Để xác định trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen GmEXP1 đã tách dòng, chúng tôi tiến hành đọc trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen GmEXP1
trên máy đọc trình tự tự động ABI- 3130 DNA capillary electrophoresis system. Sau khi đọc trình tự nucleotid chúng tôi sử dụng phần mềm DNAstar để phân tích trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen GmEXP1, trình tự acid amin của protein EXP1.
Trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen GmEXP1 ở đậu tương được chúng tôi xác định dài 768 bp. Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự này với trình tự công bố trong Ngân hàng gen quốc tế mang mã số AF516879 để khẳng định đây là trình tự gen mã hoá protein EXP1 của cây đậu tương (Hình 3.7). Kết quả so sánh ở hình 3.7 cho thấy các trình tự nucleotid của gen GmEXP1 có độ tương đồng cao từ 98,6% đến 99,6%. Trong đó giống đậu tương SL3 và AF516879 có mức tương đồng là 98,6%, khác nhau ở 9 vị trí (32, 34, 37, 38, 40, 93, 130, 171, 483). Giữa SL3 và DT84 có mức độ tương đồng là 98.7%, khác nhau ở 8 vị trí (32, 34, 37, 38, 40, 130, 171, 483). Đặc biệt giữa DT84 và AF516879 có độ tương đồng cao nhất (99,6%), chỉ khác nhau ở 3 vị trí nucleotid (93, 483, 722) (hình 3.7 và bảng 3.1).
Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen GmEXP1 giữa giống đậu tương SL3 và DT84 với đoạn mã hoá của gen GmEXP1 giống có mã số AF516879 trong Ngân hàng gen quốc tế
Bảng 3.1. Sai khác trong trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen
GmEXP1ở 3 giống đậu tương
STT Vị trí AF516879 DT84 SL3 1 32 T T C 2 34 A A T 3 37 G G A 4 38 G G A 5 40 T T G 6 93 C T T 7 130 G G C 8 171 A A T 9 483 A G A 10 722 T C C
Đoạn mã hóa của gen GmEXP1 phân lập từ 2 giống đậu tương SL3 và DT84 có kích thước 768bp, mã hoá 255 amino acid. Kết quả so sánh trình tự amino acid của protein suy diễn EXP1 của hai giống đậu tương SL3 và DT84 với nhau và với EXP1 của trình tự gen có mã số AF516879 trong Ngân hàng gen quốc tế, thể hiện ở hình 3.8 và bảng 3.2.
Hình 3.8. So sánh trình tự amino acid mã hoá bởi gen GmEXP1 của giống đậu tương SL3, DT84 với giống AF 516879 công bố trong Ngân hàng gen
Bảng 3.2. Vị trí sai khác trong trình tự amino acid của protein do gen
GmEXP1 mã hóa ở 3 giống đậu tương
STT Vị trí AF516879 DT84 SL3 1 11 L L P 2 12 I I F 3 13 G G K 4 14 L L V 5 44 G G R 6 241 V A A
Từ kết quả phân tích trên chúng tôi khẳng định đã nhân bản, tách dòng thành công và xác định được chính xác trình tự nucleotide đoạn mã hóa của gen
GmEXP1 ở hai giống đậu tương SL3 và DT84.
Hiện nay, vai trò của expansin trong quá trình phát triển rễ của cây đậu tương đang được làm sáng tỏ, hướng tiếp cận nghiên cứu chức năng của họ gen expansin trong quá trình phát triển của rễ là sự tham gia của các protein trong quá trình cải thiện thành tế bào trong các lớp tế bào biểu bì rễ, trong việc điều hành các hoạt động kéo dài rễ và trưởng thành của cây được tập chung nghiên cứu.
Protein EXP1 ở cây đậu tương có hai vùng chức năng là DPBB (Double- Psi Beta-Barrel) và Pollen allerg, số lượng và trình tự amino acid của mỗi vùng có tính đặc trưng và quyết định mức độ hoạt động của expansin. Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự amino acid của vùng DPBB của 5 trình tự amino acid suy diễn của 5 giống đậu tương và kết quả được trình bày ở hình 3.9.
Hình 3.9. So sánh trình tự amino acid của vùng DPBB ở 5 giống đậu tương
Hình 3.9 cho thấy vùng DPBB có 89 amino acid, từ vị trí amino acid 64 đến 152. Các trình tự amino acid của các giống đậu tương DT84, SL1, SL3, AF516879 có tỷ lệ giống nhau là 100%; trình tự amino acid của giống đậu tương LS có sự sai khác với 4 giống đậu tương trên ở 3 vị trí amino acid (25, 27, 40), với khoảng cách là 1,7%. (Hình 3.10).
Hình 3.10. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên cơ sở trình tự amino acid của vùng DPBB của protein EXP1
DPBB là một vùng bảo thủ của Rare Lipoprotein A (RlpA) có cấu trúc bởi hai chuỗi dạng cuộn gấp kiểu beta (DPBB). Chức năng của RlpA đến nay vẫn
Nucleotide Substitutions (x100) 0 1.7 DPBB- SL1.pro DPBB- DT84.pro DPBB- SL3.pro DPBB- AF516879.pro DPBB- LS.pro
chưa được làm rõ, nhưng hoạt động của nó đã được chứng minh như một chất kìm hãm sự phát sinh đột biến ở E.coli. Khúc cuộn DPBB thường là một miền enzyme và các thành viên của họ DPBB là khá đa dạng và mỗi dạng DPBB giữ chức năng đặc trưng. Trình tự amino acid vùng DPBB của các giống đậu tương DT84, SL1, SL3, AF516879 so với giống đậu tương LS có 3 vị trí amino acid thay đổi, đó là: ở vị trí 88, tyrosine (AF516879, DT84, SL1, SL3) histidine (LS); ở vị trí 90, serine (AF516879, DT84, SL1, SL3) alanine (LS); ở vị trí 103 valine (AF516879, DT84, SL1, SL3) isoleusine (LS). Giống đậu tương LS có bộ rễ phát triển, do vậy những sự thay đổi ở vùng DPBB ở giống đậu tương LS so với bốn giống đậu tương còn lại liên quan đến sự phát triển bộ rễ cũng như mức độ chịu hạn thế nào và mang ý nghĩa sinh học gì cần phải có những nghiên cứu tiếp theo.
Vùng Pollen allerg có 78 amino acid từ vị trí amino acid số 163 đến vị trí amino acid 240. Vùng Pollen allerg của các trình tự amino acid của các giống đậu tương giống nhau 100% (Hình 3.11).
Hình 3.11. So sánh trình tự amino acid của vùng Pollen allerg trong trình tự amino acid của protein EXP 5 giống đậu tương