2.1.1. Vật liệu
Sử dụng 2 giống đậu tương: Sông Mã (SL3) và DT84 làm vật liệu nghiên cứu. Hai giống đậu tương đều do Trung tâm nghiên cứu phát triển đậu đỗ, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp (Bảng 2.1; Hình 2.1).
Bảng 2.1. Nguồn gốc của các giống đậu tương nghiên cứu
STT Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc
1 Sông Mã SL3 Giống địa phương, Sông Mã –Sơn La.
2 DT84 DT84 Giống trồng phổ biến ở miền Bắc, Việt Nam
Giống Sông mã (SL3) Giống DT84 (DT84)
Hình 2.1. Hạt của hai giống đậu tương nghiên cứu
Vector và chủng vi khuẩn sử dụng
Vector tách dòng pBT; do phòng Công nghệ tế bào thực vật của viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Chủng vi khuẩn E.coli DH5α do phòng Công nghệ tế bào thực vật của Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
Hoá chất
Trizol Reagents Kit của hãng Invitrogen dùng tách chiết RNA; Plasmid Miniprep Kit của hãng Qiagen dùng tách chiết Plasmid; Marker, kit dùng thôi gel, các enzyme hạn chế của hãng Fermentas (Hàn Quốc).
Tris HCl, MgCl2, EDTA, cloroform , Isoamyl, TAE, NaCl, CaCl2 Isopropanl, Ethanol 70%, IPTG, agarose, Glyserol, DEPC0.01%, nước khử ion ...
Kháng sinh Cabenicillin: cơ chất X- gal và các hóa chất cần thiết theo các bộ kit đều do phòng Công nghệ tế bào thực vật của viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Thiết bị
Máy PCR System 9700 (Appied Biosytem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini – transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển) máy vortex (Mimeshaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed – Vac 110A (Savant, Mỹ), máy li tâm, đĩa petri, ống eppendop các loại và nhiều trang thiết bị khác phục vụ trong quá trình thực nghiệm đều do phòng Công nghệ tế bào thực vật của Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền &Sinh học hiện đại, Khoa Sinh-KTNN,Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên. Các thí nghiệm tiến hành tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử 2.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử 2.2.1.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Phương pháp tách RNA bằng sử dụng bộ Kit Trizol Reagents của hãng Invitrogen để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu rễ mầm đậu tương, tách chiết RNA tổng số phải được thực hiện vô trùng tuyệt đối .
Theo chỉ dẫn của nhà sản xuất gồm các bước như sau: - Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng.
- Bổ sung 1ml Trizone Regents, đảo nhẹ đều trong 5 phút.
- Thêm 200 µl C: I ( 24 cloroform : 1 Isoamyl), đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Ly tâm 10.000 vòng/15 phút/40C.
- Thu 500 µl dịch nổi và cho vào ống eppendorf loại 1,5ml
- Thêm 500 µl Isopropanol 40 C cho vào ống, đảo đều 15 phút ở 250C (hoặc ủ qua đêm ở -200C)
- Li tâm 10.000 vòng/15 phút. - Thu tủa cặn đáy của ống eppendorf.
- Bổ sung 700 µl cồn 70%, li tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa, thực hiện hai lần.
- Làm khô RNA bằng mở nắp ống eppendorf trong box vô trùng khoảng 15-20 phút.
- Bổ sung 50 µl trong nước DEPC 0.01%, ủ ở nhiệt độ 550 C trong 15 phút cho tan RNA.Vortex để RNA hòa tan hoàn toàn.
- Điện di kiểm tra RNA tổng số trên gel agarose 1% trong TAE 1X. Sản phẩm điện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA trong các mẫu đã tách.
2.2.1.2. Phương pháp nhân đoạn mã hóa của gen GmEXP1
Từ RNA tinh sạch, tiến hành tạo cDNA và nhân bản gen GmEXP1 bằng kỹ thuật PCR với mồi đặc hiệu có trình tự được trình bày ở bảng 2.2
Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi sử dụng để nhân gen Gm EXP1
Ký hiệu mồi Trình tự mồi (5’-3’)
SoyExp-F CATGCCATGGATGGGCAAAATCATGCTTGT
SoyExp-R ATTTGCGGCCGCTTAGTGAACTGGGCTAGA
Kit và hóa chất dùng cho phản ứng RT-PCR do hãng Invitrogen cung cấp. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA thể hiện ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA
Stt Thành phần Thể tích
1 RNA tổng số 5 µl
2 Primese ranolome hexamin 1 µl
3 DEPC Water 6 µl
Tổng 12 µl
- Tiến hành ủ mẫu ở 650C trong 5 phút, sau đó cho ngay vào đá lạnh. - Bổ sung: Reaction Buffer 4 µl; ReboleckTM RnaseTrizone Regents 1 µl; dNTP Mix 2 µl; RT (Reverse Transcriptase: Enzym sao chép ngược) 1 µl.
- Mẫu được cho vào máy PCR và cài đặt chu kỳ nhiệt cho phản ứng: 250C/15 phút; 420C/60 phút; 700C/5 phút.
- Sau phản ứng tổng hợp cDNA tiếp tục thực hiện khuếch đại cDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu SoyExp-F/ SoyExp-R. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR (Bảng 2.4 và Bảng 2.5)
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR Stt Thành phần Nồng độ 1 Nước khử ion 13µl 2 Đệm PCR 10X 2.5µl 3 MgCl2 (25mM) 2µl 4 dNTPs (10mM) 2.5µl
5 Mồi xuôi (10pmol/µl) 1µl
6 Mồi ngược (10pmol/µl) 1µl
7 Taq DNA polymerase ( 5 đơn vị/ µl) 1µl 8 cDNA khuôn ( 10 – 20 ng/µl) 2µl
Tổng 25µl
Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
3 Gắn mồi 56 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
30
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
- Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose1% trong TAE 1X với sự có mặt của maker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím, mẫu đạt yêu cầu thì bảo quản.
Mẫu DNA thu được từ phản ứng RT- PCR cần phải được tinh sạch (thôi gel) để chuẩn bị cho tách dòng.
2.2.1.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR
Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas thực hiện như sau:
- Điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1% với sự có mặt của marker chuẩn và cắt lấy băng quan tâm có kích thước khoảng 0,77 Kb cho vào ống eppendorf 2ml.
- Bổ sung Buding Buffer với gel đã cắt theo tỉ lệ 1:1, ủ ở 550C trong 10 phút cho gel tan hoàn toàn tạo dịch trong suốt.
- Chuyển sản phẩm sang ống eppendorf màng lọc đáy (cột lọc tím), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây sau đó bỏ dịch đáy.
- Bổ sung 700 µl Wash buffer, li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. - Chuyển cột lọc tím sang ống eppendorf loại 1.5 ml, mở nắp trong vòng 5 phút.
- Bổ sung 40 µl nước khử ion, ủ mẫu ở 550C trong 5 phút, li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây.
- Bỏ cột lọc, thu dịch đáy bảo quản.
- Kiểm tra sản phẩm thôi gel bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X với sự có mặt của maker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Mẫu đạt yêu cầu bảo quản và sử dụng cho tách dòng gen.
2.2.1.4. Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR sau khi đã tinh sạch sẽ được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT nhờ enzyme nối T4 ligase . Thành phần cho phản ứng được thể hiện ở bảng 2.6
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT Stt Thành phần Thể tích 1 cDNA 7 µl 2 Ligation buffer 10X 1 µl 3 Vector pBT 1 µl 4 Enzym T4 ligase 1 µl Tổng 10 µl
Hỗn hợp thu được từ phản ứng ligation được ủ ở 220C trong khoảng 2 giờ, sau đó sẽ được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α.
Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT
2.2.1.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Tế bào khả biến được lấy từ trong tủ - 850C chuyển sang môi trường
-40C khoảng 20 phút.
Biến nạp:
- Hỗi hợp được đặt trong bình đá 15 phút, rồi ủ ở 420C chính xác 1 phút 30 giây, sau đó chuyển nhanh hỗn hợp vào đá lạnh( sốc nhiệt) trong 5 phút .
- Bổ sung 500 µl LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) cho vào hỗn hợp. - Hỗn hợp được nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C trong 1 giờ.
Cấy trải tế bào biến nạp trên LB đặc
- Đổ thạch môi trường cấy trải (X-gal: 50 µl; IPTG: 50 µl; carbenicillin: 50µl; LB đặc: 500µl) vào đĩa thủy tinh hoặc nhựa. LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose )
- Mẫu sau khi nuôi phục hồi li tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch nổi giữ lại 150 µl trộn nhẹ. Sử dụng que cấy trải đã khử trùng, trải 150 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường môi trường cấy trải có kháng sinh carbenicillin. Ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ.
Chuyển khuẩn lạc sang pha nuôi lỏng:
- Chọn các khuẩn lạc trắng đem nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin (tỉ lệ 1000LB lỏng: 1carbenicillin). Nuôi ở 370C, lắc 200 vòng /phút, trong 16 giờ.
2.2.1.6. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR)
Lấy dịch nuôi lỏng chứa vi khuẩn đã biến nạp, đem kiểm tra sản phẩm các mẫu đã chọn dòng bằng phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi pUC18. Đây là cặp mồi được thiết kế chung cho các vector tách dòng, nó nằm trên vector và nhân đoạn gen vừa biến nạp hoặc PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu SoyExp-F/ SoyExp-R
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng colony – PCR STT Thành phần Thể tích 1 Nước khử ion 13µl 2 Đệm PCR 10X 2,5µl 3 MgCl2 ( 25mM) 2µl 4 dNTPs ( 10mM) 2,5µl
5 Mồi xuôi đặc hiêu (10pmol/µl) 1µl 6 Mồi ngược đặc hiệu (pmol/µl) 1µl
7 Khuẩn lạc 2µl
8 Taq DNA polimerase (5 đơn vị/µl) 1µl
Tổng 25µl
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 5 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
3 Gắn mồi 56 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
30
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.1.7. Tách chiết plasmid tái tổ hợp
Tách chiết plasmid theo bộ kit Plasmid Miniprep Kit của hãng Qiagen. Cụ thể có sự tham gia của 3 loại hóa chất:
Sol I (50 mM glucose, 25mM Tris HCl pH 8, 10mM EDTA pH8) Sol II (0,2M NaOH, SDS 1%)
Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5ml CH3COOH; 28,5ml H2O)
Quy trình tách plasmid
- Lấy 2ml dịch khuẩn nuôi cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 5 phút, thu cặn.
- Hòa cặn trong 100µl Sol I đảo đều cho tan cặn. Bổ sung 200 µl Sol II, đảo nhẹ.
-Bổ sung 150µl sol III đảo nhẹ.
- Bổ sung C: I (24 cloroform: 1 Isoamyl), đảo nhẹ. - Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút sau đó thu dịch nổi.
- Bổ sung Isopropanol lạnh theo tỉ lệ 1:1.Ủ ở - 200 C, trong 30 phút. - Ly tâm 13000 vòng/phút/ 40 C, trong 10 phút, sau đó thu tủa.
- Bổ sung 500µl cồn lạnh 70% lắc nhẹ, ly tâm 13000vòng/phút trong 10 phút, sau đó thu tủa.
- Làm khô mẫu trong box, bổ sung nước 40 µl RNAase, ủ 370 trong 30 phút. - Điện di kiểm tra kết quả tách plasmid trên gel agarose 1% trong TAE 1X và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
2.2.2. Phương pháp xác định và phân tích trình tự nucleotide của gen
Trình tự đoạn mã hóa của gen GmEXP1 được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Phân tích trình tự gen GmEXP1 bằng phần mềm DNAstar hoặc Bioedit.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ NHÂN BẢN ĐOẠN MÃ HÓA CỦA GEN GmEXP1 TỪ HỆ GEN CỦA HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG SL3 VÀ DT84 GEN CỦA HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG SL3 VÀ DT84
Mọi nghiên cứu về hệ gen đều bắt đầu từ việc tách chiết được DNA hoặc RNA ở dạng tinh sạch.
Từ rễ mầm đậu tương của 2 giống chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số theo bộ kit Trizol Reagents của hãng Invitrogen. RNA tổng số sau khi tách được kiểm tra bằng điện di trên gel argarose 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím. Kết quả kiểm tra cho thấy sản phẩm tách chiết RNA tổng số mà chúng tôi thu được có thể sử dụng để tổng hợp cDNA và tiến hành phản ứng PCR.
Từ khuôn RNA tổng số để khuếch đại được đoạn mã hóa của gen GmEXP1
(cDNA) thì chúng tôi đã thực hiện bằng phản ứng RT-PCR , qua hai giai đoạn liên tiếp là tạo cDNA và sau đó là PCR. Phản ứng nhân bản đoạn mã hóa của gen
GmEXP1 được thực hiện bằng phản ứng PCR để khuếch đại đoạn mã hóa của gen
Gm EXP với cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế là SoyExpF/SoyExpR. Nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng PCR là 560C, sau 30 chu kỳ phản ứng. Kết quả kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR bằng điện di trên gel argarose 1% với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm RT-PCR khuếch đại đoạn mã hoá của gen
GmEXP1(M: marker 1 kb 1 : SL3 ; 2 : DT84)
Kết quả PCR thu được cho thấy cả 2 mẫu (SL3, DT84) đều cho sản phẩm với kích thước xấp xỉ 0,77kb, kích thước này phù hợp theo tính toán lý thuyết và tương ứng với kích thước của đoạn mã hoá thuộc gen GmEXP1 của giống mang mã số AF516879 công bố trong Gen Bank. Chúng tôi thực hiện tinh sạch sản phẩm PCR theo bộ kit và kiểm tra kết quả điện di trên gel argarose 1% (Hình 3.2).
Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm thôi gel đoạn mã hoá của gen GmEXP1
M: marker 1kb 1,2: SL3; 3,4 : DT84
1 M 2
0,77kb
3.2. TÁCH DÒNG VÀ SO SÁNH XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN MÃ HÓA CỦA GEN GmEXP1 CỦA HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG SL3 VÀ DT84
3.2.1 Kết quả tách dòng cDNA
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GmEXP1 (cDNA) sau tinh sạch, được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT và tiếp theo được biến nạp vào tế bào khả biến Ecoli chủng DH5-sau đó nuôi cấy trên môi trường LBaga đặc bổ sung kháng sinh carbenicillin và X-gal, để qua đêm, kết quả được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Đĩa nuôi cấy xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh
Chúng tôi chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc trắng của các mẫu, nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbenicillin, nuôi lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở 37oC, qua đêm. Tế bào tái tổ hợp trong các mẫu được thu lại bằng cách li tâm thu dịch đáy. Để chọn dòng chúng tôi thực hiện phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi SoyExp-F/ SoyExp-R nhằm sàng lọc các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn mã hóa của gen GmEXP1
(thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng ở phần phương pháp). Chọn ngẫu nhiên 7 mẫu khuẩn của 2 giống trong đó 3 mẫu của giống SL3 và 4 mẫu của
giống của DT84 thực hiện PCR với cặp mồi SoyExp-F/ SoyExp-R. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc trên gel argarose 1% với sự có mặt marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Nếu khuẩn mang đoạn mã hóa của gen GmEXP1 thì sản phẩm PCR sẽ xuất hiện 1 băng có kích thước khoảng 0,77kb. Hình ảnh điện di cho thấy một số mẫu (dòng khuẩn) cho kết quả tốt. (Hình 3.4).
Hình 3.4. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc
M: marker 1kb 1- 2 - 3: SL3; 4 - 5 - 6 - 7: DT84
Chọn những dòng khuẩn lạc cho kết quả tốt nuôi từng mẫu vào 3ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbenicillin và dùng để tách chiết plasmid phục vụ cho xác định trình tự gen. Chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid theo bộ Kit của hãng Qiagen (Quy trình tách chiết trình bày ở phần phương pháp). Sản phẩm tách plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X, và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím (Hình 3.5).
0,77kb M 1 2 3 4 5 6 7
Hình 3.5. Ảnh điện di kiểm tra kết quả tách plasmid tái tổ hợp
Để khẳng định chắc chắn plasmid tái tổ hợp tách chiết được có mang