thể và kết quả phân lập virus từ 5 chó mắc bệnh, ựặc biệt là sự khác nhau về ựặc tắnh sinh trưởng, phát triển so với chủng virus vắc xin, chúng tôi lựa chọn virus phân lập từ chó C24 (CDV24- H) ựể tiếp tục nghiên cứu.
để ựánh giá khả năng nhân lên của virus và chứng minh sự tồn tại chủ yếu của virus ở trong tế bào hay ngoài tế bào, chúng tôi thực hiện gây nhiễm virus rồi phân tắch sự biến ựổi hàm lượng virus giải phóng tự do ra môi trường nuôi cấy và lượng virus ở trong tế bào qua các thời ựiểm: 6, 12, 36, 48, 60, 72, 96, 120, 144 giờ sau khi gây nhiễm.
Chủng CDV24-H và virus chủng Onderstepoort ựược gây nhiễm lên môi trường tế bào một lớp Vero-DST với MOI = 0,01, ủ trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Sau ựó, tại mỗi thời ựiểm thu virus, virus giải phóng ngoài tế bào ựược thu riêng từ dịch nổi của môi trường còn virus ở trong tế bào ựược thu riêng từ những tế bào còn bám lại trên bề mặt giếng nuôi cấy. Tiến hành xác ựịnh hiệu giá những ống virus ựã thu ựể ựịnh lượng virus. Biểu ựồ biểu diễn sự nhân lên của virus có biến là log10 của TCID50 tại mỗi thời ựiểm thu virus.
Kết quả so sánh sự nhân lên của virus phân lập với virus vắc xin chủng Onderstepoort ựược thể hiện qua hình 4.25 và 4.26.
Hình 4.25. Biểu ựồ biểu diễn sự nhân lên của virus phân lập CDV24-H
Chú thắch:
hpi:hour post inoculation (thời gian sau gây nhiễm)
Hình 4.26. Biểu ựồ so sánh sự nhân lên của CDV24-H và virus vắc xin
Chú thắch:
CDV24-H: Virus Care phân lập ựược từ hạch lympho của chó C24 Ond: Virus vắc xin chủng Onderstepoort
hpi:hour post inoculation (thời gian sau gây nhiễm)
hpi
Qua phân tắch hình 4.25 cho thấy, virus phân lập CDV24-H xâm nhập và nhân lên nhanh trong tế bào, ựạt mức cao nhất tại thời ựiểm 36 giờ sau khi gây nhiễm. Ở thời ựiểm 36 giờ sau khi gây nhiễm, thu virus trong tế bào ựem xác ựịnh hiệu giá thấy giá trị TCID50 ựạt tới 3.16ừ107 TCID50/25ộl. Sau ựó, hàm lượng virus giảm mạnh. Từ 3.16ừ107 TCID50/25ộl giảm xuống 1.48ừ105 TCID50/25ộl ở thời ựiểm 48 giờ sau khi gây nhiễm. Tuy nhiên, ở những thời ựiểm tiếp theo, sự giảm hàm lượng virus diễn ra chậm hơn.
đáng chú ý là thời ựiểm 60 giờ sau khi gây nhiễm, hàm lượng virus trong tế bào tăng nhẹ khác hẳn với xu hướng chung là dần suy giảm như trong những khoảng thời gian trước và sau ựó. để làm rõ ựiều này, cần lưu ý rằng sở dĩ hàm lượng virus giảm khi thu virus từ các tế bào sau 36 giờ gây nhiễm có nguyên nhân chủ yếu là sự suy giảm số lượng tế bào do virus phá hủy. Tuy nhiên, có thể tại khoảng thời gian sau 60 giờ gây nhiễm là lúc virus có khả năng xâm nhập và nhân lên trong tế bào mạnh nên dù số lượng tế bào giảm nhưng lượng virus thu ựược vẫn tăng nhẹ.
Trong khi lượng virus ở trong tế bào tăng mạnh sau 6 giờ gây nhiễm thì những dấu hiệu tăng của lượng virus giải phóng tự do ngoài dịch nổi chỉ ựược ghi nhận sau 12 giờ gây nhiễm. Giá trị này tiếp tục tăng nhẹ trong các thời gian tiếp theo và ựạt ngưỡng 1.48ừ103 TCID50/25ộl khi thu virus ở 48 giờ sau khi gây nhiễm. Sau ựó, lượng virus giảm dần. để so sánh ựặc tắnh sinh trưởng của chủng virus phân lập với chủng virus vắc xin, hình 4.26 thể hiện ựồng thời sự nhân lên của virus vắc xin và virus phân lập.
Qua hình 4.26, ta dễ dàng nhận thấy rằng ựối với cả hai virus CDV24- H và virus vắc xin ựều có hàm lượng virus tồn tại trong tế bào nhiều hơn hàm lượng virus giải phóng tự do.
CDV24-H xâm nhập và nhân lên trong tế bào nhanh hơn so với virus vắc xin. Tại các thời ựiểm thu virus giống nhau, hàm lượng virus phân lập
CDV24-H tồn tại trong tế bào thường cao hơn hàm lượng virus vắc xin tồn tại trong tế bào.
Cụ thể, ta thấy rằng lượng virus vắc xin nằm trong tế bào tăng nhẹ sau 6 giờ gây nhiễm, bắt ựầu tăng mạnh từ thời ựiểm 12 ựến 24 giờ sau khi gây nhiễm. Trong khi ựó, lượng virus phân lập nằm trong tế bào liên tục tăng mạnh ngay sau 6 giờ gây nhiễm. Kết quả là lượng virus phân lập nằm trong tế bào nhanh chóng ựạt ựỉnh ở 36 giờ sau khi gây nhiễm với giá trị 3.16ừ107 TCID50/25ộl còn ựối với virus vắc xin, giá trị này ựạt cao nhất là 1.80ừ105 TCID50/25ộl ở thời ựiểm muộn hơn (48 giờ sau gây nhiễm).
Khi phân tắch hình thể hiện lượng virus giải phóng tự do, tồn tại trong dịch nổi của hai mẫu virus qua các thời ựiểm có thể dễ dàng nhận thấy chúng ắt có sự khác biệt ngoại trừ khoảng thời gian từ 36 ựến 72 giờ sau khi gây nhiễm. Trong khoảng thời gian từ 36 ựến 48 giờ, hàm lượng CDV24-H giải phóng khỏi tế bào tăng khá nhanh. Trong khi ựó, hàm lượng virus vắc xin giải phóng khỏi tế bào trong khoảng thời gian này lại giảm. Ngược lại, từ 48 giờ ựến 72 giờ sau khi gây nhiễm, hàm lượng CDV24-H giải phóng khỏi tế bào giảm thì hàm lượng virus vắc xin giải phóng lại tăng. Xem xét vấn ựề này trong mối liên quan với hàm lượng virus tồn tại trong tế bào ở thời ựiểm tương ứng ta có thể nhận thấy ựiểm khác nhau cơ bản giữa 2 loại virus.
Trong khoảng thời gian từ 36 ựến 48 giờ sau gây nhiễm, hàm lượng CDV24-H trong tế bào giảm mạnh còn CDV24-H giải phóng tự do lại tăng nhẹ, kết hợp với kết quả nghiên cứu sự nhân lên của virus tại bảng 4.7, CPE tại thời ựiểm 48 giờ sau gây nhiễm tăng gấp ựôi so với thời ựiểm 36 giờ (từ 20% lên 40%). Có thể nói, ựây là thời gian CDV24-H sinh trưởng yếu trong tế bào, hàm lượng virus tự do tăng do lượng tế bào bị virus phá vỡ tăng mạnh, giải phóng virus ra dịch nuôi cấy.
virus vắc xin lại diễn biến theo hướng khác. Virus vắc xin tăng cường xâm nhập vào tế bào và nhân lên trong tế bào. điều này làm hàm lượng virus trong tế bào tăng và hàm lượng virus tồn tại ở môi trường ngoài tế bào giảm.
Phân tắch tương tự như vậy, thời ựiểm 48 ựến 60 giờ sau gây nhiễm CDV24-H tăng cường xâm nhập và nhân lên trong tế bào, từ 60 ựến 72 giờ thì ngược lại, CDV24-H xâm nhập và nhân lên trong tế bào yếu. đối với virus vắc xin, thời gian từ 48 ựến 72 giờ, virus tăng cường giải phóng khỏi tế bào, quá trình xâm nhập và nhân lên trong tế bào của virus diễn ra chậm.
Như vậy sự nhân lên của virus khi nuôi cấy trên môi trường tế bào không phải là một quá trình liên tục, ựồng ựều. Cả virus vắc xin chủng Onderstepoort và virus phân lập CDV24-H ựều thể hiện rằng chúng xâm nhập, nhân lên trong tế bào mạnh hay yếu tùy từng thời ựiểm nhất ựịnh.
Nghiên cứu quy luật nhân lên của virus trên môi trường tế bào giúp cho việc xác ựịnh thời ựiểm thu virus tốt nhất: khoảng 36-48 giờ sau khi gây nhiễm, khi CPE ựạt 85-90%, lúc này hiệu giá virus ựạt cao nhất.