Theo khuyến cỏo của WHO, đối với mẫu tinh dịch chất lượng kộm, lọc rửa tinh trựng bằng phương phỏp ly tõm thang nồng độ sẽ được ưu tiờn sử dụng hơn so với phương phỏp bơi lờn do phương phỏp này giỳp thu được tinh trựng cú mật độ cao hơn [68]. Theo Counsel M. và cộng sự (2004): phương phỏp lọc rửa bằng thang nồng độ Percoll làm tăng rừ rệt khả năng sống của tinh trựng sau ró đụng ở mẫu thiểu tinh (p < 0,01), đồng thời phương phỏp này cũng giỳp thu được tổng số tinh trựng di động cao hơn so với phương phỏp bơi lờn [24].
Nghiờn cứu này được tiến hành trờn cỏc mẫu nhược tinh nờn chỳng tụi lựa chọn phương phỏp thang nồng độ để lọc rửa tinh trựng. Sau lọc rửa, mật độ tinh trựng giảm đỏng kể, tuy nhiờn chất lượng của cỏc mẫu nhược tinh được cải thiện rừ rệt (sẽ được đề cập ở phần sau). Sự khỏc biệt của cỏc thụng số sau lọc rửa đều rất đỏng tin cậy và cú ý nghĩa thống kờ với p < 0,001.
Như vậy, việc lọc rửa tinh trựng khụng những cú hiệu quả trờn cỏc mẫu tinh trựng bỡnh thường như một số tỏc giả đó nghiờn cứu [10],[13], mà quỏ trỡnh này cũn mang lại hiệu quả rừ nột khi tiến hành trờn cỏc mẫu tinh dịch chất lượng kộm. Đõy cũng là kết quả bước đầu chỳng tụi ghi nhận được trong nghiờn cứu.
4.1.3. Pha mụi trƣờng bảo quản lạnh vào tinh dịch
Nhiều tỏc giả đó sử dụng nhiều loại mụi trường khỏc nhau để bảo quản TT. Ban đầu, cỏc tỏc giả sử dụng glycerol đơn thuần để làm mụi trường bảo quản lạnh. Cỏc tỏc giả đó khuyến cỏo việc sử dụng mụi trường phối hợp sẽ cho chất lượng tinh trựng sau BQL tốt hơn glycerol đơn thuần và TEST - Yolk là mụi trường nờn được lựa chọn trước tiờn để bảo quản TT [31], [59]. Theo Trịnh Sinh Tiờn (2002) sử dụng mụi trường GEYC và mụi trường Sperm Freeze cho chất lượng tinh trựng sau BQL là tương đương [14].
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi sử dụng mụi trường Sperm Freeze là mụi trường BQL. Hiện nay, mụi trường Sperm Freeze đang được sử dụng phổ biến tại cỏc trung tõm HTSS do tớnh tiện lợi và chất lượng sử dụng ưu việt của nú. Tuy nhiờn, mụi trường này cú giỏ thành tương đối cao.
Khi pha mụi trường bảo quản lạnh vào tinh dịch phải đảm bảo đỳng tỷ lệ. Mụi trường bảo quản lạnh phải được nhỏ từng giọt vào lọ tinh dịch với tốc độ 15 giọt/phỳt và lắc đều. Để đảm bảo tinh trựng ớt bị tỏc động bởi mụi trường cần thực hiện thao tỏc nhẹ nhàng và từ từ. Sau đú, mẫu tinh dịch đó được pha mụi trường được để ở nhiệt độ phũng 15 phỳt trước khi bảo quản lạnh. Thời gian này cú tỏc dụng để glycerol (thành phần chớnh của mụi trường bảo quản lạnh) trong mụi trường ngoại bào trao đổi nước với mụi trường nội bào qua màng tế bào [6].
4.1.4. Đúng gúi
Cú hai hỡnh thức đúng gúi hay được sử dụng là cọng rạ (straw) bằng nhựa 0,25 ml, 0,5 ml hoặc tuýp chịu lạnh (cryovial) 1- 3 ml. Hỡnh thức đúng gúi bằng tuýp chịu lạnh cryovial thớch hợp hơn đối với quy trỡnh hạ nhiệt chậm và cho chất lượng tinh trựng sau BQL tốt hơn so với hỡnh thức đúng gúi bằng cọng rạ [47].
Trong nghiờn cứu này chỳng tụi sử dụng cryovial 1,8 ml vỡ nú thớch hợp với thể tớch mẫu tinh dịch của nghiờn cứu. Mỗi mẫu tinh dịch được chia 2 phần cho mẫu đó lọc rửa và mẫu tươi khụng lọc rửa, mỗi phần lại được chia thành 3 phần nhỏ cho 3 khoảng thời gian bảo quản: 1 ngày, 10 ngày và 30 ngày. Việc phõn chia mẫu như vậy đảm bảo tớnh hợp lý, thống nhất và chớnh xỏc của nghiờn cứu.
4.1.5. Hạ nhiệt độ
Hiện cú 2 phương phỏp được ỏp dụng trong bảo quản lạnh tinh trựng là hạ nhiệt độ chậm và thủy tinh húa. Trong đú, phương phỏp thủy tinh húa vẫn chưa được ứng dụng rộng rói trong thực tế.
Theo nhiều tỏc giả, nếu dựng mỏy lạnh sinh học chạy theo chương trỡnh mỏy tớnh hạ nhiệt độ chậm với tốc độ 1-25oC/ phỳt là tốt nhất [33],[34],[59]. Tuy vậy, phương phỏp này hầu như chỉ được dựng ở cỏc trung tõm HTSS lớn và sử dụng chủ yếu cho đụng phụi và trứng. Thiết bị được sử dụng cú giỏ thành cao, quy trỡnh đụng lạnh kộo dài và tốn nhiều nittơ lỏng là những nhược điểm của phương phỏp này.
Hiện nay, phương phỏp hạ nhiệt độ được cỏc ngõn hàng tinh trựng trờn thế giới thường dựng là hạ nhiệt độ bỏn tự động hoặc tự động theo chương trỡnh hoặc khụng theo chương trỡnh.
Quy trỡnh hạ nhiệt bằng mỏy lạnh bỏn tự động Nicool-10 đảm bảo tốc độ hạ nhiệt:
- Giai đoạn 1: hạ nhiệt từ 25oC → -10oC, trong 6 phỳt. - Giai đoạn 2: hạ nhiệt từ -10oC → -120oC, trong 20 phỳt. - Giai đoạn 3: hạ nhiệt từ -120oC → -196oC, trong 5 phỳt.
Tuy nhiờn, nhược điểm của phương phỏp hạ nhiệt sử dụng mỏy Nicool 10 là số lượng tuýp chứa mẫu trong mỗi quy trỡnh rất hạn chế (10 tuýp),
lượng nitơ tiờu thụ trong mỗi quy trỡnh khỏ lớn (gần 1000ml) và đũi hỏi phải cú thiết bị mỏy múc chuyờn dụng, khỏ đắt tiền, tớnh cơ động của phương phỏp khụng cao.
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi sử dụng phương phỏp hạ nhiệt độ theo kinh nghiệm, từ cổ bỡnh nitơ lỏng trữ mẫu. Để xỏc định chớnh xỏc nhiệt độ và tốc độ hạ nhiệt của từng giai đoạn, chỳng tụi sử dụng đầu dũ cảm nhiệt:
Giai đoạn 1: Tốc độ hạ nhiệt là: 5,8oC/phỳt. Giai đoạn 2: Tốc độ hạ nhiệt là: 5,5oC/phỳt. Giai đoạn 3: Tốc độ hạ nhiệt là: 15,2oC/phỳt.
Như vậy quy trỡnh hạ nhiệt độ của chỳng tụi hoàn toàn tương đương với quy trỡnh hạ nhiệt sử dụng mỏy Nicool 10 và đảm bảo tốc độ hạ nhiệt tốt nhất là 1- 25oC/ phỳt. Mặt khỏc, việc ỏp dụng quy trỡnh này khỏ đơn giản và tiết kiệm chi phớ nờn quy trỡnh đó được ỏp dụng rộng rói ở nhiều trung tõm HTSS trong nước và trờn thế giới.
4.1.6. Lƣu trữ
Theo Saritha và cs (2001), chất lượng tinh trựng sau bảo quản khụng cú sự khỏc biệt khi bảo quản trong mụi trường nitơ lỏng và trong hơi nitơ lỏng [56]. Tuy nhiờn, để đảm bảo sự thống nhất trong nghiờn cứu, chỳng tụi lưu trữ tinh trựng trong nitơ lỏng, là phương phỏp đang được sử dụng phổ biến hiện nay ở trong nước và trờn thế giới [59]. Trong suốt quỏ trỡnh BQL, mẫu luụn chỡm trong nitơ lỏng để đảm bảo nhiệt độ của mẫu bảo quản luụn được duy trỡ hằng định ở -196oC. Do điều kiện thời gian thực hiện đề tài, cỏc mẫu lưu trữ dài nhất trong nghiờn cứu của chỳng tụi là 30 ngày. Khoảng thời gian này phự hợp với chu kỳ kinh nguyệt của người phụ nữ để làm HTSS lần 2 nếu lần 1 thất bại.
Ở đõy, chỳng tụi chia nhỏ cỏc mẫu tinh dịch trước khi lưu trữ để phục vụ cho việc đỏnh giỏ chất lượng mẫu tinh dịch sau BQL ở cỏc thời điểm khỏc nhau. Thực tế lõm sàng cũng cho thấy việc lưu trữ từng lượng nhỏ mẫu tinh dịch giỳp cho tổng số lượng tinh trựng thu hồi được sau quỏ trỡnh BQL cao hơn. Đồng thời, cú thể cung cấp sẵn nguồn tinh trựng cho cỏc bệnh nhõn vụ sinh phải điều trị bằng phương phỏp IVF, ICSI thực hiện nhiều chu kỳ.
4.1.7. Tan đụng
Cỏc tỏc giả đưa ra cỏc phương phỏp tan đụng khỏc nhau. Theo Vladimir I.(2004) tốc độ tan đụng chậm cú thể ảnh hưởng lờn chất lượng tinh trựng. Quỏ trỡnh này làm tăng thờm cỏc tế bào tổn thương [67]. Tỏc giả Isachenco E. (2003) cũng cho rằng quỏ trỡnh tan đụng với tốc độ rất nhanh sẽ giỳp ngăn chặn sự kết tinh trở lại của cỏc tinh thể đỏ, do đú sẽ ớt gõy hại với tế bào [35]. Theo Sherman J.K, tốc độ tan đụng tốt nhất từ 1- 60oC/ phỳt. Tốc độ này phự hợp với nghiờn cứu của nhiều tỏc giả [33], [34], [47].
Trờn cơ sở cỏc nghiờn cứu trờn, chỳng tụi thực hiện phương phỏp tan đụng bằng cỏch lấy mẫu trong nitơ lỏng ra và đặt ngay vào tủ ấm trong 10 phỳt. Như vậy tốc độ tan đụng là 23,3oC/ phỳt.
4.2. CHẤT LƢỢNG MẪU TINH TRÙNG SAU LỌC RỬA
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi sử dụng kỹ thuật lọc rửa tinh trựng bằng phương phỏp ly tõm dựa vào thang nồng độ do mẫu nghiờn cứu của chỳng tụi là mẫu nhược tinh nờn lựa chọn phương phỏp này sẽ cho kết quả tốt hơn so với phương phỏp bơi lờn [68].
Ở đõy, chỳng tụi cũng sử dụng mụi trường Sil-select, là húa chất đang được sử dụng rộng rói trong lọc rửa tinh trựng vỡ tớnh ớt gõy độc cho tế bào.
Sau khi lọc rửa, chất lượng tinh trựng tốt hơn hẳn so với mẫu tinh trựng ban đầu (xem bảng 3.1, hỡnh 3.1, hỡnh 3.2). Cỏc chỉ số chất lượng tinh trựng sau lọc rửa đều thay đổi rừ rệt so với trước lọc rửa (biểu đồ 4.1).
73,63 32,47 49,1 86,37 36,9 68,83 74,63 59,37 11,07 18,8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Mật độ Di động Di động tiến tới Tỷ lệ khụng bắt màu eosin Hỡnh thỏi bỡnh thường Trước rửa Sau rửa Tỷ lệ %
Biểu đồ 4.1: Chất lượng tinh trựng trước và sau lọc rửa
Mật độ tinh trựng giảm hẳn so với trước lọc rửa do quỏ trỡnh lọc rửa đó loại bỏ đi cỏc tinh trựng chết và cỏc tinh trựng cú hỡnh thỏi bất thường. Ngoài ra, mật độ tinh trựng giảm cũn do khả năng lọc khụng hoàn toàn của mụi trường.
Bất thường tinh trựng đa số là bất thường phối hợp: nhược tinh đi kốm với thiểu tinh và quỏi tinh [11], [46]. Vỡ vậy, việc lọc rửa cỏc mẫu tinh trựng này sẽ làm mật độ tinh trựng giảm đi rất nhiều. Điều này giải thớch cho kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi sau lọc rửa mật độ tinh trựng giảm đi hơn 2 lần so với trước lọc rửa.
Tỷ lệ tinh trựng di động, tỷ lệ tinh trựng di động tiến tới và tỷ lệ hỡnh thỏi bỡnh thường của tinh trựng sau lọc rửa đều cao hơn hẳn so với trước lọc rửa. Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi phự hợp với cỏc tỏc giả Đào Thị Thỳy Phượng (2004) [10], Nguyễn Phương Thảo Tiờn (2007) [13] khi cỏc nghiờn cứu này được tiến hành trờn những mẫu tinh trựng bỡnh thường.
Tuy nhiờn, trong nghiờn cứu này chỳng tụi cú đỏnh giỏ tỷ lệ tinh trựng khụng bắt màu thuốc nhuộm eosin hay tỷ lệ tinh trựng sống sau nhuộm eosin. Chỳng tụi nhận thấy tỷ lệ này ở mẫu sau lọc rửa giảm hẳn so với mẫu trước lọc rửa. Ở đõy, chỳng tụi sử dụng thuật ngữ “Tỷ lệ tinh trựng sống sau nhuộm eosin” do tỷ lệ này khụng phản ỏnh tỷ lệ tinh trựng sống thực sự của mẫu nghiờn cứu. Sau lọc rửa, tỷ lệ tinh trựng di động tăng lờn nhưng tỷ lệ tinh trựng sống sau nhuộm eosin lại giảm đi. Điều này theo chỳng tụi, cú sự tổn thương màng tinh trựng rất nhanh sau nhuộm eosin. Sau lọc rửa, sức bền của tinh trựng giảm, cộng thờm với tỏc dụng gõy độc tinh trựng của eosin nờn ngay sau khi nhuộm eosin, tỷ lệ tinh trựng sống đó giảm đi rừ rệt. Mặt khỏc, việc lọc rửa đó làm hoạt húa màng tế bào làm màng tế bào mất đi lớp bảo vệ (glycoprotein màng tế bào) nờn khả năng thấm với chất độc eosin của màng tế bào tăng lờn. Do đú, tỷ lệ tinh trựng bắt màu eosin tăng lờn sau khi lọc rửa.
Kết quả nghiờn cứu này của chỳng tụi khỏc với cỏc tỏc giả Đào Thị Thỳy Phượng (2004) [10], Nguyễn Phương Thảo Tiờn (2007) [13] khi cỏc tỏc giả này nghiờn cứu trờn cỏc mẫu tinh trựng bỡnh thường. Sự khỏc biệt này theo chỳng tụi là do tiờu chuẩn chọn mẫu ban đầu khỏc nhau. Chỳng tụi cũng mạnh dạn đề xuất một số cỏch đỏnh giỏ tỷ lệ sống chết của tinh trựng cú thể cho kết quả khả quan hơn như: pha chuẩn eosin, đọc kết quả nhanh hoặc sử dụng chất khỏc thay thế eosin như Trypan Blue.
4.3. CHẤT LƢỢNG TINH TRÙNG SAU BẢO QUẢN LẠNH SÂU 4.3.1. Tỷ lệ di động của tinh trựng 4.3.1. Tỷ lệ di động của tinh trựng
Trong nghiờn cứu này, ở cả 3 khoảng thời gian bảo quản tỷ lệ di động và tỷ lệ di động tiến tới của tinh trựng đều thấp hơn rừ rệt so với trước bảo quản (xem bảng 3.2). Kết quả này phự hợp với cỏc kết quả đó được bỏo cỏo của nhiều tỏc giả [13],[15],[29],[69]. Diễn biến của quỏ trỡnh giảm khả năng di động và khả năng di động tiến tới của tinh trựng được thể hiện trong biểu đồ 4.2.
12.77 5.53 17.8 24.2 86.37 11.67 8.5 63.83 0 20 40 60 80 100 120
Trước BQL BQL 1 ngày BQL 10 ngày BQL 30 ngày
TT di động TT di động tiến tới
Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ % TT di động và TT di động tiến tới trước và sau BQL ở
những mẫu nhược tinh được lọc rửa
Do tỏc động của quỏ trỡnh đụng lạnh, khả năng di động của tinh trựng giảm là đương nhiờn. Tuy nhiờn, mong muốn của cỏc tỏc giả là cú được tỷ lệ tinh trựng di động cao nhất cú thể sau BQL. Hiệp hội Ngõn hàng mụ Hoa Kỳ đó đưa ra tiờu chuẩn để đỏnh giỏ chất lượng tinh trựng sau bảo quản lạnh sõu là: tỷ lệ tinh trựng di động sau bảo quản phải đạt được ≥ 50% so với tỷ lệ tinh trựng di động trước bảo quản [59]. Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi trờn mẫu nhược tinh đó được lọc rửa cho thấy sau bảo quản CSF di động và CSF di động tiến tới đều giảm rất nhiều (p<0,001) và đều chưa đạt được đến 50% so với trước bảo quản.
Nghiờn cứu của chỳng tụi cũng cho thấy cú sự giảm tỷ lệ di động của tinh trựng bảo quản theo thời gian ở mẫu đó lọc rửa. Thời gian bảo quản càng dài thỡ chất lượng tinh trựng càng giảm. Chỳng tụi nhận thấy ở cả 3 khoảng
thời gian bảo quản, tỷ lệ di động của tinh trựng đều giảm đi cú ý nghĩa thống kờ. Theo kết quả nghiờn cứu của nhiều tỏc giả tiến hành trờn cỏc mẫu tinh trựng bỡnh thường: thời gian bảo quản lạnh khụng ảnh hưởng đỏng kể lờn tỷ lệ tinh trựng di động [21],[23],[69]. Trờn thế giới đó cú 2 em bộ ra đời từ tinh trựng bảo quản lạnh sõu sau 21 và 28 năm của cựng một mẫu tinh dịch [37].
Tỏc giả Nguyễn Phương Thảo Tiờn (2007) trong nghiờn cứu của mỡnh cũng cho biết tỷ lệ tinh trựng di động sau thời điểm bảo quản 1 ngày và 2 ngày là khụng cú sự khỏc biệt rừ rệt, chỉ sau khoảng thời gian bảo quản 30 ngày thỡ tỷ lệ di động của TT mới giảm đi cú ý nghĩa thống kờ so với khoảng thời gian bảo quản 1 ngày và 2 ngày [13]. Sự khỏc biệt trong kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi cú thể do chỳng tụi nghiờn cứu trờn mẫu tinh trựng chất lượng kộm, sức bền tinh trựng kộm nờn khả năng chịu lạnh của tinh trựng cũng giảm nhanh theo thời gian. Tuy nhiờn, nghiờn cứu của chỳng tụi thực hiện với số lượng mẫu ớt nờn chỳng tụi thấy cần cú những nghiờn cứu tiếp theo với cỡ mẫu lớn hơn.
So sỏnh chỉ số CSF di động và CSF di động tiến tới sau bảo quản giữa mẫu tươi và mẫu được lọc rửa bước đầu chỳng tụi nhận thấy cỏc chỉ số này ở mẫu tươi đều cao hơn mẫu lọc rửa ở cựng thời gian bảo quản, đặc biệt trờn những mẫu nhược tinh cú PR < 32%. Sự khỏc biệt này cú ý nghĩa thống kờ (xem biểu đồ 3.3 và biểu đồ 3.4). So sỏnh riờng trờn cỏc mẫu nhược tinh nhẹ (32% < PR < 50%) thỡ sự khỏc biệt này khụng cú ý nghĩa thống kờ (p>0,05). Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi phự hợp với kết quả nghiờn cứu của cỏc tỏc giả Donnelly E.T.(2001) [27], Saritha K.R. (2001) [56], Sharma R.K (1996) [58].
Ở nghiờn cứu này, chỳng tụi đưa ra mốc giỏ trị PR=32% để phõn nhúm đối tượng nghiờn cứu vỡ 32% là ngưỡng giỏ trị WHO 2010 sử dụng để phõn loại mẫu tinh dịch bỡnh thường và mẫu nhược tinh (trong khi WHO 1999 lấy giỏ trị ngưỡng là 50%).
4.3.2. Tỷ lệ sống của tinh trựng
Trong quỏ trỡnh BQL, do xảy ra hiện tượng shock lạnh nờn tỷ lệ tinh trựng sống sút sau bảo quản sẽ giảm đi. Tỷ lệ cỏc TT cú biểu hiện chết theo