Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GmEXP1 (cDNA) sau tinh sạch, được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT và tiếp theo được biến nạp vào tế bào khả biến Ecoli chủng DH5-sau đó nuôi cấy trên môi trường LBaga đặc bổ sung kháng sinh carbenicillin và X-gal, để qua đêm, kết quả được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Đĩa nuôi cấy xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh
Chúng tôi chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc trắng của các mẫu, nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbenicillin, nuôi lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở 37oC, qua đêm. Tế bào tái tổ hợp trong các mẫu được thu lại bằng cách li tâm thu dịch đáy. Để chọn dòng chúng tôi thực hiện phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi SoyExp-F/ SoyExp-R nhằm sàng lọc các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn mã hóa của gen GmEXP1
(thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng ở phần phương pháp). Chọn ngẫu nhiên 7 mẫu khuẩn của 2 giống trong đó 3 mẫu của giống SL3 và 4 mẫu của
giống của DT84 thực hiện PCR với cặp mồi SoyExp-F/ SoyExp-R. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc trên gel argarose 1% với sự có mặt marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Nếu khuẩn mang đoạn mã hóa của gen GmEXP1 thì sản phẩm PCR sẽ xuất hiện 1 băng có kích thước khoảng 0,77kb. Hình ảnh điện di cho thấy một số mẫu (dòng khuẩn) cho kết quả tốt. (Hình 3.4).
Hình 3.4. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc
M: marker 1kb 1- 2 - 3: SL3; 4 - 5 - 6 - 7: DT84
Chọn những dòng khuẩn lạc cho kết quả tốt nuôi từng mẫu vào 3ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbenicillin và dùng để tách chiết plasmid phục vụ cho xác định trình tự gen. Chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid theo bộ Kit của hãng Qiagen (Quy trình tách chiết trình bày ở phần phương pháp). Sản phẩm tách plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X, và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím (Hình 3.5).
0,77kb M 1 2 3 4 5 6 7
Hình 3.5. Ảnh điện di kiểm tra kết quả tách plasmid tái tổ hợp
Để khẳng định chắc chắn plasmid tái tổ hợp tách chiết được có mang đoạn mã hóa của gen GmEXP1 quan tâm, chúng tôi tiến hành phản ứng cắt plasmid bằng enzyme BamHI. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong TAE 1X với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím (Hình 3.6).
M: marker 1kb; 1- 3: SL3; 4 - 6 : DT84
Hình 3.6. Ảnh điện di cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym BamHI M 1 2 3 4 5 6
0,77kb 2,7kb
Kết quả tách plasmid và kiểm tra plasmid tái tổ hợp đã khẳng định tách dòng thành công và mẫu có vạch tương ứng với vị trí 0,77kb được sử dụng cho việc xác định trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen GmEXP1.